廖存，廖錫文，韋瑞麗，黃偉，龔藝貞，馬輝△

1 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院結(jié)直腸肛門外科 廣西南寧 530021

2 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科 廣西南寧 530021

直腸癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病機(jī)制被認(rèn)為與環(huán)境、遺傳因素雙重作用驅(qū)動有關(guān)。對直腸癌進(jìn)行全基因組測序有助于提高對直腸癌發(fā)病分子機(jī)制的認(rèn)識，了解其遺傳學(xué)上的變異，以期對直腸癌的診斷、預(yù)防、監(jiān)測和靶向治療上帶來一定幫助。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，多種癌癥在基因組層面上的變異被逐漸揭露，并繪制成癌癥相關(guān)的全基因組圖譜。越來越多的高通量測序相關(guān)的基因組研究揭示了包括腫瘤在內(nèi)的遺傳相關(guān)疾病的基因組變異和遺傳機(jī)制，同時，這些高通量測序數(shù)據(jù)被開放獲取分享在開源數(shù)據(jù)庫中供其他研究者使用。癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）是美國癌癥研究所和美國人類基因組研究所合作開展的一個癌癥基因組項目，該項目包含了包括33種癌癥、超過一萬個癌癥樣本的全基因組多組學(xué)高通量測序數(shù)據(jù)，并分享在其門戶網(wǎng)站中供全球研究者無限制的開放獲取和利用［1］。本研究的目的是采用TCGA的直腸癌全基因組RNA測序數(shù)據(jù)和基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）方法，通過比較癌組織與癌旁組織的全基因組數(shù)據(jù)集探索直腸癌相關(guān)發(fā)病機(jī)制，現(xiàn)報告如下。

1 材料和方法

1.1 倫理審批

由于本研究的所有數(shù)據(jù)均來源于TCGA門戶網(wǎng)站（https://portal.gdc.cancer.gov），而納入TCGA的所有樣本均獲得患者的知情同意并通過相應(yīng)的倫理審批，且TCGA所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)已開源發(fā)布在其門戶網(wǎng)站上，并無限制允許研究者對這些數(shù)據(jù)進(jìn)行二次挖掘和使用（https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga/using-tcga/citingtcga）。同時，本研究未涉及人體或動物相關(guān)的實驗操作，因此，本研究無需額外的倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 數(shù)據(jù)下載與預(yù)處理

本研究納入的直腸癌全基因組RNA測序數(shù)據(jù)集從TCGA門戶網(wǎng)站下載，共獲得177個直腸癌患者樣本的Level 3 RNA測序數(shù)據(jù)集（Workflow Type:HTSeq-Counts），其中癌旁正常組織10個，癌組織167個［2］。原始的RNA測序數(shù)據(jù)集經(jīng)DESeq軟件包在R平臺中進(jìn)行歸一化［3］，歸一化后共獲得包含17 541個編碼基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)集用于后續(xù)分析。

1.3 基因集富集分析

基因集富集分析的軟件（gsea2-2.2.3.jar）和對照基因集從GSEA官網(wǎng)下載（http://software.broadinstitute.org/gsea/index.jsp）［4-5］，以癌組織與癌旁正常組織作為表型分組依據(jù)。從GSEA網(wǎng)站的Molecular Signatures Database（MSigDB）中選取c2（Curated gene sets：c2.all.v6.2.symbols.gmt）和c5 ［Gene ontology(GO)gene sets:c5.all.v6.2.symbols.gmt］作為對照基因集用于直腸癌發(fā)病機(jī)制的探索［6］。GSEA設(shè)置如下：Expression dataset選擇輸入歸一化后的直腸癌全基因組RNA測序數(shù)據(jù)集；Gene sets database分別選取c2和c5對照基因集；Number of permutations設(shè)為1000；Phenotype labels設(shè)為癌vs.癌旁；Collapse dataset to gene symbols選False;Permutation type選Phenotype。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

GSEA分析中的FDR的計算根據(jù)Benjamini-Hochberg程序進(jìn)行多次計算得到［7］。GSEA分析結(jié)果滿足錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）＜0.25，|Normalized Enrichment Score(NES)|＞1 和 NominalPvalue＜0.05視為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 癌組織與癌旁正常組織在c2富集分析結(jié)果的比較

在c2富集分析結(jié)果中，在癌組織表型分組中獲得170條差異具有統(tǒng)計學(xué)意義的基因集，在癌旁正常組織表型中則獲得341條（圖1A）。在癌組織表型的c2富集分析結(jié)果提示直腸癌發(fā)病可能參與以下通路機(jī)制：細(xì)胞周期通路（cell cycle，圖1B），核轉(zhuǎn)錄因子κB信號通路【nuclear factor-kappa B(NF-κB)signaling pathway，圖1C】，DNA修復(fù)（DNA repair，圖1D），DNA復(fù)制（DNA replication，圖1E），同時癌與癌旁之間比較可以富集到既往結(jié)直腸癌研究中上調(diào)的基因集 （colon and rectal cancer up，http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb/cards/GRADE_CO -LON_AND_RECTAL_CANCER_UP，圖1F）。

