譚蘆蘭 唐宏剛 楊慧娟 肖朝耿 孟祥河* 陳黎洪*任發(fā)政 郭慧媛 任大喜 程雅錦

（1 浙江工業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院 杭州310014 2 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品科學(xué)研究所 杭州310021 3 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院 北京100038 4 浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 杭州310029 5 浙江田歌實(shí)業(yè)股份有限公司 浙江金華321200）

我國(guó)90%的鴨蛋以咸鴨蛋制品消費(fèi)，咸蛋清作為咸蛋黃生產(chǎn)的副產(chǎn)品，占咸鴨蛋中質(zhì)量分?jǐn)?shù)54.73%；在腌制過程中其蛋白質(zhì)組成成分未發(fā)生變化，然而因含鹽量高達(dá)7%～12%，而未能合理利用[1]。除了部分作為飼料及焙烤配料外，大部分的咸蛋清被當(dāng)作廢棄物處置，這不僅造成優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)資源的浪費(fèi)，其發(fā)酵分解產(chǎn)物還會(huì)造成環(huán)境和水資源的污染[2]。

咸蛋清蛋白具有凝膠性、持水性、起泡性和乳化性等多種功能特性，其凝膠特性在食品工業(yè)中有著廣泛應(yīng)用[3]。咸蛋清蛋白在腌漬過程中受到大量NaCl 的影響，功能特性發(fā)生變化，如何進(jìn)一步改善咸蛋清蛋白的功能特性是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[4]。蛋白質(zhì)改性主要是改變蛋白質(zhì)氨基酸殘基和多肽鏈結(jié)構(gòu)，引起蛋白質(zhì)大分子的空間結(jié)構(gòu)變化，導(dǎo)致其理化性質(zhì)改變，從而獲得更好的功能特性[5]。目前常用的方法包括物理法、化學(xué)法和生物酶法等[6]。

魔芋膠（konjac gum，KGM）也稱魔芋葡甘聚糖，是一種應(yīng)用廣泛且經(jīng)濟(jì)的多糖。因其具有優(yōu)良而獨(dú)特的膠凝性能，可在一定條件下形成熱可逆凝膠和熱不可逆凝膠[7]，在酸奶、果汁、果凍食品以及肉制品的加工與生產(chǎn)中，魔芋膠應(yīng)用廣泛。劉虎成等[8]研究表明復(fù)配魔芋膠可以提高肉制品水分含量、嫩度，以及改善肉制品的質(zhì)構(gòu)。魔芋膠在人體中可被水解為低聚糖，而低聚糖具有預(yù)防血糖值上升，降低膽固醇等功效[9-10]。食品是由多種成分構(gòu)成的復(fù)雜體系，在一定的條件下 （溫度、pH值、離子強(qiáng)度等），蛋白質(zhì)和多糖等大分子聚合物上的部分基團(tuán)可能發(fā)生某些作用，從而賦予聚合物一些獨(dú)特的功能，這不僅影響食品的營(yíng)養(yǎng)特性，也影響食品的感官性狀和理化特性[11-12]。

本試驗(yàn)探討魔芋膠和咸蛋清相互作用，改善咸蛋清蛋白的凝膠特性，為咸蛋清蛋白的進(jìn)一步利用提供思路與方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

咸鴨蛋蛋清，紹興百順科技有限公司；魔芋膠，上海源葉生物科技有限公司；磷酸二氫鈉、十二水合磷酸氫二鈉、無水乙醇等試劑（均為分析純級(jí)），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TA.XT.plus 物性測(cè)定質(zhì)構(gòu)儀，英國(guó)Stable Micro System 公司；SC-1 智能式測(cè)色色差計(jì)（D65 光源，Φ=2 cm），溫州儀器儀表公司；Spectrumlab54紫外-可見分光光度計(jì)，上海棱光技術(shù)有限公司；UV-1800 紫外-可見分光光度計(jì)，上海精密儀器儀表有限公司；Scientz-18N 冷凍干燥機(jī)，寧波新芝凍干設(shè)備股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理 通過Biuret 方法[13]測(cè)定樣品蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為12%，NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)8.04%。

將50 g 液體咸蛋清分別與0.00，0.01，0.02，0.03，0.04，0.05 g 的魔芋膠混合在100 mL燒杯中，攪拌均勻，制備0.0%，0.2%，0.4%，0.6%，0.8%，1.0%的咸蛋清蛋白-魔芋膠混合體系。將混合好的溶液在25 ℃磁力攪拌30 min，反應(yīng)完畢后，將改性后的蛋清蛋白溶液置于4 ℃冰箱中冷藏備用。

