龔磊，彭洪，任明揚，張濤，田云鴻，彭明沙

1 南充市中心醫(yī)院胃腸外科 四川南充 637000

2 南充市中心醫(yī)院中西醫(yī)結合肛腸科 四川南充 637000

3 南充市中心醫(yī)院消化內(nèi)科 四川南充 637000

結直腸癌在惡性腫瘤中死亡率較高［1］。目前采用的綜合治療策略已較前改善患者預后，但是復發(fā)及化療抵抗的患者預后仍然較差［2］，因此對結直腸癌發(fā)病機制的不斷探究將有助于為臨床治療提供新的思考方向。微小RNA（microRNAs）是參與細胞中基因表達轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的斷鏈非編碼RNA，影響著多種生物學過程，如細胞發(fā)育、增殖及分化等。有研究［3-4］表明，miRNA既可以扮演致癌基因又可以起到抑癌基因的作用來調(diào)節(jié)腫瘤的增殖及凋亡過程。miR-92b-3p與腫瘤相關，其過表達可抑制TGF-β/Smad3/p21信號通路增加膠質(zhì)母細胞瘤的增殖活性，但亦可靶向PTEN/Akt信號通路抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖、侵襲和遷移并刺激細胞凋亡［5-6］。有研究報道，miR-92b-3p與結直腸癌患者預后有關［7］，然而miR-92b-3p與結直腸癌發(fā)生發(fā)展的關系尚不完全清楚。本研究旨在探討miR-92b-3p在結直腸癌組織及細胞中的表達并探討其可能的作用機制，現(xiàn)報告如下。

1 材料和方法

1.1 材料

人結直腸癌HCT116細胞株及人正常結直腸黏膜細胞（FHC）購自中科院上海細胞庫。miR-92b-3p inhibitor（Cat.No.:MIH03934）購自加拿大ABM公司。

收集2017年1月至2018年4月年在南充市中心醫(yī)院行根治性手術的30例結直腸癌患者組織標本（左半結腸癌8例、右半結腸癌6例、直腸癌16例）及匹配的癌旁黏膜組織（距腫瘤約3 cm），在標本離體后30 min以內(nèi)將結直腸癌組織標本及癌旁組織切成直徑為0.5 cm左右的組織塊，裝入滅菌凍存管中，迅速放入液氮罐中保存。病理切片證實結直腸癌組織標本為原發(fā)性結直腸癌，并且癌旁黏膜組織為正常黏膜組織?；颊吣挲g40～89歲，術前經(jīng)腸鏡活檢病理診斷為結直腸癌，且在接受腸鏡檢查后1個月內(nèi)容接受結直腸癌根治術，排除既往有其他器官或組織惡性腫瘤病史、合并其他惡性腫瘤、術前接受其他抗腫瘤治療情況。本研究經(jīng)南充市中心醫(yī)院倫理委員會審批通過。

1.2 方法

1.2.1 分析miR-92b-3p在結直腸癌組織、癌旁正常組織及細胞株中的表達 提取30例結直腸癌組織標本及癌旁正常組織標本的RNA并進行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈，然后進行擴增，40個循環(huán)后用Agilent Stratagene熒光定量PCR儀Mx3000P進行PCR實驗，檢測miR-92b-3p的表達。實驗按照2-△△Ct方法處理數(shù)據(jù)。同時收集培養(yǎng)的HCT116及FHC細胞，提取RNA并進行逆轉(zhuǎn)錄，使用qPCR法檢測miR-92b-3p的表達。引物序列：miR-92b-3p RT CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGGA -GGCC，miR-92b-3p F ACACTCCAGCTGGGTATTGCACTCGTCCCGGC。內(nèi)參引物序列：U6 F CTCGCTTCGGCAGCACA，U6R AACGCTTCACGAATTTGCGT。

1.2.2 分析抑制miR-92b-3p表達對細胞增殖的影響 將106個HCT116細胞鋪于6孔板中，將miR-92b-3p inhibitor轉(zhuǎn)染至HCT116細胞中，并設置陰性對照組（NC，培養(yǎng)液中加入生理鹽水）。培養(yǎng)48 h后將HCT116細胞接種于96孔板（每孔含104個細胞），然后將培養(yǎng)基與CCK-8按照10:1比例混合，每孔加入100 μL的CCK-8混合液，將96孔板放到培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h后將培養(yǎng)基移至酶標板，使用酶標儀檢測24 h、48 h、72 h的OD值（450 nm）。

1.2.3 篩選和驗證miR-92b-3p靶基因 使用生物信息學方法（Targetscan）對miR-92b-3p靶基因進行預測。Targetscan可預測miRNA種子區(qū)（miRNA上進化最為保守的片段）與mRNA 3’-UTR靶位點是否完全互補結合，根據(jù)預測結果選擇候選靶基因（按照預測結果為FBXW7），并用雙熒光素酶報告基因法進行驗證，按照說明書進行操作。

