郭旭雪， 聶漢祥， 陳千慧， 鄧霓姍

(武漢大學人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科， 湖北 武漢 430060)

恒定自然殺傷T細胞(invariant natural killer T-cells，iNKT細胞)是一類獨特的T淋巴細胞亞群，活化的iNKT細胞產(chǎn)生Th2和Th1細胞因子，如白細胞介素(interleukin，IL)-4和干擾素γ(interferon-γ，IFN-γ)等，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，因此被認為是一種免疫調(diào)節(jié)細胞[1]。我們的初步研究表明iNKT細胞可以增強卵清蛋白(ovalbumin，OVA)誘導(dǎo)的哮喘小鼠過敏性氣道炎癥[2]，但具體機制尚不清楚。目前認為樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)是哮喘發(fā)生的始動者，可以誘導(dǎo)CD4+Th0細胞向Th2細胞分化，并在維持哮喘Th2反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[3]。機體穩(wěn)定狀態(tài)下，樹突狀細胞數(shù)量有限，因此經(jīng)常以髓源性樹突狀細胞(bone marrow-derived dendritic cells，BMDCs)探討樹突狀細胞的表型和功能特征[4]。本實驗首先分選OVA誘導(dǎo)的哮喘小鼠脾臟iNKT細胞，檢測iNKT細胞聯(lián)合OVA與BMDCs共培養(yǎng)后BMDCs表面分子和分泌細胞因子的表達水平；同時分選共培養(yǎng)后的BMDCs，檢測其與DO11.10轉(zhuǎn)基因小鼠脾臟 CD4+T細胞共培養(yǎng)上清液IL-4和IFN-γ的水平，探討iNKT細胞聯(lián)合OVA對髓源性樹突狀細胞表型和功能的影響。

材 料 和 方 法

1 實驗動物與材料

6周齡健康雌性野生型BALB/c小鼠購自武漢大學實驗動物中心，6周齡健康雌性DO11.10 OVA特異性MHC II限制性TCR轉(zhuǎn)基因BALB/c小鼠購自美國Jackson實驗室，均在無特定病原體(specific-pathogen-free，SPF)環(huán)境飼養(yǎng)。卵清蛋白(Grade V)和脂多糖(lipopolysacchride，LPS)購于Sigma；免疫佐劑氫氧化鋁凝膠購自Thermo；親和素連接的辣根過氧化物酶，PE-Cy5標記的TCR-β抗體和同型陰性對照，PE-Cy5標記的F4/80抗體，APC-Cy7標記的CD11c抗體，PE標記的MHC II 、CD80、CD86和CD40抗體，鏈霉親和素連接的PE及ELISA試劑盒(IL-12 p70、IL-10、IL-6、TNF-α、IL-4和IFN-γ)均購自eBioscicence；CD1d磁珠、CD11c磁珠和CD4+T細胞分離試劑盒均購自Miltenyi；PE標記的未負載的小鼠CD1d四聚體和PE標記的PBS-57/小鼠CD1d四聚體由美國國家衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health，NIH)贈送。

2 方法

2.1小鼠哮喘模型的制備與脾iNKT細胞的分選 野生型BALB/c小鼠[體重 (20±1) g]于第0和14天腹腔注射OVA 20 μg (含氫氧化鋁佐劑2 mg)，第25、26和27天腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉，以O(shè)VA 100 μg滴鼻激發(fā)。末次激發(fā)24 h后取哮喘小鼠脾臟，用玻片碾磨，以50 μm尼龍膜過濾，離心后棄上清，用紅細胞裂解液裂解紅細胞，PBS洗2遍后得到脾單個核細胞(mononuclear cells, MNCs)混懸液。采用免疫磁珠2步法分選獲得iNKT細胞，參考試劑說明書操作。簡要過程如下，首先向脾MNCs懸液中加入抗CD45R(B220)磁珠，通過MACS分選器陰性選擇去除細胞懸液中的B細胞；然后將陰性選擇得到的細胞 PE-PBS57/mCD1d四聚體，加入抗PE磁珠，通過MACS分選器進行陽性選擇獲得iNKT細胞，采用流式細胞術(shù)檢測脾iNKT細胞(PBS57/mCD1d四聚體+TCR-β+細胞)的純度。