1.3.2 凝膠制備 分別取20 mL 魔芋膠添加各組 咸蛋清蛋白-魔芋膠混合體系，加入30 mL 培養(yǎng)皿中，保鮮膜封口，于90 ℃水浴鍋中恒溫水浴30 min，取出后放入冰水中冷卻至常溫，4 ℃冰箱冷藏過夜，測(cè)定各指標(biāo)。

1.3.3 凝膠質(zhì)構(gòu)（TPA）分析 樣品凝膠質(zhì)構(gòu)分析參照Li[14]的方法并稍作修改。將各組樣品制備的凝膠切成10 mm×10 mm×10 mm 大小，使用裝有扁平柱塞（型號(hào)SMS-P/35）的TA.XT.plus 質(zhì)構(gòu)分析儀進(jìn)行質(zhì)地分布分析。設(shè)置參數(shù)為：2 mm/s 的速度壓縮樣品至原始高度的50%，觸發(fā)點(diǎn)負(fù)載為5 g，兩個(gè)壓縮循環(huán)間隔5 s。在Texture Expert 軟件上由力-時(shí)間變形曲線計(jì)算硬度、黏性、咀嚼性、彈性、內(nèi)聚性和彈性等參數(shù)。

1.3.4 凝膠持水力的測(cè)定 樣品凝膠持水性測(cè)定參照遲玉杰[15]的方法并適當(dāng)修改。取一定質(zhì)量（M1）的凝膠放入50 mL 的離心管中，在4 ℃下以8 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心20 min，取出后用濾紙吸干凝膠表面水分，測(cè)定離心后的質(zhì)量（M2）。每組樣品做3 次平行試驗(yàn)，結(jié)果取平均值。以樣品凝膠離心前、后的質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示。計(jì)算公式：

1.3.5 色度分析 用色差儀測(cè)定咸蛋清凝膠樣品色度，每3 d 測(cè)1 次，每個(gè)樣品取3 個(gè)部位測(cè)定，取平均值。分析樣品前，用標(biāo)準(zhǔn)白板校正色差計(jì)，測(cè)定樣品b*值（黃度值，正數(shù)代表黃色，負(fù)數(shù)代表藍(lán)色）、a*值（紅度值，反映樣品的紅色程度，正數(shù)代表紅色，負(fù)數(shù)代表綠色）、L*值（亮度值，反映色澤的亮度）。

1.3.6 凝膠電鏡掃描 凝膠微觀結(jié)構(gòu)分析參照Salvador 等[16]的方法并稍作改動(dòng)。將制備好的各組凝膠樣品中心部位切成2 mm×2 mm×2 mm 的方塊，用2.5%的戊二醛溶液浸泡固定，4 ℃條件下放置12 h。固定好的樣品在室溫條件下用0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）漂洗3 次，每次5 min，然后依次用體積分?jǐn)?shù)50%，60%，70%，80%，90%及100%的乙醇溶液分別浸泡10 min，逐級(jí)脫水，之后用叔丁醇浸泡3 次，每次5 min，然后將處理好的樣品冷凍干燥。干燥后的樣品用導(dǎo)電雙面膠固定到樣品臺(tái)上，經(jīng)濺射儀噴金，置于掃描電鏡下觀察樣品的表觀形貌。

1.3.7 表面疏水性 參照Nakai 等[17]方法并稍作修改，測(cè)定樣品表面疏水性。用0.02 mol/L 磷酸鹽緩沖液 （pH 7.4） 將樣品分別配制成1，2，3，4，5 mg/mL 的蛋白溶液。取不同質(zhì)量濃度的樣品各4 mL，加入20 mL 8-苯胺萘磺-1-酸鹽（ANS）溶液作為熒光探針并于室溫條件下保持1 h。設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)370 nm，發(fā)射波長(zhǎng)470 nm，用熒光光譜儀測(cè)定樣品的熒光強(qiáng)度，以未加8-苯氨基-1-萘磺酸的蛋白溶液的熒光強(qiáng)度為空白。用相對(duì)熒光強(qiáng)度對(duì)蛋白質(zhì)濃度作圖，采用最小二乘法進(jìn)行曲線擬合，直線斜率即蛋白質(zhì)的表面疏水性。

