黃藍(lán)儀， 陳 瑤， 吳 鵬， 梁延華， 李 敏， 邢德剛

( 廣東藥科大學(xué)， 廣東 廣州 510006)

目前，惡性腫瘤的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[1-2]，全球每年腫瘤新增患者數(shù)量亦在不斷增加，增加治愈率、延長(zhǎng)患者壽命及減輕患者痛苦是醫(yī)療工作者共同追求的目標(biāo)，科研工作者們?yōu)閷ふ腋咝?、毒副作用小、抗腫瘤普廣的抗腫瘤藥物不懈奮斗。順鉑是臨床化療首選藥物，但是在應(yīng)用順鉑過(guò)程中,人體出現(xiàn)了一系列嚴(yán)重的不良反應(yīng)，長(zhǎng)期應(yīng)用也可出現(xiàn)明顯的耐藥性，這些都對(duì)鉑類抗腫瘤藥物的廣泛使用造成了束縛。近年來(lái)，抗腫瘤活性強(qiáng)、抗腫瘤譜廣且毒副作用小的新金屬類抗腫瘤藥成為了研究熱點(diǎn)。

釕元素具有與鉑類金屬類似的理化特性，但毒副作用更低，被認(rèn)為經(jīng)過(guò)適當(dāng)結(jié)構(gòu)修飾后最具前途的抗腫瘤藥物之一。NAMI-A及KP1019 2個(gè)釕配合物成功進(jìn)入臨床試驗(yàn)，更是激發(fā)了人們對(duì)釕金屬的極大研究熱情[3]。近年來(lái)，釕多吡啶配合物抗腫瘤活性的研究引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注，很多研究結(jié)果表明釕多吡啶配合物對(duì)多種腫瘤細(xì)胞活性有明顯的抑制作用。我們課題組在前期工作中，觀察了多種新合成釕多吡啶配合物的抗腫瘤活性[4-6]。本實(shí)驗(yàn)將在原有工作基礎(chǔ)上，新合成釕多吡啶配合物[Ru(phen)2(taptp)](ClO4)2(簡(jiǎn)稱Ru1)，進(jìn)一步研究其對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞活性抑制率、細(xì)胞數(shù)量及凋亡的影響，所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為釕配合物的研究奠定基礎(chǔ)，為設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)、篩選高效和毒副作用低的金屬類抗腫瘤藥提供寶貴的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞株、主要試劑和儀器

人胃癌SGC-7901細(xì)胞、人宮頸癌Hela細(xì)胞和人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞購(gòu)自武漢大學(xué)細(xì)胞保藏中心。 DMEM 培養(yǎng)基(Gibco)；新生牛血清(杭州四季青生物材料有限公司)；MTT試劑和Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Biosharp)。 MCO-15AC 型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Sanyo)； SW-CJ-1C 型細(xì)胞培養(yǎng)超凈臺(tái)( 蘇州安泰空氣凈化有限公司)； Vrioskan Flash 型 酶 標(biāo) 儀 (Thermo)；BX51 型倒置熒光顯微鏡(Olympus)；C6 型流式細(xì)胞儀(BD)。

2 主要方法

2.1MTT實(shí)驗(yàn)方法 細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同濃度(5、10、20、40、80 μmol/L)的Ru1處理24 h后，棄去各孔培養(yǎng)液，在盡量避光條件下加入MTT溶液，再于培養(yǎng)箱中孵育5 h。培養(yǎng)結(jié)束后，用移液器小心吸去MTT溶液，用排槍向每孔內(nèi)加入150 mL DMSO。將96孔板置于微孔板搖床上振蕩，直至甲臜完全溶解(約10 min左右)，而后將微孔板置于酶標(biāo)儀中，在490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的吸光度(A)值，重復(fù)測(cè)定3次。通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算釕配合物對(duì)各種細(xì)胞的活性抑制率。

2.2結(jié)晶紫染色實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期腫瘤細(xì)胞，洗滌并消化。將細(xì)胞團(tuán)吹打成單細(xì)胞，計(jì)數(shù)，將細(xì)胞密度調(diào)整為5×107/L，充分混勻后，按每孔2 mL的量將細(xì)胞接種于6孔板中。接種結(jié)束后，將6孔板轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。加入含Ru1的培養(yǎng)液，終濃度依次為：10、20和40 μmol/L，每孔加入的量為2 mL，同時(shí)設(shè)立對(duì)照組(只加2 mL培養(yǎng)液)。24 h后，棄去各孔培養(yǎng)液，用4 ℃預(yù)冷的PBS洗2遍，每遍5 min，加入含有150 μmol/L NaCl的4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞30 min；固定結(jié)束后，立即加入800 μL結(jié)晶紫染色液，室溫染色15 min。染色結(jié)束后，用PBS洗滌以洗去過(guò)量的結(jié)晶紫染料。將染色后的6孔板置于室溫下自然風(fēng)干，加入3 mL體積分?jǐn)?shù)為33 %的乙酸溶液以溶解固定細(xì)胞中的結(jié)晶紫，將孔中溶液全部收集至比色皿中，設(shè)定分光光度計(jì)的波長(zhǎng)為550 nm，測(cè)定收集到的各孔乙酸溶液的A值。

