摘要：【目的】探究矮火絨草（Leontopodium nanum）內(nèi)生細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)多樣性及其生物學(xué)功能，為開發(fā)相應(yīng)功能的生物菌劑提供參考，并為青藏高原生態(tài)農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)提供有價(jià)值的內(nèi)生細(xì)菌資源?！痉椒ā坎捎媒M織分離法對(duì)矮火絨草植株內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分離純化，基于16S rDNA序列分析確定分離菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位;通過平板對(duì)峙法檢測(cè)分離菌株拮抗病原真菌活性;檢測(cè)分離菌株的產(chǎn)吲哚乙酸（IAA）、溶磷和固氮能力;測(cè)定分離菌株除草活性、低溫適生性及促種子萌發(fā)特性?！窘Y(jié)果】從矮火絨草植株根、莖、葉和種子部位共分離獲得52株內(nèi)生細(xì)菌，基于16S rDNA序列分析發(fā)現(xiàn)52株菌株可歸屬于4門7綱10目14科18屬。其中假單胞菌屬細(xì)菌為根部?jī)?yōu)勢(shì)屬，約占根部細(xì)菌總數(shù)的52.17%;莖中以芽孢桿菌為優(yōu)勢(shì)屬，約占莖部細(xì)菌總數(shù)的41.18%;各部位的內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量分布表現(xiàn)為根>莖>種子>葉。在52株內(nèi)生細(xì)菌中，11株有拮抗病原真菌能力、9株具有產(chǎn)IAA能力、7株有溶磷活性、7株具有固氮活性、20株具有除草活性、13株具有耐低溫能力和8株具有促生作用;從植株部位分布來看，7種類型的功能菌在根、莖和種子部位均有分布，拮抗菌和除草菌在根部所占的比例較高，溶磷菌株在各植株部位所占比例均較低;在葉中未分離到拮抗菌、產(chǎn)IAA菌、固氮菌和促生菌。各功能菌株分布在17個(gè)屬，多樣性較高，其中假單胞菌屬和芽孢桿菌屬中含有多種功能菌株，在植株4個(gè)部位所占比例也較高?！窘Y(jié)論】矮火絨草植株不同部位內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量分布具有差異性，但均可分離到不同類型的功能菌株，功能菌株涵蓋17個(gè)屬，其中以假單胞菌屬和芽孢桿菌屬居多。

關(guān)鍵詞： 矮火絨草;內(nèi)生細(xì)菌;多樣性;生物學(xué)功能;青藏高原

中圖分類號(hào)： S182;Q938? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2019）10-2222-12

Diversity and biological function of endophytic bacteria in Leontopodium nanum of Qinghai-Tibetan Plateau

CHENG Liang1，2

（1Institute of Plant Protection， Qinghai Academy of Agriculture and Forestry Science， Xining? 810016， China;

2Key Laboratory of Agricultural Integrated Pest Management of Qinghai Province， Xining? 810016， China）

Abstract：【Objective】The diversity and function of endophytic bacteria of Leontopodium nanum were explored to provide reference for developing biological bacterium agent with related functions and to provide valuable endophytic bacteria resources for ecological agriculture and animal husbandry production in Qinghai-Tibet Plateau. 【Method】The endophytic bacteria of L. nanum were isolated and purified by tissue isolation method. The phylogenetic status of the isolated strains was preliminarily determined based on 16S rDNA sequence analysis. The antagonistic activity of the strains against pathogenic fungi was detected by plate confrontation method. The indoleacetic acid（IAA） secretion， phosphate solubilization and nitrogen fixation abilities of the strains were tested. The herbicidal activity， low temperature suitability and seed germination characteristics were also determined. 【Result】Results showed that 52 endophytic bacteria that belonged to 28 genera， 14 families， 10 orders， 7 classes， 4 phyla were isolated from the root， stem leaf， and seed of L. nanum based on their 16S rDNA sequences. 52.17% isolates were identified as Pseudomonas， which was the most dominant genus in the roots of L. nanum. Bacillus was the most dominant genera in the stems of L. nanum， which accounted for 41.18% of the total. The quantitative distribution of endophytic bacteria in different parts of L. nanum was root>stem>seed>leaf. Furthermore， out of 52 isolates， 11 strains confirmed to have antifungal activity， 10 strains showed IAA-producing activity， 7 strains turned out to have phosphate-solubilizing activity，7 strains were proved to be azotobacter， 20 strains showed herbicidal activity， 13 strains showed low temperature tolerance and 8 strains exhibited growth-promoting effects. Seven types of functional endophytic bacteria were found in the root， stem， leaf and seed of L. nanum. Isolates with antagonistic and herbicidal activity had a relatively large proportion in the roots of L. nanum. The proportion of strains with phosphate-solubilizing activity in all plant parts was relatively small. Isolates with antagonistic， IAA-producing， nitrogen-fixing and growth-promoting activity were not discovered in the leaves of L. nanum. The functional endophytic bacteria were distribu-ted in 17 different genera and had high population diversity. The isolates from Pseudomonas and Bacillus were multi-functional strains with a high proportion in the four parts of seedlings. 【Conclusion】The number and distribution of endophytic bacteria in different parts of L. nanum plant are different， but can be isolated into different functional types. The functional strains consist of 17 genera， of which Pseudomonas and Bacillus are dominant genus.