1.3.8 巰基含量測(cè)定 參照遲玉杰等[18]的方法測(cè)定樣品中的巰基含量變化。取4 mL 0.1 mol/L Tris-甘氨酸緩沖液（pH 8.0），其中含0.01 mol/L 的乙二胺四乙酸（EDTA），加到1 mL 4 g/100 mL 蛋白質(zhì)溶液中，40 ℃保溫30 min，加入125 μL 的5，5-二巰基-2，2-二硝基苯甲酸（DTNB）試劑（20mg DTNB 溶于5 mL pH 8.0 的0.1 mol/L Tris-甘氨酸緩沖液），25 ℃顯色10 min，測(cè)定波長(zhǎng)412 nm 處的吸光度，以1.36×104L/（mol·cm）消光系數(shù)計(jì)算表面巰基含量。

測(cè)定總游離巰基含量時(shí)，在Tris-甘氨酸緩沖液中添加0.25 g/100 mL SDS，蛋白質(zhì)含量為0.4 g/100 mL，其它操作條件與測(cè)定表面巰基含量一致。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行相關(guān)性分析和方差分析，Duncan 法進(jìn)行多重比較（P＜0.05，差異顯著），采用Origin 9.1 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 咸蛋清蛋白凝膠質(zhì)構(gòu)的變化

由圖1可得，隨著魔芋膠添加量的增加（0.0%～1.0%），咸蛋清蛋白凝膠的硬度、膠著性、咀嚼性、彈性、內(nèi)聚性及回復(fù)力不斷升高，且魔芋膠添加量越多，增加效果越明顯。當(dāng)魔芋膠添加量為0.6%，08%和1.0%時(shí)，咸蛋清蛋白凝膠硬度間不存在顯著性差異（P＞0.05）且咸凝膠硬度顯著高于其余3組，比對(duì)照組提高了16.42%。與對(duì)照相比，最佳膠著性增加113.33%，咀嚼性增加168.18%，彈性增加26.08%，內(nèi)聚性增加81.25%，回復(fù)力增加21.43%，與凝膠硬度呈現(xiàn)相似的變化趨勢(shì)。

蛋白聚集是凝膠形成過程中重要的一步，其受到溫度、金屬離子及蛋白濃度等的影響。在加熱過程中，蛋清蛋白約在60 ℃時(shí)失去流動(dòng)性，繼而形成具有獨(dú)特紋理的凝膠。另有研究表明，高濃度的NaCl 不利于蛋清的熱聚集和凝固型凝膠的形成[19]。本文中，在溫度與NaCl 含量一定的情況下，魔芋膠改變咸蛋清凝膠性能是由于魔芋膠結(jié)構(gòu)中的葡甘露聚糖與咸蛋清中的卵白蛋白產(chǎn)生交聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)了蛋清蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成，最終使咸蛋清蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)更加致密與穩(wěn)定[20]。已有研究發(fā)現(xiàn)魔芋葡甘聚糖分子中含有大量羥基、羰基等親水性基團(tuán)，使其具有較強(qiáng)的親水能力，而咸蛋清蛋白質(zhì)兼具親水親油性，魔芋葡聚糖的親水基團(tuán)能與蛋白質(zhì)的親油基團(tuán)發(fā)生氫鍵作用形成緊密的結(jié)構(gòu)[21]。當(dāng)魔芋膠添加量0.8%～1.0%時(shí)，凝膠硬度、咀嚼性及膠著性上升緩慢，推測(cè)此時(shí)魔芋膠與蛋清蛋白的結(jié)合趨于飽和。

2.2 咸蛋清蛋白凝膠持水能力變化

水是重要的食物組分，對(duì)食物的貨架穩(wěn)定性、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、品質(zhì)屬性和加工工藝等均有十分重要的影響[22-23]。從圖2可知，隨著魔芋膠添加量的增加，咸蛋清蛋白凝膠的持水力出現(xiàn)先逐漸升高繼而緩和的跡象。當(dāng)魔芋膠添加量為0.8%時(shí)，與對(duì)照組相比，持水力增加26.13%，在一定程度上蛋清凝膠的持水性說明蛋白質(zhì)結(jié)合水分的能力[24]。這是由于魔芋膠中的魔芋葡甘聚糖中含有大量的親水基團(tuán)，它能結(jié)合大量水分，通過氫鍵、分子偶極、誘導(dǎo)偶極、瞬間偶極等作用力與水分子結(jié)合形成難于自由運(yùn)動(dòng)的巨大分子，促使魔芋葡甘聚糖大分子建立網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而增加其保水性[25]。另外，魔芋膠形成的多孔凝膠結(jié)構(gòu)也增加了對(duì)水分的束縛作用。

