唐芬芬 楊偉克 朱峰 邵榆嵐 張永紅 白興榮

摘要：【目的】探究喂食家蠶核型多角體病毒（BmNPV）后家蠶血淋巴和中腸組織抗氧化酶[超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）]的活性及其基因表達(dá)變化規(guī)律，明確BmNPV侵染對(duì)家蠶抗氧化系統(tǒng)的影響，為解析BmNPV的致病機(jī)理提供理論依據(jù)?！痉椒ā恳晕妪g家蠶為研究對(duì)象，經(jīng)口喂食BmNPV，分別于添食后6、12、18、24、30、36、42和48 h采集家蠶的血淋巴和中腸組織，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)兩種抗氧化酶基因（Bmsod和Bmcat）的表達(dá)水平，同時(shí)以抗氧化酶活性測(cè)試盒測(cè)定SOD和CAT的活性變化情況。【結(jié)果】BmNPV侵染五齡家蠶能引起典型的血液型膿病，主要表現(xiàn)為蠶體環(huán)節(jié)腫脹，狂躁爬行，體壁易破，體液呈乳白色等。家蠶血淋巴和中腸組織中Bmsod和Bmcat基因均在感染BmNPV中期開始上調(diào)表達(dá)，在感染后期呈下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，其相對(duì)表達(dá)量也呈先增加后急劇減少的變化趨勢(shì)。添食BmNPV后，家蠶血淋巴和中腸組織的SOD活性在感染18和24 h時(shí)極顯著高于對(duì)照組（添食等量滅菌水）家蠶（P<0.01，下同），但從感染30 h起SOD活性開始急劇下降，至感染48 h時(shí)降至最低值。家蠶血淋巴和中腸組織的CAT活性在感染早期（6 h）略有下降，從感染12 h起CAT活性開始呈上升趨勢(shì)，血淋巴CAT活性在感染18～30 h極顯著高于對(duì)照組，隨后急劇下降且顯著低于對(duì)照組家蠶（P<0.05，下同）;中腸組織CAT活性僅在感染18和24 h時(shí)顯著或極顯著高于對(duì)照組家蠶，從感染30 h起開始持續(xù)下降，至感染48 h時(shí)降至最低值，約為對(duì)照組家蠶的18%。【結(jié)論】BmNPV侵染能影響家蠶機(jī)體相關(guān)保護(hù)酶活性及其基因轉(zhuǎn)錄水平，SOD和CAT活性及其基因表達(dá)量在感染中期增加，感染后期則急劇降低，提示抗氧化酶SOD和CAT在家蠶的抗病毒過程中發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞： 家蠶;家蠶核型多角體病毒（BmNPV）;SOD;CAT;酶活性;基因表達(dá)

中圖分類號(hào)： S884.51? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2019）10-2308-06

Effects of BmNPV on the antioxidant enzyme gene expression and enzyme activity of Bombyx mori

TANG Fen-fen， YANG Wei-ke， ZHU Feng， SHAO Yu-lan，

ZHANG Yong-hong， BAI Xing-rong*

（Institute of Sericulture and Apiculture， Yunnan Academy of Agricultural Sciences， Mengzi， Yunnan? 661101， China）

