孫 健， 秦 娥， 唐吉仙， 曹淼英， 沈巨信

(紹興市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 浙江大學(xué)紹興醫(yī)院， 浙江 紹興 312000)

炎癥是機(jī)體遭受各種內(nèi)外刺激后的一種防御性反應(yīng)。單核/巨噬細(xì)胞是機(jī)體固有免疫機(jī)制的重要組成部分，是防御病原體，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)的重要細(xì)胞，其過度活化可導(dǎo)致失控性地釋放炎癥因子，引起機(jī)體過度的免疫反應(yīng)和組織損傷[1-3]。

自噬(autophagy)是細(xì)胞利用溶酶體對自身衰老或變性細(xì)胞器進(jìn)行自我吞噬、降解并進(jìn)行再次利用的過程，是一種機(jī)體自身防御和應(yīng)激調(diào)控機(jī)制[4]。自噬能維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，并參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化，對機(jī)體的炎癥及免疫應(yīng)答起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[5]。

多西環(huán)素(doxycycline，Doxy)是一類廣譜抗生素，屬于四環(huán)素類藥物的衍生物，它可以特異性地與細(xì)菌核糖體30S亞基結(jié)合，抑制細(xì)菌DNA的復(fù)制而發(fā)揮抗菌作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，多西環(huán)素等藥物除了具有本身的抗菌活性外，還有抗炎及免疫調(diào)節(jié)的非抗菌作用。我們前期的研究已經(jīng)證實(shí)，多西環(huán)素主要通過調(diào)控核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而下調(diào)細(xì)胞因子及趨化因子的釋放[6]。新近研究發(fā)現(xiàn)，多西環(huán)素還具有調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬的作用[7]，而自噬又與炎癥及免疫密切相關(guān)[8]，提示自噬可能參與了多西環(huán)素調(diào)節(jié)炎癥及免疫應(yīng)答過程，但其確切機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。本研究以脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)刺激人單核/巨噬細(xì)胞系THP-1細(xì)胞復(fù)制炎癥細(xì)胞模型，探討多西環(huán)素調(diào)控細(xì)胞自噬對單核/巨噬細(xì)胞炎癥因子生成的影響。

材 料 和 方 法

1 材料

多西環(huán)素、雷帕霉素(rapamycin，Rapa)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)、3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)、來源于銅綠假單胞菌菌株的LPS和兔抗β-actin多克隆抗體購自Sigma；RPMI-1640培養(yǎng)基及胎牛血清購自Gibco；BCA蛋白定量試劑盒購自Bio-Rad；Western blot實(shí)驗(yàn)所用兔抗人NF-κB單克隆抗體(monoclonal antibody, mAb)、兔抗人磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(phosphorylated mammalian target of rapamycin，p-mTOR) mAb、兔抗人微管相關(guān)蛋白1輕鏈3B(microtubule-associated protein 1 light chain 3B, LC3B) mAb和HRP標(biāo)記的山羊抗兔 II 抗均購自Cell Signaling Technology；腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)和白細(xì)胞介素8(interleukin-8, IL-8)ELISA檢測試劑盒購自Invitrogen。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組 人單核/巨噬細(xì)胞系THP-1購自RIKEN Cell Bank，使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基常規(guī)傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為：對照(control)組,THP-1細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞濃度為5×108/L，不加任何處理；LPS組,采用1 mg/L LPS刺激細(xì)胞2、6、12和24 h；LPS+Doxy組,采用1 mg/L LPS刺激細(xì)胞，隨后加入50 mg/L多西環(huán)素刺激6、12和24 h；LPS+Doxy+Rapa組,采用Rapa (5 μmol/L)預(yù)處理細(xì)胞30 min，隨后以1 mg/L LPS及50 mg/L多西環(huán)素刺激細(xì)胞12 h；LPS+Doxy+3-MA組，采用3-MA(5 mmol/L)預(yù)處理細(xì)胞30 min，隨后以1 mg/L LPS及50 mg/L多西環(huán)素刺激細(xì)胞12 h。

2.2細(xì)胞因子測定 以ELISA法測定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α和IL-8的水平，按試劑盒操作步驟進(jìn)行, 所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，每次3個復(fù)孔，樣品在450 nm處使用全自動酶標(biāo)儀(SpectraMax M5)進(jìn)行吸光度測量。