2.3 咸蛋清蛋白凝膠物理外觀變化

由表1可以看出，咸蛋清蛋白凝膠的色差亮度值（L*）在魔芋膠添加量0.8%與1.0%時(shí)與其它添加量時(shí)差異顯著（P＜0.05）。當(dāng)魔芋膠添加量為1.0%時(shí)，與對(duì)照組相比，凝膠色差亮度值（L*）增加2.41%。亮度值（L*）的增加是由于在加熱過程中咸蛋清蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成與魔芋膠添加量有關(guān)，魔芋膠添加量增加提高了咸蛋清凝膠的保水性和凝膠質(zhì)構(gòu)的緊密程度，從而使得凝膠色差的亮度值（L*）有所增加。色差的紅度值（a*）與黃度值（b*）與亮度值（L*）的變化相反，呈現(xiàn)略微下降的趨勢(shì)。其中凝膠色差紅度值（a*）下降1.76%，黃度值（b*）下降6.38%，這主要是由于魔芋膠使蛋清蛋白凝膠的保水性能增加，所以導(dǎo)致凝膠透明性增加，紅度值（a*）與黃度值（b*）相對(duì)偏低。

2.4 咸蛋清蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)變化

圖1 不同魔芋膠添加量時(shí)咸蛋清蛋白的凝膠質(zhì)構(gòu)變化Fig.1 Texture changes of white protein gel from salted duck egg at different amounts of konjac gum

圖2 不同魔芋膠添加量時(shí)咸蛋清蛋白的凝膠持水力變化Fig.2 Changes in gel Water Holding Capacity of white protein from salted duck egg at different amounts of konjac gum

表1 不同魔芋膠添加量時(shí)咸蛋清蛋白凝膠色度變化Table 1 Variation in chroma of white protein gel from salted duck egg at different amounts of konjac gum

在加熱過程中，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)逐步展開，隨后聚集，最終產(chǎn)生更加緊致的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)分子變性后迅速聚集并形成有序的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的過程稱為膠凝作用[26]。通過掃描電鏡可以觀察到蛋白質(zhì)聚集體的形狀、排列及孔隙大小，是從微觀結(jié)構(gòu)上觀察凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的一種有效方法[27]。如圖3所示，隨著魔芋膠濃度的增大，復(fù)合凝膠體系的表觀結(jié)構(gòu)逐漸由疏松多孔轉(zhuǎn)向緊密平滑。在100 倍電鏡下，未添加魔芋膠的樣品A0，凝膠表面的微觀結(jié)構(gòu)疏松且有較多空隙，隨著魔芋膠添加量的增加，A1 至A5 樣品凝膠逐漸變得光滑、均勻。在500 倍電鏡下，未加入魔芋膠的B0 凝膠表面很不平整并有明顯的孔洞。值得注意的是：當(dāng)魔芋膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.6%～1.0%時(shí)，樣品B3、B4、B5 的凝膠表面逐漸平整與緊密，此時(shí)咸蛋清蛋白的凝膠強(qiáng)度和持水性也是最大的。

2.5 咸蛋清蛋白表面疏水性變化

由圖4可知，魔芋膠添加量增加，咸蛋清蛋白質(zhì)的疏水性也增加，當(dāng)魔芋膠添加量為1.0%時(shí)，與對(duì)照組相比，表面疏水性增加111.11%。蛋清蛋白質(zhì)表面疏水性反映的是蛋白質(zhì)分子表面疏水性氨基酸的相對(duì)含量，由于疏水性能夠反映蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的微妙變化，因此它是評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)理化和功能性質(zhì)的一個(gè)重要參數(shù)[28]。對(duì)于凝膠形成而言，疏水作用是維持凝膠結(jié)構(gòu)的重要作用力，而蛋白質(zhì)的表面疏水性與分子間疏水作用緊密相關(guān)，蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)展開后疏水性脂肪族與芳香族氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)的暴露會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)疏水性的變化，因此，表面疏水性可反映蛋白質(zhì)解折疊的程度[29]。有研究證實(shí)，在6%NaCl 條件下蛋清蛋白表面疏水性低速增長(zhǎng)，當(dāng)加熱溫度80～90 ℃時(shí)，表面疏水性恒定或顯著降低[30]。本試驗(yàn)中，隨著魔芋膠添加量的增加，樣品蛋白質(zhì)表面疏水性增加，這是由于蛋白質(zhì)的分子鏈伸展以及分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)不斷暴露所致[31]。蛋白質(zhì)的表面疏水性在凝膠形成的初期，對(duì)立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形成起著非常重要的作用[32]。

