朱麗晨，阮國添，馬輝，廖錫文，廖存，閆嶺，龔藝貞△

1 廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 廣西南寧 530021

2 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院結(jié)直腸肛門外科 廣西南寧 530021

3 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科 廣西南寧 530021

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是世界上最常見的惡性腫瘤之一［1］。根據(jù)2018年全球癌癥數(shù)據(jù)報道，全球2018年發(fā)生的新發(fā)癌癥病例超過180萬例，死亡人數(shù)為881 000例，近十年來中國的結(jié)直腸癌的發(fā)生率和死亡率均有上升趨勢［2］。結(jié)腸腺癌（colon adenocarcinoma，COAD）是結(jié)直腸癌最常見的病理類型之一（約占95%）［3］。然而目前現(xiàn)有的結(jié)腸腺癌的治療手段（包括手術(shù)和化療等綜合治療）仍然不能達到令人滿意的效果，結(jié)腸腺癌的五年生存率依然不容樂觀［4］。大部分患者發(fā)現(xiàn)和初診為結(jié)腸腺癌時已處于癌癥晚期，因此，現(xiàn)階段的醫(yī)療診治過程中晚就診、缺乏可靠的生物標(biāo)志物和不精準的治療靶點已成為治療結(jié)腸腺癌的主要障礙［5］，而早期診斷和治療對于改善患者的預(yù)后和生活質(zhì)量至關(guān)重要。本研究從TCGA數(shù)據(jù)庫下載相關(guān)數(shù)據(jù)，運用生物信息學(xué)技術(shù)分析和預(yù)測NMB基因?qū)Y(jié)腸腺癌的潛在的診斷和預(yù)后應(yīng)用價值，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

從The Cancer Genome Atlas（TCGA：https://tcga-data.nci.nih.gov/，訪問時間：2018年12月29日)［6-7］公共數(shù)據(jù)庫下載有關(guān)神經(jīng)調(diào)節(jié)肽B基因（neuromedin B，NMB）的mRNA測序數(shù)據(jù)集及與之相一致的患者臨床參數(shù)資料。根據(jù)NMB基因表達量的中位數(shù)進行分組，分為高表達組和低表達組，然后通過整合的數(shù)據(jù)進行相關(guān)的診斷性和預(yù)后分析研究，另外我們還從公共網(wǎng)絡(luò)平臺Gene Expression Profiling Interactive Analysis（GEPIA：http://gepia.cancerpku.cn/index.html，訪問時間：2019年6月29日）［8-9］下載與NMB基因相關(guān)的表達量箱式圖和TNM分期小提琴圖。

1.2 統(tǒng)計學(xué)方法

選用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行處理，t檢驗用于分析癌組織和癌旁正常組織中NMB基因的差異表達；單因素Kaplan-Meier生存分析用于獲得單因素P值（Log-rankP），單因素COX回歸模型用于獲得單因素風(fēng)險比（Hazard Ratio，HR）及95%置信區(qū)間 （95%confidence interval，95%CI），單因素生存分析有統(tǒng)計學(xué)意義的臨床參數(shù)進行校正后納入多因素COX回歸模型用于分析臨床參數(shù)與COAD生存預(yù)后的關(guān)系。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。通過GraphPad Prism 8.0.1軟件獲得癌組織和癌旁正常組織中NMB基因差異表達小提琴圖、診斷性ROC曲線圖和生存曲線圖。

2 結(jié)果

2.1 NMB基因在癌組織及癌旁正常組織的表達

從TCGA公共數(shù)據(jù)庫收集了456例COAD患者（其中包括480例癌組織和41例癌旁正常組織）的NMB基因的mRNA測序數(shù)據(jù)和與之相一致的臨床資料，然后將兩者進行整合，排除重復(fù)項和生存時間為0的患者，最后納入438例癌組織樣本和41例癌旁正常組織樣本，癌組織中mRNA表達量為（259.216±177.439），高于癌旁正常組織中的mRNA表達量（64.336±22.301），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0001），見圖1A。然后從GEPIA公共網(wǎng)絡(luò)平臺下載了NMB基因的表達量的箱式圖（圖1B）,由圖可見，NMB基因在癌組織中的中位表達量高于癌旁正常組織，與本文數(shù)據(jù)分析趨勢相一致，提示NMB基因在癌組織異常高表達。

2.2 NMB基因的診斷價值

以NMB基因mRNA在癌旁組織及癌旁正常組織中表達量繪制診斷性ROC曲線，結(jié)果表明NMB基因在結(jié)腸腺癌中有高診斷價值（P＜0.0001,AUC=0.976,95%CI:0.963～0.990）。見圖1C。