2.3細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 在6孔板中以每孔(3～4)×105個(gè)細(xì)胞的量接種所需細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后吸出原來(lái)的培養(yǎng)液，加入終濃度為10、20和40 μmol/L的Ru1的培養(yǎng)液，每孔加入的量為1 mL，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，洗滌、消化制備成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液全部轉(zhuǎn)移到2 mL EP管中離心5 min，棄上清。加入2 mL預(yù)冷的PBS洗1次，離心重懸后再用1×Binding Buffer洗1次，離心棄上清。單細(xì)胞用1×Binding Buffer重懸，向細(xì)胞懸液中加入5 μL AnnexinⅤ-FITC染色液，室溫條件下避光孵育5 min，再直接加入5μL PI染色液(PI：1g/L)。15 min后，細(xì)胞懸液過(guò)300目篩裝入FACS管，即可使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

2.4采用 Western blot技術(shù)檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) 利用RIPA 裂解法提取蛋白，收集細(xì)胞總蛋白進(jìn)行電泳。電泳完成后采用半干法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉室溫下孵育封閉2 h，封閉結(jié)束后，TBST洗滌3遍，每遍5 min，按照抗體說(shuō)明書(shū)稀釋要求，用5%BSA稀釋Ⅰ抗至相應(yīng)的濃度，加入孵育盒中浸沒(méi)NC膜，4 ℃搖床中振蕩過(guò)夜。次日，用TBST洗滌3遍，每遍5 min。用5%脫脂奶粉液稀釋Ⅱ抗至1∶1 000，孵育1 h，采用 ECL 化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯影后壓片，采用相關(guān)圖像分析軟件進(jìn)行圖像分析，測(cè)定灰度值，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參照的相對(duì)比值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 12.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組之間比較采用單因素方差分析 (one-way ANOVA ), 組間兩兩比較采用 SNK-q檢驗(yàn), 以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Ru1對(duì)SGC-7901、Hela和MDA-MB-231細(xì)胞活性抑制率的影響

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, SGC-7901細(xì)胞在經(jīng)5、10、20、40和80 μmol/L Ru1處理24 h后，細(xì)胞活性抑制率分別為：(22.4±1.8)%、(32.5±0.8)%、(46.9±1.6)%、(51.9±0.8)%和(55.8±0.7)%；Hela細(xì)胞在經(jīng)5、10、20、40和80 μmol/L Ru1處理24 h后，細(xì)胞活性抑制率分別為：(9.7±2.2)%、(22.6±4.2)%、(28.9±3.2)%、(33.9±3.9)%和(44.2±1.4)%；MDA-MB-231細(xì)胞在經(jīng)5、10、20、40和80 μmol/L Ru1處理24 h后，細(xì)胞活性抑制率分別為：(9.8±4.9)%、(17.8±3.6)%、(26.1±3.2)%、(31.0±4.3)%和(41.2±1.9)%；繪制的抑制曲線圖見(jiàn)圖1。通過(guò)以上MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知，Ru1對(duì)3種腫瘤細(xì)胞系SGC-7901、Hela和MDA-MB-231均表現(xiàn)出了細(xì)胞活性抑制作用，且這種抑制作用呈劑量依賴性，其中Ru1對(duì)SGC-7901細(xì)胞活性抑制效果最佳。

Figure 1. The inhibition rate of viability in SGC-7901, MDA-MB-231 and Hela cells treatement with different concentrations of Ru1. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group.

圖1 不同濃度釕配合物對(duì)3種腫瘤細(xì)胞活性的抑制率

2 Ru1減少SGC-7901細(xì)胞數(shù)量

本實(shí)驗(yàn)選擇對(duì)Ru1較為敏感的SGC-7901細(xì)胞，經(jīng)一定濃度的配合物處理后，進(jìn)行結(jié)晶紫染色。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著配合物濃度升高，可見(jiàn)孔板中結(jié)晶紫染色變淺，可說(shuō)明孔中細(xì)胞數(shù)減少；經(jīng)33% 乙酸溶液洗脫后，測(cè)定吸光度值，可見(jiàn)吸光度值也隨配合物濃度濃度升高呈下降趨勢(shì)(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

3 Ru1促進(jìn)SGC-7901細(xì)胞凋亡作用

經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)所得散點(diǎn)圖，散點(diǎn)圖由4個(gè)象限的細(xì)胞分布圖組成，每個(gè)象限的代表意義為：左下象限代表活的細(xì)胞，右下象限代表早期凋亡的細(xì)胞，右上象限代表晚期凋亡的細(xì)胞，左上象限表示在處理制備單細(xì)胞過(guò)程中人為造成機(jī)械性壞死的細(xì)胞。早期凋亡率與晚期凋亡率組成單次實(shí)驗(yàn)凋亡率。

凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Ru1(10、20和40μmol/L)作用24 h后可導(dǎo)致SGC-7901細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡,與正常對(duì)照組相比，10、20和40 μmol/L 的Ru1處理組細(xì)胞凋亡率均升高(P<0.05)，見(jiàn)圖3、表2。由結(jié)果表明，Ru1可導(dǎo)致SGC-7901細(xì)胞凋亡，而且這種致凋亡作用呈劑量依賴性。

Figure 2. Crystal violet staining result of SGC-7901 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group.