2.3Western blot法測定LC3B、NF-κB和p-mTOR等的蛋白水平 收集不同藥物干預(yù)后的THP-1細(xì)胞，4 ℃、1 000 r/min離心5 min，棄上清，每個樣品加入RIPA細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，Bradford法測定蛋白含量，按試劑盒說明書進(jìn)行操作。取40 μg上述蛋白樣品上樣，予15% SDS-PAGE(固定電流35 mA電泳50 min)，取膠后予轉(zhuǎn)PVDF膜(固定電流62 mA轉(zhuǎn)膜60 min)，轉(zhuǎn)膜完成后將PVDF膜置于5%脫脂奶粉溶液中封閉1 h，分別加1∶1 000稀釋的兔抗NF-κB mAb、兔抗p-mTOR、β-actin和LC3B 抗體，4 ℃孵育過夜。洗滌后， 加1∶2 000稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗體，常溫孵育1 h，TBST漂洗3次，分別取1 mL ECL顯影液A液和B液，混勻后孵育PVDF膜，利用ImageQuant LAS 4000 mini化學(xué)發(fā)光成像儀(GE Healthcare)獲取凝膠圖像。采用免費(fèi)ImageJ圖像處理軟件(http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html)對Western blot的凝膠圖像進(jìn)行數(shù)字化分析處理。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 13.0。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組均數(shù)之間的比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，對多組樣本均數(shù)的比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 多西環(huán)素抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞因子的產(chǎn)生

1 mg/L LPS刺激THP-1細(xì)胞后呈時間依賴性誘導(dǎo)TNF-α及IL-8的產(chǎn)生，約在12 h左右達(dá)到峰值(P<0.01)，加入多西環(huán)素后早期抑制了細(xì)胞因子的釋放，但隨時間延長其抑制效應(yīng)逐漸減弱，見圖1。

Figure 1. Doxycycline inhibited LPS-induced TNF-α and IL-8 production in LPS-stimulated THP-1 cells. Mean±SD.n=3.##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsLPS group.

圖1 多西環(huán)素抑制LPS誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子的釋放

2 多西環(huán)素增加了LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞自噬水平

利用LPS刺激THP-1細(xì)胞后加入多西環(huán)素干預(yù)12 h，結(jié)果顯示，LPS刺激THP-1細(xì)胞后，自噬標(biāo)志蛋白LC3-I向LC3-II轉(zhuǎn)化率(LC3-II/LC3-I)增加(P<0.05)，提示LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞自噬增強(qiáng)，而加入多西環(huán)素后其自噬水平進(jìn)一步增強(qiáng)(P<0.05)，見圖2A。為進(jìn)一步明確單純多西環(huán)素對單核/巨噬細(xì)胞自噬的作用，利用多西環(huán)素刺激THP-1細(xì)胞6、12和24 h，結(jié)果顯示，隨時間延長，LC3-II的轉(zhuǎn)化率也逐漸增加(P<0.05)，見圖2B。以上結(jié)果表明，LPS促進(jìn)單核/巨噬細(xì)胞自噬，而多西環(huán)素能進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞自噬水平，且多西環(huán)素本身是一種單核/巨噬細(xì)胞的自噬誘導(dǎo)劑。

3 LPS上調(diào)p-mTOR的水平而多西環(huán)素抑制p-mTOR水平

利用LPS刺激THP-1細(xì)胞后加入多西環(huán)素進(jìn)行干預(yù)12 h，以Western blot測定具有負(fù)性調(diào)控作用的自噬上游信號分子p-mTOR的蛋白水平，結(jié)果顯示，LPS上調(diào)p-mTOR的水平，而多西環(huán)素抑制p-mTOR的水平(P<0.05)，見圖2C。上述結(jié)果表明，盡管LPS及多西環(huán)素均誘導(dǎo)自噬，但兩者誘導(dǎo)自噬的機(jī)理不同，多西環(huán)素通過mTOR依賴的途徑，而LPS通過非mTOR依賴的途徑誘導(dǎo)自噬。