Key words： Leontopodium nanum; endophytic bacteria; diversity; biological function; Qinghai-Tibetan Plateau

0 引言

【研究意義】自然界中幾乎所有的植物都能與多種微生物形成互利共生或內(nèi)寄生關(guān)系（Hardoim et al.，2015）。一直以來，植物—內(nèi)生細(xì)菌共生體因其在生態(tài)環(huán)境中生長(zhǎng)的優(yōu)越性而備受關(guān)注（Vorholt，2012），在長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化過程中內(nèi)生細(xì)菌與宿主植物相互作用以維持互惠共生關(guān)系（White and Torres，2010）。宿主植物為內(nèi)生細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和相對(duì)穩(wěn)定的生存環(huán)境，而內(nèi)生細(xì)菌通過調(diào)節(jié)和修飾宿主植物形態(tài)學(xué)、生理學(xué)及生物化學(xué)等特征，提高宿主植物在生物與非生物脅迫下的適應(yīng)性，維持共生關(guān)系的穩(wěn)定性（Chanway，1998）。因此，開展分離篩選植物內(nèi)生細(xì)菌研究，可為今后開發(fā)功能抗病、除草、解磷、固氮及促生等多功能微生物菌劑提供菌種資源和篩選依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來，有關(guān)植物內(nèi)生細(xì)菌的研究主要集中在植物內(nèi)生細(xì)菌基礎(chǔ)生物學(xué)特性及其功能活性等方面。植物內(nèi)生細(xì)菌的分布具有普遍性和多樣性，在各種農(nóng)作物及藥用植物中均有存在，人們已從水稻、油菜、杜仲、黃芪和甘蔗等植物的苗期、成株期的根、莖和葉等部位分離到內(nèi)生細(xì)菌（Sun et al.，2008;劉蓬蓬等，2018;王梅菊等，2018;陳小潔等，2019;劉魯峰等，2019）。目前研究發(fā)現(xiàn)植物內(nèi)生細(xì)菌的種類已超過129種，分屬于54個(gè)屬，主要集中在假單胞菌屬（Pseudomonas）、腸桿菌屬（Enterobacter）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、土壤桿菌屬（Agrobacterium）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、泛菌屬（Pantoea）和甲基桿菌屬（Methylobacterium）等（Bulgarelli et al.，2013）。李曉璐等（2015）從水黃皮內(nèi)生細(xì)菌中篩選出的蠟樣芽孢桿菌對(duì)水稻害蟲稻飛虱和稻縱卷葉螟有明顯的毒殺作用，致死率在85%以上。陳超瓊（2017）從西北荒漠地區(qū)采集的駱駝刺植物組織中分離獲得的內(nèi)生細(xì)菌LTYR-11Z不僅能促進(jìn)小麥生長(zhǎng)，還能提高小麥對(duì)干旱脅迫的抵抗能力。柳志強(qiáng)等（2017）從催吐蘿芙木分離獲得的內(nèi)生枯草芽孢桿菌LYM3具有廣譜抗菌性，其產(chǎn)生的抑菌活性產(chǎn)物主要為脂肽類物質(zhì)。陸藍(lán)翔等（2018）采用組織勻漿法從健康樟樹組織中分離內(nèi)生細(xì)菌，發(fā)現(xiàn)2株菌對(duì)扦插苗株高有較好的促生效果。趙玉華等（2018）從樟樹周皮組織中分離獲得的內(nèi)生枯草芽孢桿菌EBS05對(duì)番茄植株具有明顯的促生作用，對(duì)番茄抗番茄黃化曲葉病毒（TYLCV）具有誘導(dǎo)作用。Caulier等（2018）從馬鈴薯植株體內(nèi)分離獲得的Bacillus subtilis 30B-B6菌株對(duì)馬鈴薯晚疫病有很好的防治效果?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】矮火絨草（Leontopo-dium nanum）為菊科火絨草屬多年生草本植物，是高寒草地牧區(qū)的優(yōu)勢(shì)牧草之一，是一種土壤趨于干旱出現(xiàn)的指示性物種，在我國(guó)主要集中在西北部及西南部地區(qū)，分布于高山或亞高山帶，不僅抗逆性強(qiáng)、耐寒、喜濕，還能為家畜提供優(yōu)質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有阻礙高寒生態(tài)群落旱生化和鹽生化發(fā)展的作用（牟曉明等，2015）。目前報(bào)道的內(nèi)生細(xì)菌主要來源于經(jīng)濟(jì)作物，對(duì)長(zhǎng)期生活在高海拔、寒冷氣候條件下不受人為活動(dòng)干擾的植物內(nèi)生細(xì)菌的研究相對(duì)較少，而針對(duì)矮火絨草內(nèi)生細(xì)菌的研究尚無文獻(xiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以矮火絨草的根、莖、葉和種子為試材，采用組織分離法分離其內(nèi)生細(xì)菌，結(jié)合分子標(biāo)記對(duì)分離的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行鑒定并進(jìn)行生物學(xué)功能測(cè)定，以期篩選出具有應(yīng)用潛力的益生微生物，為開發(fā)相應(yīng)功能的生物菌劑提供參考，并為青藏高原生態(tài)農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)提供有價(jià)值的內(nèi)生細(xì)菌資源。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

