孫艷　陳紹仁　蔣瑞雪　劉繼鑫　孫艷宏 姚淑娟　呂麗艷　張春晶

【摘要】 目的：探討Zebularine對乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231細(xì)胞增殖和SARI表達(dá)的影響。

方法：選用MDA-MB-231細(xì)胞株，分別通過不同濃度的Zebularine作用細(xì)胞株24 h后收集細(xì)胞，運(yùn)用MTT法測定Zebularine對乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231細(xì)胞的增殖;通過Western Blot檢測Zebularine對乳腺癌細(xì)胞株SARI的表達(dá)。結(jié)果：隨著藥物濃度的增加，Zebularine能夠明顯抑制乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231的增殖（P<0.05），Zebularine能夠顯著提高乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231 SARI蛋白的表達(dá)（P<0.05）。結(jié)論：Zebularine通過抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)SARI蛋白的表達(dá)，從而發(fā)揮腫瘤抑制作用。

【關(guān)鍵詞】 Zebularine; 乳腺癌; SARI; 增殖

【Abstract】 Objective：To investigate the effect of Zebularine on the proliferation and SARI expression of human breast cancer cell line MDA-MB-231.Method：MDA-MB-231 cell line were cultured in vitro and treated with different doses Zebularine for 24 hours.MTT method was used to detect the cell proliferation，and western blot was used to detect the expression of SARI in human breast cancer cell line MDA-MB-231.Result：Different doses Zebularine could significantly inhibit the proliferation of human breast cancer cell line MDA-MB-231 with the increase of drug concentration（P<0.05）.Zebularine could obviously reduced the expression of SARI in human breast cancer cell line MDA-MB-231（P<0.05）.Conclusion：Zebularine might inhibit the proliferation，improve the expression of SARI，then inhibit the malignant proliferation of tumor cells，then exerting tumor inhibitory effect.

【Key words】 Zebularine; Breast cancer; SARI; Proliferation

First-authors address：School of Medicine and Technology，Qiqihar Medical University，Qiqihar 161000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.13.007

乳腺癌是我國女性常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率位居女性惡性腫瘤第一位，我國每年被確診為乳腺癌的患者約有160萬左右，而因乳腺癌死亡的患者超過120萬[1]。SARI（suppressor of AP-1 regulated by IFN）又名BATF2，其在星形膠質(zhì)細(xì)胞、黑色素細(xì)胞、乳腺細(xì)胞以及前列腺上皮細(xì)胞等多種正常組織細(xì)胞中均有表達(dá)，但在對應(yīng)的腫瘤組織細(xì)胞中低表達(dá)或表達(dá)缺失[2]。研究發(fā)現(xiàn)，啟動子DNA甲基化是腫瘤細(xì)胞中抑癌基因表達(dá)下調(diào)或者失活的主要機(jī)制之一，因此去甲基化藥物在治療腫瘤方面具有廣闊的臨床前景。5-氮雜-2-脫氧胞苷是傳統(tǒng)的去甲基化藥物，主要用于惡性腫瘤的臨床治療，但其具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性和致突變性，患者不良反應(yīng)嚴(yán)重。而Zebularine是一種新型去甲基化藥物，其成分為胞苷類似物，與傳統(tǒng)的去甲基化藥物5-氮雜-2-脫氧胞苷相比，具有高效低毒等特性，對于腫瘤細(xì)胞選擇性高并且能夠提高放化療敏感性[3-4]。本研究以人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株作為研究對象，應(yīng)用MTT法和Western Blot等技術(shù)觀察Zebularine對乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖和SARI蛋白表達(dá)的影響?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231（購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所）。儀器和試劑：酶標(biāo)儀（瑞士帝肯公司）、電子天平（梅特勒-托利多公司）、高壓滅菌鍋（上海三申醫(yī)療器械有限公司）、低溫離心機(jī)（德國eppendorf公司）、MTT和Zebularine（購于Sigma公司）、SARI抗體（購于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）、GAPDH抗體（購于CST公司）、羊抗兔二抗（購于Abcam公司）、L15培養(yǎng)基和胎牛血清（購于Hyclone公司）、胰蛋白酶（購于賽默飛世爾公司）、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板和6孔細(xì)胞培養(yǎng)板（購于Axygen公司）、DMSO（購于索萊寶公司）。