2.2 癌組織與癌旁正常組織在c5富集分析結(jié)果的比較

在c5富集分析結(jié)果中，在癌組織表型分組中獲得151條差異具有統(tǒng)計學(xué)意義的基因集，在癌旁正常組織表型中則獲得710條（圖2A）。在癌組織表型的c5富集分析結(jié)果提示直腸癌發(fā)病可能參與以下生物學(xué)功能：DNA復(fù)制（DNA replication,圖2B），有絲分裂細(xì)胞周期檢查點（mitotic cell cycle checkpoint，圖 2C），DNA 修復(fù) （DNA repair，圖 2D），DNA損傷檢查點（DNA damage checkpoint，圖2E），錯配修復(fù)（mismatch repair，圖2F）。

圖1 基于癌組織與癌旁正常組織全基因組表達(dá)譜數(shù)據(jù)集以c2作為對照基因集的GSEA富集分析結(jié)果

3 討論

傳統(tǒng)的富集分析是通過對比不同分組或表型之間的全基因組數(shù)據(jù)集，通過設(shè)定指定的閾值進(jìn)行差異表達(dá)基因的篩選，隨后通過利用差異表達(dá)基因通過基因本體論（gene ontology，GO）術(shù)語和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）等基因功能注釋軟件進(jìn)行基因集功能富集。但是這一篩選方法存在一定的缺陷，閾值的設(shè)定具有一定主觀性和局限性，同時可能令接近設(shè)定閾值但具有重要意義的基因被排除在富集分析之外。而GSEA富集分析方法則避免了傳統(tǒng)富集分析方法設(shè)定閾值的問題，將全基因組數(shù)據(jù)均納入富集分析。

圖2 基于癌組織與癌旁組織全基因組表達(dá)譜數(shù)據(jù)集以c5作為對照基因集的GSEA富集分析結(jié)果

本研究GSEA富集分析發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期、DNA復(fù)制這兩個維持細(xì)胞增殖的兩個基本生物學(xué)過程在直腸癌組織中被顯著富集到，提示在直腸癌組織中細(xì)胞周期和DNA復(fù)制這兩個細(xì)胞基本狀態(tài)的生物學(xué)過程失調(diào)，其與腫瘤的發(fā)生有關(guān)，而抑制該兩個生物學(xué)過程則可能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。惡性腫瘤的發(fā)生與腫瘤基因組異常有關(guān)，譬如DNA損傷和修復(fù)過程失調(diào)，直腸癌的發(fā)生同樣被認(rèn)為存在相同的機(jī)制［8］。本研究GSEA分析發(fā)現(xiàn)直腸癌組織中DNA損傷檢查和DNA修復(fù)生物學(xué)過程和通路被顯著富集到，提示腫瘤組織的DNA損傷和修復(fù)異常，與腫瘤發(fā)生有一定聯(lián)系。Reilly等［9］的研究也發(fā)現(xiàn)DNA損傷反應(yīng)和修復(fù)相關(guān)的基因可驅(qū)動結(jié)直腸癌的發(fā)生，同時他們的研究還提示靶向替代DNA修復(fù)機(jī)制的治療可以改善結(jié)直腸癌患者的預(yù)后。此外，有研究還表明錯配修復(fù)相關(guān)基因可預(yù)測直腸癌術(shù)前放療的反應(yīng)率［10-11］。NF-κB信號通路在直腸癌預(yù)后預(yù)測和放化療的療效反應(yīng)中起重要作用［12-14］。Voboril等［12］研究發(fā)現(xiàn)總高水平的NF-κB/p65亞基可能與更具侵襲性的腫瘤特征，更高的腫瘤轉(zhuǎn)移潛能和縮短的總生存期相關(guān)，但它與對（化療）放療的抵抗無關(guān)。Dzhugashvili等［13］研究發(fā)現(xiàn)坐落于NF-κB通路中的NFKB1基因的rs28362491的基因型與直腸癌化療后的病理反應(yīng)相關(guān)。在Berardi等［14］的研究中，通過免疫組化檢測NF-κB的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)直腸癌癌組織中NF-κB免疫組化表達(dá)陽性的患者總體生存時間顯著較陰性患者短，且中位進(jìn)展時間明顯縮短。O’Neil等［15］發(fā)現(xiàn)NF-κB p50高表達(dá)的直腸癌患者其預(yù)后較差，通過關(guān)聯(lián)分析推測出NF-κB在直腸癌中起關(guān)鍵作用可能是其參與腫瘤的轉(zhuǎn)移，而不是對放化療的抵抗。本研究通過全基因組GSEA分析也發(fā)現(xiàn)NF-κB信號通路在直腸癌腫瘤的發(fā)生中扮演一定的角色。本研究具有一定的局限性需要說明。第一，納入本研究的癌旁樣本量較少；第二，本研究數(shù)據(jù)來源于單一數(shù)據(jù)庫，缺乏基礎(chǔ)實驗驗證，本研究產(chǎn)生的結(jié)果還有待進(jìn)一步實驗確認(rèn)。盡管存在上述局限性，但本研究的結(jié)果仍可為直腸癌發(fā)病機(jī)制的研究提供一定的理論依據(jù)。

綜上所述，本研究利用TCGA直腸癌隊列的癌組織與癌旁正常組織全基因組RNA測序數(shù)據(jù)集進(jìn)行GSEA富集分析發(fā)現(xiàn)，直腸癌的發(fā)病機(jī)制可能參與調(diào)控細(xì)胞周期、DNA修復(fù)、DNA復(fù)制等生物學(xué)過程和NF-κB等信號通路，提示直腸癌發(fā)病機(jī)制可能涉及細(xì)胞基本狀態(tài)的調(diào)控。