1. 1. 1 植物材料 2016年6—9月從青海省祁連山東段的門源縣珠固鄉(xiāng)高寒草地采集矮火絨草的根、莖、葉和種子，混合均勻后裝入無菌封口塑料袋，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 1. 2 培養(yǎng)基 肉汁培養(yǎng)基（NA）：牛肉膏3.00 g，蛋白胨5.00 g，NaCl 5.00 g，瓊脂18.00 g，蒸餾水1000 mL，pH 6.8～7.0;馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200.00 g，葡萄糖20.00 g，瓊脂18.00 g，蒸餾水1000 mL，自然pH;King氏液體培養(yǎng)基：蛋白胨20.00 g，K2HPO4 1.15 g，MgSO4·7H2O 1.50 g，丙三醇15 mL，L-色氨酸0.10 g（或不加色氨酸）;Pikovaskaia培養(yǎng)基（PKO）：葡萄糖10.00 g，磷酸鈣5.00 g，（NH4）2SO4 0.50 g，NaCl 0.20 g，KCl 0.20 g，MgSO4 0.03 g，MnSO4 0.03 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，蒸餾水1000 mL，pH 6.8～7.0;蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基：MnSO4·4H2O 0.03 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，CaCO3 5.00 g，葡萄糖10.00 g，（NH4）2SO4 0.50 g，卵磷脂0.20 g，NaCl 0.30 g，KCl 0.30 g，酵母膏0.40 g，瓊脂20.00 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.0～7.5;改良阿氏無氮培養(yǎng)基（Ashby）：葡萄糖10.00 g，K2HPO4 0.20 g，K2SO4 0.20 g，MgSO4·7H2O 0.20 g，NaCl 0.20 g，CaCO3 5.00 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.0～7.2。低溫篩選培養(yǎng)基：5×1C培養(yǎng)基（胰蛋白胨21.00 g、NaCl 15.00 g、大豆粉9.00 g、蒸餾水600 mL）200 mL，土壤提取液（土壤500.00 g、蒸餾水1000 mL，98 ℃煮45 min，濾紙濾出土壤液，過濾滅菌后保藏）100 mL，20%葡萄糖5 mL，加滅菌水至1000 mL。

1. 1. 3 指示菌 馬鈴薯晚疫病菌[Phytophthora infestans（Mont.）de Bary]和櫻桃褐斑病菌（Mycosphaerella cerasella Aderh.）。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 內(nèi)生細(xì)菌分離純化 采用梯度稀釋法對(duì)內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分離純化。清水沖洗矮火絨草材料的根、莖、葉和種子，濾紙吸干表面水分;分別稱取根、莖、葉和種子部位3～5 g，于超凈工作臺(tái)內(nèi)用75%酒精（45 s）、3%次氯酸鈉（3～5 min）依次對(duì)材料表面進(jìn)行消毒，然后用無菌水洗滌3～5次，將樣品在滅菌研缽中加適量無菌生理鹽水研磨至勻漿狀，取1.0 mL浸出液按10倍濃度梯度稀釋后，吸取0.1 mL涂布于NA培養(yǎng)基上，最后一次洗滌水為空白對(duì)照。25 ℃恒溫培養(yǎng)3～5 d，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色、大小、邊緣整齊度及表面形態(tài)等分類，純化編號(hào)后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 2 內(nèi)生細(xì)菌屬種分子鑒定 菌株基因組DNA提取按照試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]使用說明進(jìn)行操作。以提取的內(nèi)生細(xì)菌基因組DNA為模板，應(yīng)用細(xì)菌16S rRNA序列通用引物27f（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492r（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系25.0 μL：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，DNA模板（50 ng/L）1.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，雙蒸水10.5 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，進(jìn)行40個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用Chromas進(jìn)行序列修正后，在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST檢索，選取若干較高相似性的序列，用ClustalX 1.8進(jìn)行多重序列比對(duì)，最后用MEGA 6.0的Neighbor-Joining構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，各分支的置信度自舉檢測(cè)（Bootstrap）1000次。