1.2 方法 細(xì)胞培養(yǎng)：將凍存的MDA-MB-231細(xì)胞于-80 ℃中取出，放入37 ℃水浴鍋中順時針滑動使之解凍，將解凍后的MDA-MB-231細(xì)胞液移入15 mL離心管中，并加入9 mL培養(yǎng)基，800 rpm離心3 min，棄去上清液，加入10%胎牛血清L15培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，放入60 mm培養(yǎng)皿中于5%二氧化碳、37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。藥物處理：將Zebularine溶于完全培養(yǎng)基中分別制成25、50、100、200、400 μmol/L五個濃度的工作液。MTT法檢測細(xì)胞增殖96孔板每孔鋪5000個細(xì)胞，加入100 μL培養(yǎng)液，培養(yǎng)于5%二氧化碳、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中24 h，向每孔加入20 μL MTT溶液，孵育4 h，用酶標(biāo)儀在490 nm處測定OD值，繪制細(xì)胞生長曲線。蛋白提?。海?）棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗2次，再加入1 mL PBS，用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮起并收集到1.5 mL離心管中，2 000 r/min離心5 min，棄去上清再加入1 mL PBS，再次離心，棄去上清。（2）將蛋白沉淀置于冰上并加入200 μL RIPA裂解液（加入1%蛋白酶抑制劑），每隔5分鐘渦旋一次，渦旋6次后于4℃ 12 000 r/min離心10 min。（3）將上清移入新的1.5 mL EP管中，采用BCA蛋白定量試劑盒測定各樣品蛋白濃度。（4）測定濃度后按照1︰3的比例加入4×蛋白上樣緩沖液，混勻后于100 ℃水浴鍋中加熱10 min，取出放置至室溫后保存于-80 ℃。Western Blot檢測SARI表達(dá)：

（1）提前配置12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠，上樣后，設(shè)置電壓為70 V 30 min，待樣品通過濃縮膠后將電壓改為110 V 1 h，溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)凝膠底部終止電泳。（2）取出凝膠，依據(jù)Marker指示，將目的蛋白所在位置凝膠切下來與PVDF膜制成“轉(zhuǎn)膜三明治”，放入轉(zhuǎn)模槽中100 V電壓轉(zhuǎn)膜2 h。（3）轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜取出放置于5%脫脂奶粉封閉過夜。（4）將目的蛋白抗體用1×TBST溶液按照1︰1 000的比例稀釋，用PVDF膜放入雜交袋中于37℃孵育4 h，1×TBST溶液洗膜3次（10 min/次）后再將PVDF膜用二抗室溫孵育45 min。（5）1×TBST洗膜3次（10 min/次），將ECL顯影劑A、B液按照1︰1比例混合配置并滴加在PVDF膜上，應(yīng)用Biorad凝膠成像系統(tǒng)曝光成像并拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 21.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Zebularine對乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響 MTT法檢測不同濃度（0，25，50，100，200，400 μmol/L）Zebularine對乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231細(xì)胞作用48 h后，其抑制率分別為0、（17.34±1.70）%、（24.58±3.20）%、（36.79±2.50）%、（57.54±3.40）%、（71.21±4.10）%，各濃度間進(jìn)行兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖1。

2.2 Zebularine對乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231 SARI蛋白的表達(dá)的影響 Western Blot 檢測不同濃度Zebularine處理乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231 SARI蛋白的表達(dá)，以GAPDH作為內(nèi)參，運(yùn)用Image J軟件對SARI蛋白灰度值進(jìn)行分析，不同濃度Zebularine（0、50、100、200 μmol/L）分別處理MDA-MB-231細(xì)胞48 h，SARI蛋白灰度值分別為（51.15±10.78）、（157.70±21.32）、（185.22±25.76）、（219.74±31.25），與0 μmol/L?Zebularine比較，Zebularine不同濃度處理MDA-MB-231細(xì)胞后SARI蛋白表達(dá)均升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖2。

3 討論

腫瘤已經(jīng)成為嚴(yán)重危害人類健康的惡性疾病之一，2017年我國新發(fā)癌癥病例已經(jīng)高達(dá)350萬例，約占全球范圍新發(fā)病例的四分之一[5]。乳腺癌是女性常見惡性腫瘤之一，從全球范圍來看，女性乳腺癌的整體發(fā)病率呈現(xiàn)逐年升高的趨勢[6]。2018年發(fā)布的《Cancer Statistics，2018》一文中預(yù)計美國新發(fā)乳腺癌病例數(shù)占新發(fā)癌癥的30%，位居第一，高出第二的肺癌8%，預(yù)計死于乳腺癌的人數(shù)占比14%，位居第二[7]。2015年國家癌癥中心統(tǒng)計的數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌無論從發(fā)病率還是病死率都已經(jīng)排在了城市女性惡性腫瘤之首，預(yù)計到2030年新發(fā)乳腺癌病例將達(dá)到23.4萬例/年以上，死于乳腺癌的女性或超過7萬人，病死率提高到47.94%[8-9]。