Abstract：【Objective】In order to provide references for further study on the infection and pathogenesis of BmNPV， this study was explored change rules of the hemolymph and mesenteron antioxidant enzyme activities[superoxide dismutase（SOD）， catalase（CAT）] and the gene expression in silkworm larvae infected with Bombyx mori nuclear polyhedrovirus（BmNPV）， and the effects of BmNPV infection on B. mori antioxidant system were also analyzed. 【Method】The real-time fluorescent quantitative PCR was applied to analyze the expression of two kinds of? antioxidant enzyme genes Bmsod and Bmcat， meanwhile the activity of the SOD and CAT were determined in heamolymph and midgut of 5th instar silkworm larvae after feeding BmNPV at 6， 12， 18， 24， 30， 36， 42 and 48 h. 【Result】BmNPV infection of silkworm in the fifth instar could cause typical blood pyogenic disease， mainly manifested as swollen silkworm body parts， manic crawling， body wall easily broken， body fluid milky liquid. The Bmsod and Bmcat genes were up-regulated since the mi-ddle of BmNPV infection， and down-regulated in the end of infection， their relative expression also showed increase-sharp decrease trend. The activities of SOD in hemolymph and midgut of B. mori was extremely higher than the control group （feeding the same amount of sterilized water） at 18 and 24 h after infection with BmNPV（P<0.01， the same below）， but it started to decrease sharply at 30 h， and dropped to the lowest value at 48 h. The activities of CAT in hemolymph and midgut of silkworm decreased slightly at the early stage after infection（at 6 h）， and increased from 12 h. In hemolymph， the CAT activity was extremely higher than the control group from 18 h to 30 h after infection， but decreased sharply and was significantly lower than the control group（P<0.05， the same below）. In midgut， the CAT activity was only significantly or extremely significantly higher than the control group at 18 and 24 h after infection， and continued to decline from 30 h to the lowest value at 48 h， which was about 18% of the control group. 【Conclusion】BmNPV infection can affect the activity of related protective enzymes and its gene transcription level in silkworm.The expression levels of activities of SOD and CAT and Bmsod and Bmcat genes all increase first and then decrease sharply in the midgut and heamolymph of silkworm after infection with BmNPV. It suggests that the antioxidant enzymes SOD and CAT play an important role in the antiviral process of silkworm.

Key words： Bombyx mori; Bombyx mori nuclear polyhedrovirus（BmNPV）; SOD; CAT; enzyme activity; gene expression

0 引言

【研究意義】家蠶是一種重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲，同時(shí)是鱗翅目昆蟲的模式生物，加之遺傳背景清晰且飼育簡(jiǎn)單，已發(fā)展成為研究宿主—病原互作機(jī)制的理想材料（Geng et al.，2016a，2016b）。超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）和過氧化氫酶（Catalase，CAT）在維持生物體內(nèi)自由基代謝平衡的過程中發(fā)揮重要作用，在一定程度上能反映生物的抗逆能力（Lesser，2006;方允中和鄭榮梁，2008）。因此，研究抗氧化酶活性及其基因表達(dá)在家蠶抵抗病原微生物侵染過程中的變化規(guī)律，尤其是明確其在家蠶抵抗家蠶核型多角體病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV）時(shí)的功能和作用，可為揭示BmNPV侵染及其致病機(jī)理提供理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】BmNPV感染主要引發(fā)家蠶血液型膿病，傳染性強(qiáng)，危害嚴(yán)重，每年給桑蠶產(chǎn)業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失（邵榆嵐等，2017）。據(jù)家蠶流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，BmNPV是云南蠶區(qū)發(fā)生較廣且危害嚴(yán)重的主要病原（白興榮等，2010），生產(chǎn)上多在三齡蠶后感染發(fā)病，且一旦發(fā)病即迅速蔓延。雖然關(guān)于家蠶抵抗病毒的研究已有大量報(bào)道，但抗病機(jī)制至今尚未完全明確。昆蟲遭受外源病原菌侵染時(shí)，其機(jī)體內(nèi)正常的代謝平衡被打破，誘發(fā)活性氧（ROS）過度積累，進(jìn)而損傷宿主細(xì)胞（Kumar et al.，2003）?？寡趸窩AT和SOD在消除昆蟲體內(nèi)過量氧自由基方面發(fā)揮著重要作用，其中，CAT能催化H2O2分解為H2O和O2，減少羥自由基的產(chǎn)生，防止過量羥自由基損傷機(jī)體（Zhao and Shi，2009）;SOD能催化超氧陰離子自由基（[O2] ）發(fā)生歧化反應(yīng)，生成H2O2和O2，H2O2再經(jīng)CAT作用轉(zhuǎn)化為H2O和O2，進(jìn)而維持機(jī)體的正常生理代謝過程（Wang et al.，2001）。李世廣等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，菜青蟲感染金龜子綠僵菌后其體內(nèi)SOD和CAT活性呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，表明蟲體在侵染初期防御能力增強(qiáng)，但后期防御能力降低。張仙紅等（2006）研究證實(shí)，菜青蟲感染玫煙色擬青霉后體內(nèi)SOD和CAT活性迅速提高，隨后急劇下降并顯著低于未感染組，同時(shí)出現(xiàn)感病癥狀，說明昆蟲SOD和CAT等保護(hù)酶系統(tǒng)與病原菌對(duì)宿主的侵染存在一定關(guān)聯(lián)，但具體作用機(jī)制尚未明確。王樹昌等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，家蠶感染球孢白僵菌后其血淋巴、中腸等組織的總抗氧化活力、SOD和CAT活性均顯著降低，Bmsod和Bmcat基因表達(dá)水平顯著下調(diào)，而添加外源SOD和CAT等抗氧化劑能有效延長(zhǎng)家蠶存活時(shí)間，故推測(cè)球孢白僵菌的致病機(jī)制主要是通過破壞家蠶抗氧化系統(tǒng)平衡，損傷組織器官，降低宿主的免疫防御功能，最終導(dǎo)致蟲體發(fā)病死亡?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】家蠶抵抗BmNPV涉及的防御反應(yīng)極其復(fù)雜，BmNPV侵染不僅誘導(dǎo)家蠶中腸相關(guān)抗菌肽基因的表達(dá)，還能上調(diào)血淋巴中酚氧化酶原基因表達(dá)，進(jìn)而提高酚氧化酶活性（唐芬芬等，2015，2016）。目前，有關(guān)家蠶對(duì)BmNPV的免疫防御及免疫相關(guān)因子研究已較深入，但遭受BmNPV侵染時(shí)蠶體抗氧化酶活性及其基因表達(dá)變化規(guī)律的研究鮮見報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】以五齡家蠶為研究對(duì)象，探究添食BmNPV后家蠶血淋巴和中腸組織抗氧化酶SOD和CAT的活性及其基因表達(dá)變化規(guī)律，明確BmNPV侵染對(duì)家蠶抗氧化系統(tǒng)的影響，為解析BmNPV的致病機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