1. 2. 3 內(nèi)生細(xì)菌生物學(xué)功能測(cè)定 分泌吲哚乙酸（IAA）能力測(cè)定參考東秀珠和蔡妙英（2001）的方法，定性測(cè)定采用Salkowski比色法，定量測(cè)定采用純3-IAA標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算內(nèi)生細(xì)菌菌株的IAA分泌量。溶磷能力測(cè)定參考陸瑞霞等（2012）的方法，定性測(cè)定采用溶磷圈法，根據(jù)溶磷圈直徑/菌落直徑（D/d值）確定溶磷能力;采用鉬銻抗比色法定量測(cè)定有效磷增量。固氮能力測(cè)定參考Piromyou等（2011）的方法，采用乙炔還原法測(cè)定固氮酶活性大小。抑菌能力測(cè)定參考崔月貞等（2016）的方法，采用平板對(duì)峙法測(cè)定抑菌效果，計(jì)算抑菌率。

除草活性測(cè)定參考王偉等（2019）采用培養(yǎng)皿分析法。供試雜草分別為野燕麥和野油菜種子。選擇飽滿完整的雜草種子，用10 g/L次氯酸鈉溶液進(jìn)行表面消毒，無菌水沖洗3次，在12孔板的孔上鋪圓濾紙片，加入待測(cè)發(fā)酵濾液1.0 mL，每孔置10粒種子進(jìn)行除草活性測(cè)定。每處理重復(fù)3次，另設(shè)清水作空白對(duì)照，28 ℃智能光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，處理3～5 d后測(cè)定胚芽（根）長(zhǎng)，計(jì)算胚芽（根）抑制率。

低溫適生特性檢測(cè)參考謝永麗等（2014）的方法。將待測(cè)菌株接種到5×1C培養(yǎng)液中，過夜培養(yǎng)后取10.0 μL點(diǎn)到5×1C培養(yǎng)基上，置于0、4、10、14、18、30和45 ℃下，每天觀察生長(zhǎng)情況，7 d后記錄生長(zhǎng)結(jié)果。

促生特性測(cè)定采用玉米種子。將內(nèi)生菌株接種到NA液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，通過測(cè)定OD600及涂平板計(jì)數(shù)法測(cè)定菌體濃度，取107 CFU/mL菌懸液和0.9%滅菌生理鹽水配制成混合液（1∶3）。植物種子表面消毒后用懸浮混合液浸種2 h后取出種子，將種子鋪在有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中，30 ℃暗培養(yǎng)，3 d后觀察萌發(fā)種子數(shù)，7 d后測(cè)量種子根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)和鮮重。每處理重復(fù)3次。以清水和0.9%滅菌生理鹽水處理為對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2. 1 內(nèi)生細(xì)菌在矮火絨草植株不同部位的種群分布

由表1可知，從矮火絨草植株的根、莖、葉和種子部位共分離到52株內(nèi)生細(xì)菌，覆蓋4個(gè)菌門，分別為變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinomycetes）和擬桿菌門（Bacteroides）。在門水平上，各植株部位中變形菌門和厚壁菌門細(xì)菌所占比例較高，分別為57.69%和23.08%，擬桿菌門最少，占7.69%。其中，在根部以變形菌門細(xì)菌所占比例最高，占根部細(xì)菌總數(shù)的78.26%;莖中以厚壁菌門細(xì)菌所占比例最高，占莖部細(xì)菌總數(shù)的41.18%;葉中所含4個(gè)菌門的比例均較低。

從屬的水平上看，共分離出18個(gè)屬的細(xì)菌，各植株部位細(xì)菌屬的數(shù)量在3～12個(gè)。其中，根部最多，達(dá)12個(gè)屬;種子次之，為8個(gè)屬;葉中最少，僅有3個(gè)屬。假單胞菌屬（Pseudomonas）細(xì)菌在各植株部位所占比例均較高，是根部所占比例最高的屬，為52.17%。莖中所占比例最高的為芽孢桿菌屬（Bacillus）細(xì)菌，其次為假單胞菌屬細(xì)菌，兩屬的細(xì)菌所占比例分別為41.18%和23.53%。各植株部位的共有屬較少，僅假單胞菌屬為各植株部位的共有屬?？傮w上來看，矮火絨草植株的內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量分布表現(xiàn)為組織差異性，即根>莖>種子>葉。