2.3 NMB基因表達與COAD總生存時間之間的關(guān)系

將臨床參數(shù)年齡，性別和TNM分期進行單因素Kaplan-Meier生存分析，結(jié)果提示年齡和性別與COAD患者的總生存時間（overall suvival）無關(guān)（P＞0.05），而TNM分期與COAD患者的總生存時間有關(guān)（P＜0.01）。校正TNM分期后進行多因素Cox回歸分析結(jié)果表明NMB基因表達與COAD患者的總生存時間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（AdjustedP=0.007，AdjustedHR=1.778，95%CI:1.167～2.710），見表 1。根據(jù)NMB基因表達量的高低繪制的生存曲線結(jié)果表明NMB基因低表達的COAD患者總生存時間長于高表達者（P=0.017），見圖1D。此外，從GEPIA網(wǎng)站下載在COAD患者NMB基因表達水平的病理分期圖，研究NMB基因與TNM分期和預(yù)后生存之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)NMB基因表達水平與TNM分期之間無相關(guān)性（P＞0.05），見圖1E。變量賦值：以生存狀態(tài)（“生存”賦值0，“死亡”賦值1）為因變量，分別以性別（“男”賦值1，“女”賦值2）、年齡（“≤65歲”賦值1，“＞65歲”賦值2）、TNM分期（“Ⅰ期”賦值1，“Ⅱ期”賦值2，“Ⅲ期”賦值3，“Ⅳ期”賦值4）以及NMB基因表達量（“低表達”賦值1，“高表達”賦值2）為自變量對影響COAD的因素進行單因素和多因素COX回歸模型分析。

圖1 NMB基因在COAD患者癌組織和癌旁正常組織中表TNM達情況及其在COAD患者癌組織中診斷價值分析、生存分析及與TNM分期的關(guān)系

表1 臨床參數(shù)與COAD患者預(yù)后關(guān)系的分析結(jié)果

3 討論

癌癥的發(fā)生和發(fā)展是機體內(nèi)外多種因素調(diào)控的，內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)對于維持細胞正常的代謝和凋亡至關(guān)重要［10-11］。結(jié)腸腺癌是一種由基因調(diào)控的癌癥,癌基因的激活和抑癌基因的失活對于癌癥的發(fā)生發(fā)展尤為關(guān)鍵，但是目前與結(jié)腸腺癌有關(guān)的腫瘤標(biāo)志物研究比較少。NMB是鈴蟾肽樣的神經(jīng)肽家族成員之一，它最早是一種從兩棲類動物皮膚分離出來的十四肽［12-13］。NMB可以通過激活它的高親和力受體，在平滑肌收縮、外分泌與內(nèi)分泌分泌、炎癥和癌癥中發(fā)揮多種生理和病理功能［14-15］。有研究報道，NMB基因可調(diào)節(jié)包括肺癌［16］、結(jié)腸癌［17］和神經(jīng)膠質(zhì)瘤［18］在內(nèi)的幾種癌細胞系中的腫瘤細胞增殖，此外NMB還通過其受體在腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用［19］。

在Matusiak等［17］在基因?qū)用嫔线\用RT-qPCR技術(shù)在結(jié)腸癌細胞系Caco-2、HT-29細胞，以及正常結(jié)腸上皮細胞NCM-460細胞中驗證NMB基因的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NMB在腸癌細胞系中的表達量高于正常結(jié)腸上皮；此外，免疫組化的結(jié)果也顯示NMB在腸癌細胞系中的表達量高于正常結(jié)腸上皮；且增值試驗中發(fā)現(xiàn)NMB高表達會促進細胞增殖。Park等［20］從Gene Expression Omnibus（GEO）數(shù)據(jù)庫中下載和分析28例乳腺癌組織和5例正常乳腺組織樣本的NMB-R mRNA的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)前者的表達水平高于后者的；此外，研究還發(fā)現(xiàn)NMB-R的抑制劑PD168368可以降低MDA-MB-231乳腺癌細胞的遷移和侵襲能力，抑制了乳腺癌上皮間轉(zhuǎn)化。類似的結(jié)果也可以在非小細胞肺癌中發(fā)現(xiàn)［21］。本文的研究發(fā)現(xiàn)NMB基因在結(jié)腸腺癌組織中的表達高于癌旁正常組織，診斷性ROC曲線表明NMB基因有較高的診斷價值，并且生存析結(jié)果發(fā)現(xiàn)低表達的NMB基因提示有更好的預(yù)后，反之則增加結(jié)腸腺癌的死亡風(fēng)險。

綜上所述，NMB在結(jié)腸腺癌診斷和預(yù)后中有較高的價值，可能是一個潛在的生物學(xué)標(biāo)志物，但是仍需要進一步的體內(nèi)外研究證實。