抑癌基因啟動子甲基化能夠?qū)е乱职┗虻谋磉_(dá)減少或者失活，誘導(dǎo)細(xì)胞癌變，是現(xiàn)階段研究腫瘤發(fā)生機(jī)制的熱點之一。DNA甲基化是通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltrransferases，DNMTs）來實現(xiàn)的，而去甲基化藥物能夠抑制DNMTs酶活性，使抑癌基因啟動子DNA去甲基化，恢復(fù)抑癌基因表達(dá)，最終達(dá)到治療腫瘤的目的[10]。5-氮雜-2-脫氧胞苷是傳統(tǒng)的去甲基化藥物，是一種特異性的DNMTs抑制劑，在臨床上主要用于惡性腫瘤的治療，但因其具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性和致突變性限制了其臨床應(yīng)用[11]。而Zebularine是一種新型去甲基化藥物，它也通過抑制DNMTs酶活性發(fā)揮作用，它與傳統(tǒng)的去甲基化藥物相比，具有高效低毒等特性，對于腫瘤細(xì)胞選擇性高并且能夠提高放化療敏感性[12]。研究表明，Zebularine能夠抑制DNMT對P16、P21、P53等基因的甲基化作用，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡[13-15]。熊輝等[16]研究顯示，Zebularine能夠抑制膽管癌細(xì)胞系QBC939細(xì)胞增殖，通過下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl2表達(dá)，上調(diào)促凋亡蛋白Bax表達(dá)促進(jìn)QBC939細(xì)胞凋亡。丁佑銘等[17]通過研究也發(fā)現(xiàn)，Zebularine能夠抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖，并且呈劑量和時間依賴性，Zebularine還能夠通過改變線粒體膜電位，下調(diào)Bcl2表達(dá)，上調(diào)Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9和Bax的表達(dá)促進(jìn)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡。本研究通過MTT實驗發(fā)現(xiàn)，不同濃度（0，25，50，100，200，400 μmol/L）的Zebularine對乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231細(xì)胞作用48 h后，能夠明顯抑制乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231的生長，并且其抑制作用隨著濃度的增加而增強(qiáng)，說明Zebularine對乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231體外抑制作用明顯，能夠顯著抑制乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231的增殖，從而達(dá)到抑制腫瘤的目的。

SARI基因于2008年被Su等[18]發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因，由247個氨基酸殘基構(gòu)成，其又被稱作BATF-2。有報道顯示SARI基因在結(jié)直腸癌、肺癌、前列腺癌、肝癌、食管癌等癌癥組織中的表達(dá)均低于與其相對應(yīng)的癌旁或正常組織[19-22]。在多種正常細(xì)胞中也檢測到SARI能夠穩(wěn)定表達(dá)，而且在對應(yīng)的腫瘤細(xì)胞中并未檢測到其表達(dá)，說明SARI與腫瘤發(fā)生發(fā)展存在著密切的關(guān)系。Zhang等[23]利用AG490對乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231進(jìn)行處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AG490能夠通過上調(diào)SARI的表達(dá)抑制細(xì)胞增殖。王平等[24]研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)SARI能夠顯著抑制人白血病K562細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，SARI蛋白在乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231中低表達(dá)，不同濃度（0，50，100，200 μmol/L）的Zebularine能夠顯著抑制乳腺癌MDA-MB-231中SARI蛋白的表達(dá)，說明Zebularine可以通過抑制SARI蛋白在乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231中的表達(dá)，從而抑制乳腺癌的發(fā)生發(fā)展[25]。

綜上所述，Zebularine作為一種毒副作用較小的甲基化抑制劑，能夠在體外抑制乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231細(xì)胞的增殖，促進(jìn)SARI蛋白的表達(dá)，但其具體的作用機(jī)制和在體內(nèi)抗乳腺癌的作用還需要深入研究[26-27]。

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（收稿日期：2018-12-27） （本文編輯：周亞杰）