2. 2 矮火絨草內(nèi)生細(xì)菌的類群與系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果

通過與NCBI數(shù)據(jù)庫比對(duì)，分析52株內(nèi)生細(xì)菌的16S rDNA序列同源性，結(jié)果（表2和圖1-A）表明，矮火絨草植株中的內(nèi)生細(xì)菌共覆蓋7綱10目14科18屬，其中22株細(xì)菌屬于γ-變形菌綱（γ-proteobacteria），為第一優(yōu)勢(shì)類群細(xì)菌，占分離菌株的42.31%;12株屬于芽孢桿菌綱（Bacilli），為第二優(yōu)勢(shì)類群細(xì)菌，占分離菌株的23.08%;此外，分離到6株放線菌綱（Actinobacteria）、5株α-變形菌綱（α-proteobacteria）、3株β-變形菌綱（β-proteobacteria）、2株鞘脂桿菌綱（Sphingobacteriia）和2株黃桿菌綱（Flavobacteriia）類群細(xì)菌，分別占分離菌株的11.54%、9.62%、5.77%、3.85%和3.85%。在目的水平上，假單胞菌目（Pseudomona-dales）為優(yōu)勢(shì)菌群，占總菌株數(shù)的36.54%，其次為芽孢桿菌目（Bacillales）和微球菌目（Micrococales），分別占總菌株數(shù)的23.08%和11.54%;在科的水平上，假單胞菌科（Pseudomonadaceae）為優(yōu)勢(shì)菌群，占總菌株數(shù)的34.62%，其次為芽孢桿菌科（Bacillaceae），占總菌株數(shù)的19.23%。

對(duì)γ-變形菌綱細(xì)菌進(jìn)一步分析表明，該綱共分為4個(gè)屬，分別是假單胞菌屬、拉恩氏菌屬（Rahnella）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）和不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter），以假單胞菌屬為主，約占分離菌株的34.62%，為優(yōu)勢(shì)種群，其余3個(gè)屬的類群相對(duì)較少，合計(jì)占分離菌株的7.69%;芽孢桿菌綱細(xì)菌分為2個(gè)屬，分別是芽孢桿菌屬和類芽孢桿菌屬（Paenibacillus），其中10株來自芽孢桿菌屬，占分離菌株的19.23%;放線菌綱細(xì)菌分為3個(gè)屬，分別為節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）、微桿菌屬（Microbacteriaceae）和棒形桿菌屬（Clavibacter）;α-變形菌綱細(xì)菌分為5個(gè)屬，分別為根瘤菌屬（Rhizobium）、鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）、微枝形桿菌屬（Microvirga）、葉桿菌屬（Phyllobacterium）和短波單胞菌屬（Brevundimonas）;β-變形菌綱細(xì)菌分為2個(gè)屬，分別為代爾夫特菌屬（Delftia）和伯克氏菌屬（Burkholderia）;鞘脂桿菌綱和黃桿菌綱細(xì)菌各有1個(gè)屬，分別為土地桿菌屬（Pedobacter）和黃桿菌屬（Flavobacterium）（表2和圖1-B）。

利用MEGA 6.0采用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果（圖2）表明，矮火絨草內(nèi)生細(xì)菌主要有4個(gè)進(jìn)化分支，屬于18個(gè)不同的屬，其中假單胞菌屬和芽孢桿菌屬占分離菌株的53.85%。在γ-變形菌綱中，18株細(xì)菌（KBL1、KBL29、KBL5、KBL17、KBL15、KBL47、KBL2、KBL19、KBL43、KBL8、KBL22、KBL24、KBL25、KBL16、KBL28、KBL33、KBL30和KBL42）聚類于Pseudomonas屬分支單元，屬于同一屬，但局部又分為7個(gè)種分類單元。其中菌株KBL1、KBL29和KBL5同源性較高，可能屬于同一種。菌株KBL25、KBL16、KBL28和KBL33與Pseudomonas fluorescens相似性較高，均為99%，可能為同一種。菌株KBL23和KBL4分別歸屬于Acinetobacter和Rahnella;菌株KBL35和KBL18歸屬于Klebsiella。

分離得到的10株（KBL49、KBL37、KBL51、KBL52、KBL27、KBL3、KBL46、KBL40、KBL50和KBL39）芽孢桿菌綱聚類單元中，菌株KBL49和KBL37歸屬于Bacillus pumilus;菌株KBL51、KBL52、KBL3、KBL46、KBL40、KBL39、KBL50和KBL27與Bacillus subtilis的相似性為100%，歸為同一種。菌株KBL10和KBL45與Paenibacillus prosopidis為同一屬。