圖3 不同魔芋膠添加量時(shí)咸蛋清蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)變化Fig.3 Microstructure changes of white protein gel from salted duck egg at different amounts of konjac gum

2.6 咸蛋清蛋白中巰基含量變化

如圖5所示，隨著魔芋膠添加量的增加，咸蛋清蛋白中總巰基含量從129.69%降到72.50%，而表面巰基的含量從11.34%增到62.64%。這可能是由于咸蛋清蛋白與魔芋膠在相互作用過程中，蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生變化。在熱力作用下，加入魔芋膠后的咸蛋清蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)展開，使分子內(nèi)部包埋的巰基不斷暴露出來，導(dǎo)致表面巰基含量的增加。隨著暴露于表面的巰基數(shù)的增多，分子間的相互作用也增強(qiáng)，蛋清蛋白的凝膠性能因此提高。另外，由于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部或分子間的巰基氧化反應(yīng)或巰基與二硫鍵交換反應(yīng)形成更多二硫鍵，最終導(dǎo)致總巰基含量下降[33]。

分子間二硫鍵是維持凝膠結(jié)構(gòu)的重要作用力。通過分析糖基化蛋白表面游離巰基與總游離巰基含量的變化，可以研究糖基化反應(yīng)過程中蛋白質(zhì)分子的空間伸展?fàn)顩r。有研究表明，蛋白的總巰基數(shù)和表面巰基數(shù)對(duì)蛋白質(zhì)的凝膠性能起明顯的作用，而巰基和二硫鍵是蛋白質(zhì)分子中穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)象的重要化學(xué)鍵，會(huì)影響蛋白質(zhì)凝膠性、持水性等功能特性[34]。

3 結(jié)論

圖4 不同魔芋膠添加量時(shí)咸蛋清蛋白表面疏水性變化Fig.4 Changes in surface hydrophobicity of white protein from salted duck egg at different amounts of konjac gum

圖5 不同魔芋膠添加量時(shí)咸蛋清蛋白巰基含量變化Fig.5 Variation of sulfhydryl content of white protein from salted duck egg at different amounts of konjac gum

添加魔芋膠可以改善咸蛋清蛋白凝膠的硬度，當(dāng)其添加量0.6%～1.0%時(shí)，各組樣品數(shù)據(jù)間沒有顯著性差異（P＞0.05），與對(duì)照組相比凝膠硬度提高了16.42%；在魔芋膠添加量為0.8%時(shí)樣品的持水力最佳，比對(duì)照組增加26.13%；隨著魔芋膠的添加量增加，樣品凝膠表面微觀結(jié)構(gòu)由疏松多孔逐漸轉(zhuǎn)為平滑均勻。這些變化與添加魔芋膠后咸蛋清的表面疏水性及巰基含量的變化相關(guān)。隨著魔芋膠添加量的增加，咸蛋清的表面疏水性增加。表面疏水性在蛋清蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)形成初期，對(duì)立體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成有重要作用。另外，咸蛋清的表面巰基在魔芋膠的作用下不斷增加，總巰基含量減少，分子間的相互作用增強(qiáng)，使咸蛋清蛋白的凝膠性能提高。

本文中，通過直接添加魔芋膠，顯著改善雞蛋清凝膠的凝膠強(qiáng)度、凝膠持水力、色度值及表面微觀結(jié)構(gòu)。通過對(duì)咸蛋清的表面疏水性與巰基含量變化的分析，進(jìn)一步闡釋魔芋膠改善咸蛋清凝膠特性的機(jī)理。然而，咸蛋清本身含有大量的NaCl，凝膠性能在金屬離子的作用下有所改變。關(guān)于金屬離子、蛋白質(zhì)和多糖3 種物質(zhì)間的相互作用，以及直接添加多糖提高蛋白質(zhì)凝膠凝膠強(qiáng)度的研究還比較有限，值得進(jìn)一步探究。