劉佳等

關(guān)鍵詞 脂肪酶； 酶活性； 納米金； 氫鍵； 比色傳感

1 引 言

脂肪酶（3.1.1.3）被認為是繼蛋白酶、糖化酶之后的又一重要工業(yè)用酶。工業(yè)用脂肪酶大多來源于微生物，篩選活力高、產(chǎn)量高及低成本的脂肪酶菌種是其關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)，在脂肪酶的改造、分離、純化以及重組蛋白的篩選等領(lǐng)域，脂肪酶活力的測定都是不可缺少的關(guān)鍵技術(shù)，因此， 建立高通量的酶活性檢測方法對于促進酶學(xué)研究和酶工程技術(shù)的發(fā)展都具有重要意義[1～4]。

目前，脂肪酶活性檢測普遍采用酸堿滴定法[5]、濁度法[6]及光度法[7]，但這些方法多存在靈敏度不高、誤差大、且費時費力、不適用于高通量檢測等不足。熒光法[7]雖然靈敏度較高，但大部分可被脂肪酶水解的熒光底物均受限于反應(yīng)介質(zhì)的酸度，另外熒光猝滅等因素還可能影響實驗結(jié)果的精確性。對于動輒數(shù)以千計的定向進化庫而言，要進行高通量酶檢測，這些方法存在較大局限性。因此迫切需要建立高靈敏度、高選擇性，更加簡單、快速、準確的脂肪酶檢測方法。

納米金因其獨特的表面等離子體共振（SPR）效應(yīng)成為構(gòu)建生物傳感器的優(yōu)良材料，已被用于多種酶分析研究中[8～11]，尤其是基于納米金的比色檢測方法由于其簡單、快速已成為高通量檢測方法之一[12]。

本實驗以巰基乙酸甲酯修飾的納米金（MTAuNPs）為比色探針，構(gòu)建檢測脂肪酶活性的生物傳感器。在弱酸性磷酸緩沖溶液中，脂肪酶水解切割MTAuNPs 上的MT，生成羧酸根。通過調(diào)節(jié)溶液pH值至酸性，帶有羧酸根殘基的納米金之間能夠形成較強氫鍵，誘導(dǎo)AuNPs聚集變色，基于此建立了氫鍵誘導(dǎo)納米金比色傳感方法檢測脂肪酶的活性（如圖1所示）。與傳統(tǒng)方法相比，本方法具有快速、簡單、價廉、靈敏度高等優(yōu)勢，可用于高通量、實時檢測脂肪酶活性。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

SpectraMax M3微孔板檢測系統(tǒng) （美國分子儀器公司）； JEM200 CX透射電子顯微鏡 （日本電子株式會社）； B260恒溫水浴鍋 （上海亞榮生化儀器廠）； 電子天平（德國賽多利斯公司）； PHS3C pH計（上海雷磁公司）； 氯金酸、NaH2PO4、Na2HPO4、檸檬酸鈉、檸檬酸、NaOH均為分析純（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）； 巰基乙酸甲酯（MT， 95%，百靈威科技有限公司）； 諾維信435脂肪酶（Novozymes 435，諾維信投資有限公司）； 根霉脂肪酶（RNL， 1.5 U/mg）、豬胰脂肪酶（PPL）、洋蔥假單胞脂肪酶（CRL）、假單胞菌脂肪酶（PSL）、食品脂肪酶（FNL， SigmaAldrich （上海）貿(mào)易有限公司）。

2.2 納米金的合成

采用檸檬酸鈉還原法合成納米金[12]： 300 μL HAuCl4 （0.1 mol/L） 溶液加入含有100 mL超純水的三口燒瓶中，劇烈攪拌且加熱至沸騰； 2 min后加入4 mL現(xiàn)配的檸檬酸鈉溶液（38 mmol/L），溶液顏色由黃色逐漸變?yōu)橥该骶萍t色，繼續(xù)反應(yīng)10 min后停止加熱，自然冷卻到室溫。制得的AuNPs溶液在4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 巰基乙酸甲酯（MT）修飾納米金

移取適量AuNPs溶液（2.3 nmol/L）和MT溶液（1.0 μmol/L）混合，使其最終摩爾比為1∶50。在室溫下，輕微振蕩2 h， 使MT在溶液中分散均勻，再靜置 10 h，即得MT修飾的納米金（MTAuNPs）。

采用本研究建立的脂肪酶活力測定方法，可以直接采用吸光度比值（A650/A520）作為表征脂肪酶活力大小的參數(shù)，A650/A520越高，表明脂肪酶活力越大[14]。由表1可見，采用本文方法，各商品酶的活力大小即A650/A520大小依次為：Novozymes 435>PPL>CRL>FNL>PSL，與電位滴定法測定的酶活力大小順序一致。雖然電位滴定法和本方法所用的酶活表示方法不同，但其酶活性的變化趨勢是完全一致的。因此，本實驗構(gòu)建的MTAuNPs 生物探針可簡單快速的進行脂肪酶活性檢測，在酶活基礎(chǔ)研究和實際應(yīng)用中具有潛在的應(yīng)用價值。

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