在放線菌綱中，菌株KBL12、KBL9和KBL44歸屬于Arthrobacter;菌株KBL11和KBL38歸屬于Microbacterium;菌株KBL31則聚類于Clavibacter。在β-變形菌綱中，菌株KBL32應(yīng)為Burkholderia;菌株KBL7和KBL21歸屬于Delftia。在α-變形菌綱中，菌株KBL13、KBL36、KBL26、KBL34和KBL41分別歸屬于Sphingomonas、Brevundimonas、Microvirga、Phyllobacterium和Rhizobium。此外，在擬桿菌門中，菌株KBL6和KBL20歸屬于Flavobacterium;而KBL48和KBL14屬于Pedobacter。

2. 3 矮火絨草植株內(nèi)生細(xì)菌功能鑒定結(jié)果

分離獲得的52株內(nèi)生細(xì)菌中，共鑒定出除草活性菌株20株、分泌IAA的菌株9株、固氮菌7株、溶磷菌7株、耐低溫菌13株、拮抗菌11株和促生菌8株。52株內(nèi)生細(xì)菌中，除草活性菌株數(shù)量占總菌株數(shù)量的比例最高（38.46%），在各植株部位的功能菌中數(shù)量也最多。根中產(chǎn)拮抗和除草菌株數(shù)量較多，均占總分離菌株數(shù)的15.38%，其次是產(chǎn)IAA菌。在葉片中未分離到拮抗菌、產(chǎn)IAA菌、固氮菌和促生菌，僅分離到1株溶磷菌、1株除草活性菌和3株耐低溫菌。根、莖和種子中均可分離到可培養(yǎng)的功能菌株（圖3）。

2. 4 矮火絨草內(nèi)生細(xì)菌中多功能菌屬的多樣性分析結(jié)果

由表4可知，內(nèi)生細(xì)菌中的功能菌分布在17個(gè)不同的菌屬，從本研究測(cè)定的7種功能屬性菌的角度來看，20株除草菌株分別在11個(gè)菌屬內(nèi)有分布，13株耐低溫菌分布在10個(gè)菌屬內(nèi)，11株拮抗菌分布在6個(gè)菌屬內(nèi)，8株促生菌分布在6個(gè)菌屬內(nèi)，7株溶磷菌分布在5個(gè)菌屬內(nèi)，9株產(chǎn)IAA菌分布在4個(gè)菌屬內(nèi)。假單胞菌屬包括了除草活性菌、耐低溫菌、拮抗菌、產(chǎn)IAA菌、促生菌、溶磷菌和固氮菌，是唯一覆蓋各功能菌的菌屬;其次為芽孢桿菌屬，包括了除溶磷菌和促生菌之外的其他5種功能菌;節(jié)桿菌屬包括了除拮抗菌和產(chǎn)IAA菌外的5種功能菌;克雷伯氏菌屬包括了拮抗菌、產(chǎn)IAA菌、除草菌和耐低溫菌;微桿菌屬則包括溶磷菌、除草菌、拮抗菌和耐低溫菌;黃桿菌屬和類芽孢桿菌屬均包括除草菌、耐低溫菌和促生菌3種功能菌。

2. 5 矮火絨草內(nèi)生細(xì)菌中有潛在應(yīng)用價(jià)值的功能菌分析結(jié)果

對(duì)矮火絨草內(nèi)生細(xì)菌的生物學(xué)功能測(cè)定結(jié)果顯示，菌株拮抗能力的抑菌率為60.14%～95.47%，抑菌率最強(qiáng)的為菌株KBL17，分離自矮火絨草的根組織，屬于假單胞菌屬;菌株分泌IAA的能力為5.32～35.98 μg/mL，分泌IAA能力最強(qiáng)的為菌株KBL30，分離自矮火絨草的莖部組織，屬于假單胞菌屬;溶磷菌的溶磷能力為73.99～156.81 μg/mL，7株溶磷菌中有3株菌的溶磷能力大于100.00 μg/mL，其中溶磷能力最強(qiáng)的為菌株KBL12（節(jié)桿菌屬），分離自根部組織，其次為菌株KBL19（假單胞菌屬），也分離自根部組織;分離出的7株固氮菌中，固氮酶的活性介于98.57～369.29 nmol C2H4/（mL·h），菌株KBL16的固氮酶活性最大，分離自根部組織，屬于假單胞菌屬;來自種子組織的除草菌株數(shù)量相對(duì)較多，且有1株菌株（KBL3，芽孢桿菌屬）對(duì)野燕麥和野油菜的除草活性大于>95.00%，有2株菌株（KBL15，假單胞菌屬;KBL18，克雷伯氏菌屬）的除草活性介于90.00%～95.00%;分離自葉部的菌株KBL10在4 ℃下培養(yǎng)12 h可顯現(xiàn)出明顯的菌苔，屬于類芽孢桿菌屬;在4個(gè)植株部位中只分離到8株促生菌，效果較好的為分離自種子組織的菌株KBL20（黃桿菌屬）和KBL33（假單胞菌屬）（表5）。在同時(shí)具備拮抗病原真菌和分泌IAA功能的菌株中，菌株KBL37的抑菌率達(dá)90.16%，分泌IAA的能力為27.98 μg/mL，該菌經(jīng)16S rDNA序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與GenBank中1株具有抗真菌能力的菌株（芽孢桿菌屬）相似性達(dá)99%。