2.2BMDCs的制備 髓源性樹突狀細胞的制備參考文獻[4]，首先將野生型BALB/c小鼠以頸椎脫臼法處死，在無菌環(huán)境下分離小鼠股骨和脛骨，沖洗骨髓腔，收集骨髓至離心管，離心后棄上清，用紅細胞裂解液裂解紅細胞，無血清RPMI-1640洗滌2次后獲得小鼠骨髓細胞。隨后使用6孔培養(yǎng)板，采用RPMI-1640完全培養(yǎng)基，內(nèi)含有10%熱滅活FBS、10 μg/L rmGM-CSF和10 μg/L rmIL-4，每孔加入4 mL 骨髓細胞懸液(細胞濃度 109/L)，置37 ℃，含5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d，強力吹打收集貼壁BMDCs，采用流式細胞術(shù)檢測BMDCs(CD11c+細胞)的純度。

2.3哮喘小鼠脾iNKT細胞與BMDCs體外共培養(yǎng) 用含10%熱滅活胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、0.1 mmol/L非必需氨基酸、50 μmol/L巰基乙醇、25 mg/L慶大霉素和5×104U/L青霉素的RPMI-1640完全培養(yǎng)基重懸細胞于96孔板中，每孔含BMDCs 2×105個，分別與哮喘小鼠脾iNKT細胞(每孔 4×105個)聯(lián)合100 mg/L OVA (iNKT細胞聯(lián)合OVA組)、50 mg/L LPS (LPS組)、iNKT細胞(每孔 4×105個)聯(lián)合PBS(iNKT細胞聯(lián)合PBS組)、100 mg/L OVA (OVA組)或PBS(PBS組)在體外培養(yǎng)20 h，收集細胞及培養(yǎng)上清液，分別用于檢測BMDCs表面分子和細胞因子水平。

2.4BMDCs表面分子和分泌細胞因子表達水平的檢測 首先采用流式細胞術(shù)檢測各組共培養(yǎng)后的BMDCs表面分子MHC-II、CD80、CD86和CD40的表達水平。樹突狀細胞表面表達CD11c分子，不表達F4/80分子，因此以CD11c+F4/80-細胞為樹突狀細胞[5]。取各組培養(yǎng)懸液于離心管中，離心后分離上清液，加入抗小鼠CD16/CD32抗體，4 ℃，避光孵育30 min。分別加入APC-Cy7標記的CD11c抗體和PE-Cy5標記的F4/80抗體，分別向?qū)φ展苤屑尤胂鄳?yīng)的同型陰性對照，4 ℃ 避光 30 min，隨后分別加入PE標記的MHC-II、CD80、CD86、CD40抗體或相應(yīng)的同型陰性對照，4 ℃ 避光 30 min，PBS液洗滌2次，重懸細胞到0.5 mL PBS中，上機檢測。隨后采用ELISA法檢測培養(yǎng)上清液IL-12p 70、IL-6、TNF-α和IL-10的水平，檢測方法參考試劑盒說明書。