家蠶品系菁松×皓月和BmNPV均由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所家蠶病害防控研究室提供。Total RNA提取試劑盒（OMEGA公司，貨號(hào)R6834-02）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa公司，貨號(hào)RR047A）、FastStart SYBR Green Master（Roche公司，貨號(hào)04673484001）、SOD活性測(cè)試盒（貨號(hào)A001-1）和CAT活性測(cè)試盒（貨號(hào)A007-1）均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1. 2 添食處理及樣品采集

家蠶按常規(guī)方法飼養(yǎng)至五齡起蠶，取體型和體重相近的家蠶隨機(jī)分為兩組（試驗(yàn)組和對(duì)照組），試驗(yàn)組每頭家蠶經(jīng)口添食10 μL預(yù)先制備好的病毒懸液（5.35×108個(gè)/mL），對(duì)照組添食等量滅菌水，添食后在同等條件下進(jìn)行飼育。于添食后6、12、18、24、30、36、42和48 h采集家蠶的血淋巴和中腸組織，每次取樣均分成兩份，一份用于抽提RNA，另一份用于制備酶液。每次取樣設(shè)4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5頭家蠶，樣品收集后-80.0 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 3 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

按照Total RNA提取試劑盒操作說明提取各組織RNA，以紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA樣品濃度，取OD260/OD280為1.80～2.00的樣品，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1. 4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

以真核翻譯起始因子4A基因（家蠶芯片探針I(yè)D：sw22934）為內(nèi)參基因、酚氧化酶原基因Bmsod（NCBI登錄號(hào)NM_001043619.1）和Bmcat（NCBI登錄號(hào)NM_001043447.1）為靶標(biāo)基因。利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物（表1）。參照FastStart SYBR Green Master試劑盒操作說明進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，擴(kuò)增程序：95.0 ℃預(yù)變性30 s;95.0 ℃ 5 s，60.0 ℃ 30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán);65.0 ℃ 5 s（每次加0.5 ℃，直至95.0 ℃）。以CFX-96實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)儀記錄試驗(yàn)數(shù)據(jù)，根據(jù)2-△△Ct法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量（Livak and Schmittgen，2001）。

1. 5 抗氧化酶活性測(cè)定

酶液制備：取家蠶幼蟲各組織樣品，分別加入1.2 mL預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.0），在冰上進(jìn)行研磨，使樣品充分破碎，于4 ℃下2500 r/min離心15 min，收集上清液，即為待測(cè)酶液。按照SOD活性測(cè)試盒和CAT活性測(cè)試盒使用說明，分別測(cè)定SOD和CAT的活性。