3 討論

3. 1 矮火絨草內(nèi)生細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)多樣性

本研究分離到的52株內(nèi)生細(xì)菌涵蓋了4個(gè)菌門，分別為變形菌門、厚壁菌門、放線菌門和擬桿菌門，與Bulgarelli等（2013）、胥婷等（2015）報(bào)道的植物體內(nèi)生細(xì)菌的種群結(jié)構(gòu)一致。在分離得到的52株內(nèi)生細(xì)菌中，變形菌門細(xì)菌占總分離菌株數(shù)的一半以上（57.69%）。有研究發(fā)現(xiàn)，水稻（Sun et al.，2008）、擬南芥（Bodenhausen et al.，2013）、互米花（李虎等，2014）、東南景天（鄧平香等，2017）、巨菌草（林標(biāo)聲等，2018）等優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌門也均為變形菌門，說明變形菌門細(xì)菌廣泛存在于植物體內(nèi)。厚壁菌門細(xì)菌在促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)吸收、抗逆能力和生理生態(tài)過程等方面也扮演著重要角色（Vendan et al.，2010;Kumar et al.，2012）。本研究結(jié)果顯示，矮火絨草植株內(nèi)生細(xì)菌群體中也含有較豐富的厚壁菌門細(xì)菌，其中包括芽孢桿菌屬和類芽孢桿菌屬，可能與該屬細(xì)菌內(nèi)芽孢具有較強(qiáng)的抗逆能力有關(guān)，提示矮火絨草植株內(nèi)生細(xì)菌中該屬細(xì)菌值得進(jìn)一步研究。

植物內(nèi)生細(xì)菌具有豐富的多樣性，并普遍存在于各種植物體內(nèi)。其中，假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、土地桿菌屬和腸桿菌屬為植物內(nèi)生細(xì)菌的常見屬和優(yōu)勢(shì)種群（Sturz et al.，2000）。本研究利用16S rDNA序列分析方法從矮火絨草根、莖、葉和種子4個(gè)不同組織共分離獲得52株內(nèi)生細(xì)菌，覆蓋4門7綱10目14科18屬，說明該植物內(nèi)生細(xì)菌群體具有豐富的種群多樣性和遺傳多樣性。其中假單胞菌屬18株，占分離總菌株數(shù)的比例最高。此外，假單胞菌屬內(nèi)生細(xì)菌在植物根、莖、葉和種子中均有分布，且比例均很高，在根和莖中達(dá)50.00%以上。因此，假單胞菌是分布較廣的植物內(nèi)生細(xì)菌之一。與本研究結(jié)論相似，牧草（楊成德等，2016）、鹽角草（趙帥等，2016）、線葉嵩草（魏立娟等，2018）和三葉鬼針草（胡澤瑞等，2019）等植物內(nèi)生細(xì)菌群體優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬也均為假單胞菌屬，說明假單胞菌屬細(xì)菌廣泛存在于植物體內(nèi)，可能與該屬細(xì)菌多種功能活性有關(guān)。本研究?jī)H利用16S rDNA序列分析對(duì)矮火絨草內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分類，今后還需利用生理生化試驗(yàn)、（G+C）%及持家基因（gyrB）等進(jìn)一步鑒定到種。