2.5DO11.10 CD4+CD25-T細胞的分選及與各組BMDCs體外共培養(yǎng) 為了進一步探討與iNKT細胞聯(lián)合OVA共培養(yǎng)的BMDCs的功能，分選DO11.10 OVA特異性TCR轉(zhuǎn)基因小鼠脾CD4+T細胞，與共培養(yǎng)后的BMDCs體外共培養(yǎng)。首先取6周齡DO11.10轉(zhuǎn)基因小鼠脾臟，用玻片碾磨，以50 μm尼龍膜過濾，離心后棄上清液，用紅細胞裂解液裂解紅細胞，PBS洗滌2次后獲得脾MNCs混懸液。使用CD4+T細胞分離試劑盒，以磁珠分選法分選DO11.10 CD4+T細胞，按試劑盒說明書進行操作；參考試劑說明書采用CD11c磁珠分選各組共培養(yǎng)后的CD11c+細胞，即為樹突狀細胞。用含有10%熱滅活胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、0.1 mmol/L非必需氨基酸、50 μmol/L巰基乙醇、25 mg/L慶大霉素和5×104U/L青霉素的RPMI-1640完全培養(yǎng)基重懸細胞于96孔板中，每孔含DO11.10 CD4+T細胞2×106個和OVA(100 mg/L)，分別與各組分選的CD11c+DCs(2×105個)在體外培養(yǎng)48 h，收集培養(yǎng)上清液，用于檢測IL-4和IFN-γ的水平。為排除各組BMDCs對其與DO11.10 CD4+T細胞共培養(yǎng)上清液IL-4和IFN-γ水平的干擾，以RPMI-1640完全培養(yǎng)基重懸細胞于96孔板中，每孔含各組分選的CD11c+DCs 2×105個和OVA(100 mg/L)，體外培養(yǎng)48 h，收集培養(yǎng)上清液，用于檢測IL-4和IFN-γ的水平。

2.6DO11.10 CD4+CD25-T細胞分泌細胞因子水平的檢測 采用ELISA法檢測DO11.10 CD4+T細胞培養(yǎng)上清液和各組共培養(yǎng)后BMDCs培養(yǎng)(無DO11.10 CD4+T細胞)上清液IL-4和IFN-γ的水平，檢測方法參考試劑盒說明書。

3 統(tǒng)計學處理

應(yīng)用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，各組間比較采用獨立樣本t檢驗或單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 髓源性樹突狀細胞和哮喘小鼠脾iNKT細胞的純度檢測

采用流式細胞術(shù)檢測免疫磁珠法分選的哮喘小鼠脾iNKT細胞(PBS57/mCD1d四聚體+TCR-β+細胞)純度，純度達94.9%，見圖1A；采用流式細胞術(shù)檢測野生型小鼠BMDCs(CD11c+細胞)的純度達94.5%，見圖1B。

Figure 1. The purity of the splenic iNKT cells from OVA-induced asthmatic mice (A) and the bone marrow-derived dendritic cells from na?ve WT BALB/c mice (B).

圖1 分選哮喘小鼠脾iNKT細胞和髓源性樹突狀細胞的流式純度圖

2 各組共培養(yǎng)后BMDCs表面分子表達水平的比較

以MHC-II+、CD80+、CD86+和CD40+BMDCs占BMDCs百分比表示BMDCs表型成熟水平[6]。iNKT細胞聯(lián)合OVA組BMDCs表面分子MHC-II、CD80、CD86和CD40表達水平與LPS組比較差異無統(tǒng)計學顯著性(P>0.05)，但明顯高于iNKT細胞聯(lián)合PBS組、OVA組和PBS組(P<0.05或P<0.01)，見圖2和表1。

Figure 2. The expression of MHC II, CD80, CD86 and CD40 on BMDCs (CD11c+F4/80-cells) from different BMDC specimens. BMDCs： bone marrow-derived dendritic cells. The percentages on the horizontal lines represent percentages of MHC-II+, CD40+, CD86+and CD80+BMDCs in BMDCs.