1. 6 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及作圖，同時(shí)利用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 家蠶感染BmNPV后的主要臨床癥狀

BmNPV侵染五齡家蠶能引起典型的血液型膿病，從感染后第4 d起開始發(fā)病，其臨床癥狀主要表現(xiàn)為蠶體環(huán)節(jié)腫脹，狂躁爬行，體壁易破，體液呈乳白色等（圖1）。

2. 2 家蠶感染BmNPV后Bmsod和Bmcat基因的表達(dá)變化

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定添食BmNPV后家蠶血淋巴和中腸組織中Bmsod和Bmcat基因的相對(duì)表達(dá)量，將對(duì)照組家蠶目的基因的相對(duì)表達(dá)量設(shè)定為1.0，當(dāng)試驗(yàn)組家蠶目的基因的相對(duì)表達(dá)量大于1.0時(shí)，表明該基因上調(diào)表達(dá)，反之則下調(diào)表達(dá)。由圖2可看出，家蠶血淋巴Bmsod基因在感染BmNPV前期（6～12 h）的相對(duì)表達(dá)量接近于1.0，至感染18 h時(shí)開始上調(diào)表達(dá)，其相對(duì)表達(dá)量逐漸增加，于感染30 h時(shí)達(dá)最高值，隨后家蠶血淋巴Bmsod基因相對(duì)表達(dá)量急劇下降，呈下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)。在家蠶中腸組織中，Bmsod基因在感染BmNPV后12～24 h呈持續(xù)上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，且在感染24 h時(shí)達(dá)最高值，至感染后期（30～48 h）Bmsod基因呈下調(diào)表達(dá)。

由圖3可看出，在BmNPV侵染前6 h，家蠶血淋巴和中腸組織中的Bmcat基因相對(duì)表達(dá)量均無(wú)明顯變化，但從感染12 h起開始上調(diào)表達(dá)，其中，血淋巴Bmcat基因約上調(diào)1.5倍，中腸組織Bmcat基因約上調(diào)1.8倍。家蠶血淋巴Bmcat基因在感染BmNPV后12～30 h均呈上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，在感染36～48 h呈持續(xù)下調(diào)表達(dá)趨勢(shì);中腸組織Bmcat基因在感染12～24 h呈上調(diào)表達(dá)，從感染30 h起開始下調(diào)表達(dá)，至感染42和48 h其相對(duì)表達(dá)量降至最低值。

綜上所述，家蠶血淋巴和中腸組織中的Bmsod和Bmcat基因均在感染BmNPV中期開始上調(diào)表達(dá)，至感染后期則下調(diào)表達(dá)，其相對(duì)表達(dá)量也呈先增加后急劇減少的變化趨勢(shì)。

2. 3 家蠶感染BmNPV后血淋巴和中腸組織SOD活性的變化

添食BmNPV后，家蠶血淋巴和中腸組織的SOD活性變化如圖4所示。其中，家蠶血淋巴SOD活性在感染初期（6～12 h）與對(duì)照組家蠶間無(wú)顯著差異（P>0.05，下同），感染中期（18～30 h）SOD活性則顯著高于對(duì)照組家蠶（P<0.05，下同），尤其在感染18和24 h時(shí)酶活性分別是對(duì)照組家蠶的1.9和2.3倍，其差異達(dá)極顯著水平（P<0.01，下同），但感染后期（36～48 h）SOD活性顯著或極顯著低于對(duì)照組家蠶（圖4-A）;家蠶中腸組織SOD活性在感染12、18和24 h分別是對(duì)照組家蠶的2.2、2.9和3.1倍，其差異均達(dá)極顯著水平，從感染30 h起SOD活性開始急劇下降，至感染42和48 h時(shí)酶活性最低，約為對(duì)照組家蠶的30%（圖4-B）。