1.2.4 分析FBXW7過表達對細胞增殖情況的影響 構建FBXW7過表達載體，引物由上海生工有限公司合成，序列如下：FBXW7-F1 GGGGTACCATGTCAAAACCGGGAAAAC，F(xiàn)BXW7-R1 ATTTGCGGCCGCTCACTTCATGTCCACATCAAA。在96孔板內(nèi)接種100 μL密度為105/mL的細胞懸液，常規(guī)培養(yǎng)24 h后在25 μL的DMEM無血清培養(yǎng)基中加入0.4 μg pcDNA3.0-FBXW7質(zhì)粒，并在25 μL的DMEM無血清培養(yǎng)基中加入0.4 μL lipofectamine 3000，混勻后將pcDNA3.0-FBXW7質(zhì)粒與lipofectamine 3000混合，混合后室溫放置20 min，然后將50 μL pcDNA3.0-FBXW7質(zhì)粒/Lipofectamine 3000復合物加到培養(yǎng)板的孔中（含細胞和培養(yǎng)基）培養(yǎng)，并設置陰性對照組（NC，轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒）。使用CCK-8法檢測HCT116細胞pcDNA3.0-FBXW7組及NC組在24 h、48 h、72 h的OD值。

1.2.5 分析沉默F(xiàn)BXW7對miR-92b-3p下調(diào)HCT116細胞增殖能力的影響 通過FBXW7 siRNA沉默F(xiàn)BXW7，設置空白組（blank，只加培養(yǎng)基），陰性對照組（NC，F(xiàn)BXW7無同源性無義序列），miR-92b-3p inhibitor組及miR-92b-3p inhibitor+FBXW7 siRNA組，檢測各組HCT116細胞在24 h、48 h、72 h的OD值，探討miR-92b-3p是否通過靶向FBXW7調(diào)控細胞增殖。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 miR-92b-3p在結直腸癌組織、癌旁正常組織及細胞株中的表達

miR-92b-3p在結直腸癌組織中的表達水平為（1.355±0.516），高于癌旁正常組織的（0.810±0.318），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），見圖1。miR-92b-3p在HCT116中表達水平為（9.055±0.157），高于FHC中的（1.010±0.173），差異有統(tǒng)計學意義（t=1448.266，P＜0.001）。

2.2 NC組與miR-92b-3p inhibitor組細胞OD值比較

兩組在24 h的OD值比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。miR-92b-3p inhibitor組在48 h、72 h的OD值低于NC組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。見表1。

2.3 FBXW7是miR-92b-3p的靶基因

使用生物信息學方法對miR-92b-3p的靶基因進行預測，發(fā)現(xiàn)FBXW7是miR-92b-3p可能的靶基因，通過雙熒光素酶報告基因法進行驗證，引物序列FBXW7 WT 5-GACCAGUGAAUAAGGGGACGGGG-3，F(xiàn)BXW7 MUT 5-GACCAGUGAAUAAGGCCUGCCCG-3（在正常模板鏈上，加入突變引物進行擴增，引入突變位點），發(fā)現(xiàn)miR-92b-3p與野生型FBXW7 3’UTR結合，結果表現(xiàn)為相對熒光強度的下調(diào)，而當FBXW7 3’UTR與miR-92b-p結合位點被突變后，相對熒光強度與對照組間比較，差異無統(tǒng)計學意義，雙熒光素酶報告基因法提示FBXW7可與miR-92b-3p靶向結合。見圖2、圖3。

2.4 NC組與FBXW7過表達組細胞OD值比較

在HCT116細胞中轉(zhuǎn)染FBXW7過表達載體后，與NC組相比，F(xiàn)BXW7過表達組在24 h、48 h、72 h的OD值均降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。見表2。

2.5 NC組、blank組、miR-92b-3p inbibitror組與Inbibitror+siRNA組細胞OD值比較

在24 h、48 h、72 h四個時間點，四組間差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。在24 h時，NC組、miR-92b-3p inbibitror組及miR-92b-3p inbibitror+siRNA組的OD值均低于blank組（均P＜0.05）；在48 h及72 h時，miR-92b-3p inbibitror組與miR-92b-3p inbibitror+siRNA組的OD值均低于NC組、Blank組，miR-92b-3p inbibitror組的OD值低于miR-92b-3p inbibitror+siRNA組（均P＜0.05）。見表3。

3 討論

既往研究發(fā)現(xiàn)血液中高表達的miR-92b-3p可以作為滑膜肉瘤新的腫瘤標志物，也有報道m(xù)iR-92b-3p在原發(fā)性腦腫瘤中特異性高表達，并可調(diào)節(jié)小鼠胚胎腦中的中間皮層祖細胞的發(fā)育［8-9］。不僅如此，使用miR-92b-3p特異性抑制劑下調(diào)miR-92b-3p表達可通過靶向Dkk3基因及阻斷Wnt/beta-catenin信號通路促進膠質(zhì)瘤細胞的凋亡［10］。上述研究結果表明miR-92b-3p可以作為促癌miRNA發(fā)揮作用。本研究結果發(fā)現(xiàn)miR-92b-3p在結直腸癌組織中的表達水平高于癌旁正常組織，并且miR-92b-3p在結直腸癌細胞株HCT116細胞中的表達水平高于人正常結直腸黏膜細胞FHC，說明miR-92b-3p參與結直腸癌的發(fā)生發(fā)展。進一步的實驗發(fā)現(xiàn)抑制miR-92b-3p表達可降低HCT116細胞增殖能力，表明miR-92b-3p可以作為癌基因促進結直腸癌的發(fā)生。