圖2 SGC-7901細(xì)胞結(jié)晶紫染色形態(tài)圖及吸光度值結(jié)果

4 Ru1上調(diào)Bax蛋白的表達(dá)和下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)

本實(shí)驗(yàn)Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示，Ru1(10、20和40 μmol/L)作用SGC-7901細(xì)胞24 h，與對(duì)照組相比，Bcl-2蛋白的表達(dá)呈下降趨勢(shì)(隨濃度升高而下降)，但Bax蛋白的表達(dá)呈劑量依賴性上調(diào)(P<0.05)。以上結(jié)果提示，Ru1可通線粒體途徑誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞凋亡，見(jiàn)圖4。

討 論

釕元素具有與鉑類金屬類似的理化特性，隨著對(duì)釕金屬認(rèn)識(shí)的逐步深入，交叉學(xué)科研究不斷增加，有關(guān)于釕金屬的報(bào)道也在慢慢積累。大量的文獻(xiàn)觀點(diǎn)認(rèn)為，釕金屬配合物易被腫瘤組織吸收，同時(shí)具備毒副作用小、在體內(nèi)排泄快等優(yōu)點(diǎn)[7]，有部分專家學(xué)者預(yù)計(jì)釕及其配合物有可能成為最有前途的抗腫瘤藥物之一。近期，不斷涌現(xiàn)出了對(duì)各類新型釕配合物的研究[8-10]。

Figure 3. Apoptosis of SGC-7901 cells by Annexin V-FITC/PI staining.

圖3 Annexin V-FITC/PI雙染檢測(cè)SGC-7901細(xì)胞凋亡

表1 釕配合物對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響

Table 1. The effect of Ru1 on apoptosis of SGC-7901 cells (%. Mean±SD.n=3)

Ru1(μmol/L)Normal cellsApoptotic cellsNecrotic cells094.4±3.12.5±1.03.1±1.21083.6±2.2 11.8±2.2?4.5±1.42080.1±3.6 16.9±2.6??3.1±1.44074.9±3.5 21.5±4.8??3.7±1.5

*P<0.05，**P<0.01vs0 μmol/L group.

本課題組采用新型多吡啶配合物釕配合物[Ru(phen)2(taptp)](ClO4)2作用于SGC-7901、Hela和MDA-MB-231細(xì)胞，通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)和結(jié)晶紫染色實(shí)驗(yàn)探究該配合物對(duì)這3類腫瘤細(xì)胞活性抑制率及細(xì)胞數(shù)量的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，Ru1對(duì)目標(biāo)細(xì)胞均有細(xì)胞毒性作用，均可降低細(xì)胞的活性及細(xì)胞數(shù)量，且抑制效應(yīng)具有濃度依賴性，這種效應(yīng)在不同細(xì)胞之間效果不一。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)Ru1對(duì)SGC-7901細(xì)胞的活性抑制效果最強(qiáng)。

Figure 4. The effect of Ru1 on the Bcl-2 and Bax expression. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L Ru1 group.

圖4 釕配合物對(duì)Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響

在實(shí)驗(yàn)中，SGC-7901細(xì)胞經(jīng)Ru1處理24 h后，細(xì)胞凋亡率呈濃度依賴性上升，實(shí)驗(yàn)說(shuō)明Ru1可致腫瘤細(xì)胞凋亡。Bcl-2蛋白家族由抗凋亡與促凋亡因子組成，Bcl-2家族蛋白可通過(guò)控制線粒體膜通透性調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，抗凋亡分子如Bcl-XL和Bcl-2可阻抗藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，促凋亡分子如Bax和Bad通過(guò)與滲透性轉(zhuǎn)換孔復(fù)合物發(fā)生結(jié)合促進(jìn)藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。我們利用Western blot 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，釕配合物(10、20和40 μmol/L)作用SGC-7901細(xì)胞24 h，Bcl-2蛋白的表達(dá)呈下降趨勢(shì)(隨濃度升高而下降)，但Bax蛋白的表達(dá)呈劑量依賴性上調(diào)，差異有顯著意義，為下一步研究Ru1抗腫瘤機(jī)制提供了重要依據(jù)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞周期其它相關(guān)蛋白表達(dá)的變化，以進(jìn)一步探討該配合物可能的抗腫瘤機(jī)制。希望能夠在這些實(shí)驗(yàn)成果上進(jìn)一步探討其體外抗腫瘤作用的其他潛在機(jī)制以及對(duì)體內(nèi)實(shí)體瘤的抑制效應(yīng)，為新型釕配合物的設(shè)計(jì)、開(kāi)發(fā)提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。