圖2 各組共培養(yǎng)后BMDCs表面分子表達水平的比較

表1 各組共培養(yǎng)后BMDCs表面分子表達水平的比較

Table 1. The expression of MHC-II, CD80, CD86 and CD40 on BMDCs (CD11c+F4/80-cells) in different BMDC specimens (%. Mean±SD.n=6)

GroupMHC-II+/BMDCsCD80+/BMDCsCD86+/BMDCsCD40+/BMDCsPBS62.6±15.831.9±7.723.2±4.141.0±11.6OVA63.6±16.530.7±7.522.9±4.838.4±10.2LPS94.2±20.1△△??88.8±18.6△△??93.2±21.5△△??89.6±18.3△△??iNKT cells plus PBS80.3±19.4△△62.6±14.5△△74.2±16.7△△59.4±12.8△△iNKT cells plus OVA90.3±21.2△△?85.5±19.2△△??88.4±20.5△△??82.3±20.1△△??

BMDCs: bone marrow-derived dendritic cells.△△P<0.01vsPBS and OVA group;*P<0.05,**P<0.01vsiNKT cells plus PBS group.

3 各組BMDCs共培養(yǎng)上清液細胞因子水平的比較

以BMDCs體外培養(yǎng)上清液IL-12 p70、IL-6、TNF-α和IL-10的水平表示BMDCs處于功能成熟水平[6]。iNKT細胞聯(lián)合OVA組BMDCs培養(yǎng)上清液的IL-12 p70、IL-6和TNF-α水平與LPS組比較差異無統(tǒng)計學顯著性(P>0.05)，但明顯高于iNKT細胞聯(lián)合PBS組、OVA組和PBS組(P<0.01)，見表2。iNKT細胞聯(lián)合PBS組BMDCs培養(yǎng)上清液IL-10水平明顯高于iNKT細胞聯(lián)合OVA組和LPS組(P<0.01)，見表2。

4 各組BMDCs與DO11.10 CD4+ T細胞共培養(yǎng)上清液細胞因子水平的比較

以BMDCs與DO11.10 CD4+T細胞共培養(yǎng)上清液IL-4和IFN-γ水平表示iNKT細胞對BMDCs誘導(dǎo)CD4+Th0細胞分化的影響。iNKT細胞聯(lián)合OVA組BMDCs與DO11.10 CD4+T細胞共培養(yǎng)上清液IL-4水平與LPS組比較差異無統(tǒng)計學顯著性(P>0.05)，但明顯高于iNKT細胞聯(lián)合PBS組、OVA組和PBS組(P<0.01)，見表3。iNKT細胞聯(lián)合OVA組BMDCs與DO11.10 CD4+T細胞共培養(yǎng)上清液IFN-γ表達水平與LPS組、iNKT細胞聯(lián)合PBS組、OVA組和PBS組比較差異亦無統(tǒng)計學顯著性，見表3。iNKT細胞聯(lián)合OVA組、iNKT細胞聯(lián)合PBS組、LPS組、OVA組和PBS組BMDCs培養(yǎng)上清液均未檢測到IL-4和IFN-γ。

表2 各組BMDCs共培養(yǎng)上清液細胞因子水平的比較

Table 2. The levels of IL-12 p70, TNF-α, IL-6 and IL-10 in culture supernatants from different BMDC specimens (ng/L. Mean±SD.n=6)

GroupIL-12 p70TNF-αIL-6IL-10PBS0000OVA0000LPS730.5±182.4△△??4 227.4±872.0△△??4 399.5±978.4△△??1 198.4±261.7△△??iNKT cells plus PBS412.3±101.3??1 096.8±271.5??921.6±231.0??3 672.1±878.5??iNKT cells plus OVA694.7±168.7△△??4 016.1±868.4△△??4 411.8±983.5△△??1 032.8±250.2△△??

BMDCs: bone marrow-derived dendritic cells.**P<0.01vsPBS and OVA group;△△P<0.01vsiNKT cells plus PBS group.

表3 各組BMDCs與DO11.10 CD4+T細胞共培養(yǎng)上清液細胞因子水平的比較

Table 3. The concentrations of IL-4 and IFN-γ in culture supernatants from DO11.10 CD4+T cells co-cultured with different BMDC specimens (ng/L. Mean±SD.n=6)

GroupIL-4IFN-γPBS25.7±6.28.6±1.9OVA25.1±5.68.5±1.6LPS89.8±22.3△13.1±3.0iNKT cells plus PBS27.0±6.98.1±2.0iNKT cells plus OVA86.5±21.5△12.6±3.1

BMDCs: bone marrow-derived dendritic cells.△P<0.01vsiNKT cells plus PBS group.