表1 NC組與miR-92b-3p inhibitor組細胞OD值比較（ˉ±s）

表1 NC組與miR-92b-3p inhibitor組細胞OD值比較（ˉ±s）

組別NC miR-92b-3p inhibitor t P 24 h 0.307±0.019 0.281±0.017 1.764 0.153 48 h 0.717±0.023 0.603±0.021 6.472 0.003 72 h 0.813±0.023 0.679±0.023 7.168 0.002

圖1 miR-92b-3p在結直腸癌組織及癌旁正常組織中的表達

圖2 miR-92b-3p和FBXW7可能結合位點

圖3 熒光素酶活性比較

表2 NC組與FBXW7過表達組細胞OD值比較（±s）

表2 NC組與FBXW7過表達組細胞OD值比較（±s）

組別NC FBXW7過表達組t P 24 h 0.298±0.021 0.242±0.019 3.419 0.027 48 h 0.613±0.024 0.455±0.036 6.261 0.003 72 h 0.775±0.030 0.541±0.049 7.061 0.002

表3 NC組、blank組、miR-92b-3p inbibitror組與Inbibitror+siRNA組細胞OD值比較（±s）

表3 NC組、blank組、miR-92b-3p inbibitror組與Inbibitror+siRNA組細胞OD值比較（±s）

與NC組相比，*P＜0.05；與blank組相比，△P＜0.05；與inhibitor組相比，▲P＜0.05。

組別NC blank inbibitror inbibitror+siRNA F P 24 h 0.246±0.022 0.312±0.020*0.251±0.019△0.250±0.019△7.655 0.010 48 h 0.658±0.031 0.662±0.036 0.376±0.045*△0.533±0.051*△▲31.756＜0.001 72 h 0.868±0.053 0.898±0.054 0.456±0.039*△0.708±0.039*△▲56.104＜0.001

通過與靶基因3’-UTR直接結合，miRNA可以抑制細胞增殖和轉(zhuǎn)移相關信號通路關鍵基因的表達［11］。為了探討miR-92b-3p促進結直腸癌發(fā)生發(fā)展的機制，通過生物信息學方法對miR-92b-3p的靶基因進行預測，發(fā)現(xiàn)FBXW7可能是miR-92b-3p的靶基因，并經(jīng)雙熒光素酶報告基因法進行驗證FBXW7可與miR-92b-3p靶向結合。FBXW7基因是F-box蛋白家族成員之一，其作為S期激酶相關蛋白1、Cullin1、F-box蛋白E3連接酶復合物的底物識別亞基，它可以降解促進細胞增殖、生長及調(diào)節(jié)細胞凋亡的多種腫瘤蛋白［12］。鑒于FBXW7降解癌蛋白的功能，F(xiàn)BXW7被認為是一種腫瘤抑制基因，它的表達缺失可以阻止細胞分裂和干細胞分化，增強染色體不穩(wěn)定性，并可導致造血細胞腫瘤的形成［13-14］。既往研究發(fā)現(xiàn)FBXW7在肝癌、肺癌及胰腺癌等多種惡性中低表達，也包括結直腸癌［15-16］。含有FBXW7錯義突變的轉(zhuǎn)移性結直腸癌患者與含有野生型FBXW7的患者相比，其總體生存時間較短［17］，并且結直腸癌患者FBXW7的表達缺失還與奧沙利鉑的耐藥有關［18］。本研究發(fā)現(xiàn)在HCT116細胞中過表達FBXW7對HCT116細胞增殖能力有影響，說明FBXW7可發(fā)揮抑癌基因的作用。為了探討miR-92b-3p是否通過FBXW7調(diào)控HCT116細胞增殖，設置blank、NC、miR-92b-3p inbibitror組及miR-92b-3p inbibitror+FBXW7 siRNA組，發(fā)現(xiàn)相對于blank和NC組，miR-92b-3p inbibitror組HCT116細胞OD值下降，但是在miR-92b-3p inbibitror+FBXW7 siRNA組較miR-92b-3p inbibitror組HCT116細胞OD值有所提升，提示沉默F(xiàn)BXW7能夠部分逆轉(zhuǎn)miR-92b-3p下調(diào)引起的增殖能力下降，miR-92b-3p可能通過FBXW7發(fā)揮調(diào)控作用。

綜上所述，miR-92b-3p在結直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中起到促癌基因的作用，其可能通過調(diào)控FBXW7影響結直腸癌細胞的增殖，其具體作用機制需要進一步的研究。