3. 2 矮火絨草內(nèi)生細(xì)菌生物學(xué)功能多樣性

近年來，隨著微生物分離和鑒定技術(shù)的發(fā)展，被分離和鑒定出的植物功能內(nèi)生細(xì)菌種類和數(shù)量逐年增加，發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、腸桿菌屬、固氮螺菌屬、節(jié)桿菌屬、沙雷氏菌屬、克雷伯氏菌屬、伯克霍爾德氏菌屬和不動(dòng)桿菌屬等主要種屬均具有不同的生物學(xué)功能。本研究對(duì)分離獲得的52株內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行7項(xiàng)功能測(cè)定，結(jié)果表明，菌株分泌IAA的能力為5.32～35.98 μg/mL，其中產(chǎn)量最高的菌株KBL30（Pseudomonas sp. TMB3-1-1）與1株從土壤中分離的變形菌門、γ-變形菌綱、假單胞菌目、假單胞菌科的假單胞菌屬細(xì)菌相似度達(dá)99%，其次為菌株KBL37，屬于芽孢桿菌屬。有研究證實(shí)，植物內(nèi)生細(xì)菌如克雷伯氏菌屬的某些細(xì)菌具有較強(qiáng)的IAA分泌能力，具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)的能力（呂澤勛和宋未，1999;Ji et al.，2014），但本研究分離自矮火絨草種子的菌株KBL18（克雷伯氏菌屬）的除草抑制率為94.78%，說明該屬細(xì)菌也具有除草功能，為開發(fā)藥肥兼用的微生物產(chǎn)品提供了菌株資源。此外，植物內(nèi)生細(xì)菌如沙雷氏菌屬、假單胞菌屬和腸桿菌屬等種屬的某些細(xì)菌具有溶磷和促生能力（Hameeda et al.，2008）。陸瑞霞等（2012）從地八角根際分離具有溶磷能力的菌株，通過溶磷圈法篩選出7株溶磷能力較強(qiáng)的菌株。本研究在分離獲得的52株內(nèi)生細(xì)菌中有7株可在有（無）機(jī)磷選擇性培養(yǎng)基上形成透明的溶磷圈，其中2株內(nèi)生細(xì)菌（KBL12和KBL19）的溶磷活性最強(qiáng)，分別為156.81和135.87 μg/mL。

除了營(yíng)養(yǎng)促生功能，植物內(nèi)生細(xì)菌也是植物病害和雜草生物防治的資源菌來源，從植物體內(nèi)分離篩選具有防病和除草作用的內(nèi)生細(xì)菌將具有很好的應(yīng)用前景。已有研究證明，內(nèi)生細(xì)菌通過次生代謝產(chǎn)生一些抗真菌或除草物質(zhì)來達(dá)到防治植物病害和雜草的目的（Ryan et al.，2008;陳世國(guó)和強(qiáng)勝，2015）。李明智等（2004）從反枝莧根際土壤中分離獲得1株對(duì)反枝莧和薺菜等雙子葉雜草具有較強(qiáng)除草活性的野油菜黃單胞菌反枝莧致病變種;李振東等（2011）從高山草甸紫花針茅中分離到2株對(duì)辣椒立枯絲核菌具有拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌;柯楊等（2013）從冬凌草中分離篩選出對(duì)鐮刀菌屬及大莖點(diǎn)霉屬病原真菌具有明顯拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌;魏立娟等（2018）從線葉嵩草植株中分離篩選出10株對(duì)馬鈴薯炭疽病有較強(qiáng)抗性的內(nèi)生細(xì)菌。本研究從52株內(nèi)生細(xì)菌中分離出11株同時(shí)對(duì)馬鈴薯晚疫病和櫻桃褐斑病具有拮抗能力的菌株，20株對(duì)野燕麥和野油菜種子具有不同程度除草活性的菌株。

植物內(nèi)生細(xì)菌因受植物保護(hù)而具有相對(duì)穩(wěn)定的生態(tài)環(huán)境，在可持續(xù)農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)和土壤修復(fù)方面是一類具有潛在應(yīng)用價(jià)值且更直接、安全有效的微生物資源。本研究證實(shí)所分離得到的內(nèi)生細(xì)菌的部分生物學(xué)功能，說明祁連高寒草甸矮火絨草能適應(yīng)極端環(huán)境而生存下來是植物與內(nèi)生細(xì)菌協(xié)調(diào)進(jìn)化的結(jié)果，對(duì)于這部分功能菌株是否與宿主矮火絨草的抗逆生存相關(guān)還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。然而，傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法還不能完全揭示植物內(nèi)生細(xì)菌的種類和分布情況，使得研究植物內(nèi)生細(xì)菌的種群結(jié)構(gòu)數(shù)量及多樣性受到限制，因此，利用非培養(yǎng)的方法如高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)一步探究矮火絨草植株內(nèi)生細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)、多樣性及功能細(xì)菌預(yù)測(cè)具有必要性。

4 結(jié)論

從矮火絨草植株根、莖、葉和種子部位共分離純化出52株內(nèi)生細(xì)菌，歸屬于4門7綱10目14科18屬，內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量分布表現(xiàn)為根>莖>種子>葉。其中，11株有拮抗病原真菌的能力、9株具有產(chǎn)IAA的能力、7株有溶磷活性、7株具有固氮活性、20株具有除草活性、13株具有耐低溫能力和8株具有促生作用。各類型的功能菌在根、莖和種子部位均有分布，在葉中未分離到拮抗菌、產(chǎn)IAA菌、固氮菌和促生菌。各功能菌株分布在17個(gè)屬，多樣性較高，其中假單胞菌屬和芽孢桿菌屬具有多種功能菌株，是矮火絨草植株的重要內(nèi)生細(xì)菌。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）