討 論

iNKT細胞是一群獨特的天然淋巴細胞亞群，通過分泌Th1和Th2細胞因子發(fā)揮免疫調(diào)控功能，在固有免疫系統(tǒng)與獲得性免疫系統(tǒng)之間起重要的橋接作用[1]。我們的初步研究顯示iNKT細胞可以增強OVA誘導(dǎo)的哮喘小鼠過敏性氣道炎癥[2]，但具體機制尚不清楚。樹突狀細胞是啟動機體免疫應(yīng)答的關(guān)鍵，在哮喘Th2反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[3]。根據(jù)表型和功能成熟水平，樹突狀細胞分為不成熟和成熟樹突狀細胞[6-7]。樹突狀細胞表型成熟與其CD80、CD86和CD40等共刺激分子及MHC-II表面分子表達水平有關(guān)，而功能成熟與其分泌細胞因子水平和類型有關(guān)。成熟樹突狀細胞高表達MHC-II分子以及CD80、CD86和CD40等共刺激分子，產(chǎn)生IL-12、IL-6和TNF-α等促炎細胞因子，而免疫負相調(diào)節(jié)因子如IL-10分泌水平下降；成熟樹突狀細胞可以誘導(dǎo)原始T細胞增殖分化,因此，成熟樹突狀細胞被認為是免疫原性樹突狀細胞[6]。與之相反，不成熟樹突狀細胞表面分子表達水平低，不產(chǎn)生或產(chǎn)生少量促炎細胞因子；不成熟樹突狀細胞可以誘導(dǎo)T細胞無能。因此，不成熟樹突狀細胞被認為是耐受原性樹突狀細胞[6]。機體穩(wěn)定狀態(tài)下，樹突狀細胞數(shù)量有限，因此實驗研究中經(jīng)常通過體外誘導(dǎo)小鼠骨髓原代細胞分化獲得髓源性樹突狀細胞并進行其功能和表型研究[4]。本研究通過檢測與哮喘小鼠iNKT細胞聯(lián)合OVA共培養(yǎng)的BMDCs表面分子和細胞因子表達水平及共培養(yǎng)后的BMDCs與DO11.10 CD4+T細胞共培養(yǎng)上清液中IL-4和IFN-γ的分泌水平來探討iNKT細胞對樹突狀細胞表型和功能的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)存在OVA時，iNKT細胞可以誘導(dǎo)髓源性樹突狀細胞表型和功能的免疫原性成熟。