2. 4 家蠶感染BmNPV后血淋巴和中腸組織CAT活性的變化

家蠶感染BmNPV后6 h內(nèi)，其血淋巴和中腸組織CAT活性略有下降，從感染12 h起CAT活性開始呈上升趨勢(shì)（圖5）。其中，家蠶血淋巴CAT活性在感染中期（18～30 h）持續(xù)高于對(duì)照組家蠶，且差異達(dá)極顯著水平，至感染后期（36～48 h）則顯著低于對(duì)照組家蠶（圖5-A）;家蠶中腸組織CAT活性僅在感染18和24 h時(shí)顯著或極顯著高于對(duì)照組家蠶，從感染30 h起開始持續(xù)下降，至感染48 h降至最低值，約為對(duì)照組家蠶的18%，其差異達(dá)極顯著水平（圖5-B）。

3 討論

當(dāng)昆蟲遭受外源病原微生物侵染時(shí)，一方面其先天性免疫防御通路被激活，產(chǎn)生抗菌物質(zhì)或其他免疫活性因子，以保護(hù)機(jī)體免受傷害（Xia et al.，2017）;另一方面，蟲體正常生理代謝過程被擾亂，活性氧平衡系統(tǒng)被破壞，自由基濃度升高，而機(jī)體保護(hù)酶SOD和CAT在消除過量氧自由基方面發(fā)揮重要作用（Kumar et al.，2003）。已有研究表明，高溫或低溫脅迫均會(huì)引起家蠶、柞蠶及琥珀蠶的血淋巴SOD和CAT活性在一定時(shí)間范圍內(nèi)出現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)（夏潤(rùn)璽等，2009;袁燕萍等，2010;楊偉克等，2017）。此外，在真菌侵染早期，昆蟲體內(nèi)的SOD和CAT活性呈上升趨勢(shì)，即自身防御能力增強(qiáng);而在侵染后期，抗氧化能力急劇減弱并出現(xiàn)明顯的感病癥狀（張仙紅等，2006;李世廣等，2016;王樹昌等，2017）。

本研究結(jié)果顯示，家蠶中腸組織Bmsod和Bmcat基因的表達(dá)及SOD和CAT活性從感染BmNPV后12 h開始增加，而在血淋巴中Bmsod和Bmcat基因表達(dá)及SOD和CAT活性的增加相對(duì)滯后。中腸是家蠶阻止外源病原微生物及其他毒素等物質(zhì)侵入的第一道屏障，而血淋巴處于一個(gè)相對(duì)封閉的循環(huán)流動(dòng)狀態(tài)，貫穿于整個(gè)蠶體，其中含有許多免疫活性物質(zhì)和抗氧化酶類，以維持機(jī)體正常的生理代謝（馮麗春和沈衛(wèi)德，2015）。經(jīng)口感染BmNPV，病毒首先攻擊家蠶的中腸，破壞其抗氧化防御系統(tǒng)的平衡，進(jìn)而侵染血淋巴系統(tǒng)，誘發(fā)抗氧化反應(yīng)應(yīng)答，即家蠶中腸的抗氧化響應(yīng)略早于血淋巴。

添食BmNPV后，家蠶血淋巴和中腸組織的Bmcat和Bmsod基因表達(dá)均在感染中期上調(diào)表達(dá)、感染后期下調(diào)表達(dá)，SOD和CAT活性也呈先增加后急劇降低的變化趨勢(shì)，與BmNPV侵染家蠶的生理進(jìn)程一致，說明在病毒感染早期，病毒粒子相對(duì)較少，不足以打破家蠶抗氧化系統(tǒng)的平衡，抗氧化酶活性仍維持在正常水平;隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，病毒不斷增殖，機(jī)體抗氧化系統(tǒng)開始受損，此時(shí)抗氧化酶相關(guān)基因被誘導(dǎo)表達(dá)，SOD和CAT活性迅速增強(qiáng)以消除活性氧自由基;至病毒感染后期，病毒已大量增殖，產(chǎn)生的毒素等突破蠶體免疫防線，其抗氧化系統(tǒng)嚴(yán)重紊亂，Bmcat和Bmsod基因及其酶活性急劇下降，最終呈現(xiàn)發(fā)病癥狀甚至死亡。

4 結(jié)論

BmNPV侵染能影響家蠶機(jī)體相關(guān)保護(hù)酶活性及其基因轉(zhuǎn)錄水平，SOD和CAT活性及其基因表達(dá)量在感染中期增加，感染后期則急劇降低，提示抗氧化酶SOD和CAT在家蠶抗病毒過程中發(fā)揮重要作用。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）