本研究發(fā)現(xiàn)，野生型小鼠BMDCs與PBS共培養(yǎng)后BMDCs低表達MHC-II、CD80、CD86和CD40等表面分子，培養(yǎng)上清液未檢測到IL-12 p70、IL-6、IL-10和TNF-α等細胞因子；同時分選與PBS共培養(yǎng)的BMDCs，與DO11.10 CD4+T細胞共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)上清液IL-4和IFN-γ水平低下，因此體外誘導(dǎo)的髓源性樹突狀細胞為不成熟樹突狀細胞，這與文獻報道的結(jié)果一致[8-9]。本研究將脂多糖與髓源性樹突狀細胞共培養(yǎng)作為實驗對照組，觀察發(fā)現(xiàn)LPS組BMDCs高表達表面分子MHC-II、CD80、CD86和CD40，培養(yǎng)上清液中IL-12 p70、IL-6和TNF-α分泌水平升高，與DO11.10 CD4+T細胞共培養(yǎng)后上清液IL-4水平增加，提示脂多糖可以誘導(dǎo)髓源性樹突狀細胞表型和功能免疫原性成熟。Xu等[10]以脂多糖(1 mg/L)或磷酸鹽緩沖液刺激髓源性樹突狀細胞12 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)脂多糖刺激的髓源性樹突狀細胞其表面分子CD80和CD86及培養(yǎng)上清液IL-12 p70、IL-6和TNF-α水平明顯高于磷酸鹽緩沖液刺激的髓源性樹突狀細胞，證明脂多糖可以誘導(dǎo)髓源性樹突狀細胞免疫原性成熟，這與本實驗結(jié)果一致。本研究觀察發(fā)現(xiàn)，iNKT細胞聯(lián)合OVA組BMDCs表面分子MHC-II、CD80、CD86和CD40及培養(yǎng)上清液IL-12 p70、IL-6和TNF-α水平與LPS組比較差異無統(tǒng)計學意義；與DO11.10 CD4+T細胞共培養(yǎng)后上清液IL-4水平與LPS組比較差異亦無統(tǒng)計學顯著性，提示iNKT細胞聯(lián)合OVA共培養(yǎng)的髓源性樹突狀細胞表型和功能免疫原性成熟。研究中同時發(fā)現(xiàn)，iNKT細胞聯(lián)合PBS組BMDCs表面分子表達水平低于iNKT細胞聯(lián)合OVA組和LPS組，但高于OVA組、PBS組，同時培養(yǎng)上清液促炎細胞因子水平低而IL-10分泌水平升高；與DO11.10 CD4+T細胞共培養(yǎng)，抑制其產(chǎn)生細胞因子，提示iNKT細胞聯(lián)合PBS共培養(yǎng)的髓源性樹突狀細胞耐受性成熟。本研究為排除各組髓源性樹突狀細胞對其與DO11.10 CD4+T細胞共培養(yǎng)上清液IL-4和IFN-γ表達水平的干擾，分別檢測各組BMDCs培養(yǎng)上清液IL-4和IFN-γ的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)iNKT細胞聯(lián)合OVA組、iNKT細胞聯(lián)合PBS組、LPS組、OVA組和PBS組BMDCs培養(yǎng)上清液均未檢測到IL-4和IFN-γ。

綜上所述，存在OVA時，iNKT細胞可以誘導(dǎo)髓源性樹突狀細胞表型和功能免疫原性成熟，而缺乏OVA時，iNKT細胞誘導(dǎo)髓源性樹突狀細胞耐受原性成熟。Caielli等[11]研究發(fā)現(xiàn)，iNKT細胞在存在或不存在“危險因素”時，可以通過激活樹突狀細胞的不同分子信號誘導(dǎo)樹突狀細胞免疫原性或耐受原性成熟，從而產(chǎn)生不同的免疫效應(yīng)，因此iNKT細胞存在功能可塑性。

CD40-CD40L相互作用在樹突狀細胞成熟過程中發(fā)揮重要作用[12]。Caielli 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，iNKT 細胞在TLR4刺激下與未成熟樹突狀細胞共培養(yǎng)，可以通過CD40-CD40L相互作用及NF-κB活化誘導(dǎo)樹突狀細胞免疫原性成熟。因此，iNKT 細胞可能通過CD40-CD40L途徑誘導(dǎo)樹突狀細胞分化成熟。但iNKT細胞與樹突狀細胞在哮喘發(fā)病中的具體相互作用機制仍有待闡述。

本研究證明，iNKT細胞聯(lián)合OVA可以誘導(dǎo)髓源性樹突狀細胞表型和功能的免疫原性成熟。樹突狀細胞是專職的抗原提呈細胞，參與吸入性抗原的攝取、加工和提呈，在哮喘發(fā)病的始動、維持階段均發(fā)揮關(guān)鍵作用[3]。因此，我們推測iNKT細胞可能通過誘導(dǎo)樹突狀細胞表型和功能的免疫原性成熟增強OVA誘導(dǎo)的哮喘小鼠過敏性氣道炎癥，但需進一步研究。