4 細(xì)胞自噬參與多西環(huán)素調(diào)控炎癥細(xì)胞因子的生成

利用自噬誘導(dǎo)劑Rapa及自噬抑制劑3-MA分別對THP-1細(xì)胞預(yù)處理0.5 h，然后用LPS刺激THP-1細(xì)胞，并加用多西環(huán)素進(jìn)行干預(yù)12 h，以Western blot測定其對LC3-II/LC3-I水平和NF-κB表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，與DMSO對照組相比，Doxy+Rapa組和LPS+Doxy+Rapa組的LC3-II/LC3-I水平均增加，提示自噬水平增加，但Doxy+Rapa組和LPS+Doxy+Rapa組的LC3-II/LC3-I水平的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性(P>0.05)。另外，與DMSO對照組相比，LPS+Doxy+Rapa組的NF-κB的蛋白水平明顯降低(P<0.01)，但LPS+Doxy組及Doxy+Rapa組NF-κB蛋白水平的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性(P>0.05)，故尚未能證實(shí)雷帕霉素與多西環(huán)素是否對NF-κB具有協(xié)同抑制效應(yīng)，見圖3A。而相對于LPS+Doxy組，加用自噬抑制劑3-MA后，NF-κB蛋白水平增加(P<0.05)，見圖3B，提示自噬可能參與了調(diào)節(jié)炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程。為了進(jìn)一步明確自噬是否參與多西環(huán)素調(diào)控炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，以ELISA測定分別加入雷帕霉素或3-MA后THP-1細(xì)胞TNF-α及IL-8水平的變化，結(jié)果顯示，雷帕霉素增加了多西環(huán)素對細(xì)胞因子生成的抑制效應(yīng)(P<0.05)，而使用3-MA抑制自噬后，多西環(huán)素對炎癥因子生成的抑制效應(yīng)減弱(P<0.05)，見圖4。上述結(jié)果提示細(xì)胞自噬參與了多西環(huán)素調(diào)控炎癥細(xì)胞因子生成的過程。

討 論

革蘭氏陰性桿菌細(xì)胞壁主要成分LPS能與單核/巨噬細(xì)胞表面的Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)結(jié)合，通過修飾絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)及NF-κB磷酸化水平，進(jìn)而誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞釋放IL-6、IL-8和TNF-α等多種細(xì)胞因子及趨化因子。目前認(rèn)為，過度、失控的全身性炎癥應(yīng)答會導(dǎo)致直接和間接的組織損傷，因此，LPS被廣泛用于制備體內(nèi)及體外炎癥模型的研究[9]。巨噬細(xì)胞能夠?qū)?nèi)源性和外源性刺激發(fā)生快速應(yīng)答，在炎癥反應(yīng)和組織損傷過程中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用[10]。巨噬細(xì)胞是一種異質(zhì)性細(xì)胞，在不同微環(huán)境下向不同的表型分化，并在疾病不同的病程階段發(fā)揮不同的功能[11]。在急性肺損傷早期，巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)經(jīng)典活化表型(M1型極化)并發(fā)揮促炎作用。動物實(shí)驗(yàn)顯示，早期減少肺部巨噬細(xì)胞可減輕急性肺損傷[12]。本研究利用LPS刺激單核/巨噬細(xì)胞系THP-1細(xì)胞后，誘導(dǎo)大量TNF-α及IL-8等促炎細(xì)胞因子的釋放，呈現(xiàn)典型的M1極化表型，約12 h左右細(xì)胞因子釋放達(dá)到峰值；多西環(huán)素干預(yù)可有效抑制促炎細(xì)胞因子的釋放，顯示其抗炎效應(yīng)。

Figure 2. The effects of doxycycline (Doxy) treatment on the protein levels of p-mTOR and LC3B in LPS-stimulated THP-1 cells detected by Western blot. A: the LC3B protein and LC3 conversion ratio (LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ) in LPS-stimulated THP-1 cells treated with Doxy at 50 mg/L for 12 h; B: the LC3B protein and LC3 conversion ratio in Doxy-stimulated THP-1 cells at different time points; C: the LC3B and p-mTOR protien levels in LPS-stimulated THP-1 cells treated with Doxy at 50 mg/L for 12 h. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;▲P<0.05vsLPS group.

圖2 LPS及多西環(huán)素刺激THP-1細(xì)胞后p-mTOR及LC3B的蛋白水平變化

Figure 3. The effects of Rapa (A) or 3-MA (B) on the protein expression of LC3B and NF-κB in LPS-stimulated THP-1 cells treated with Doxy. Mean±SD.n=4.△P<0.05,△△P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsDMSO alone;*P<0.05,**P<0.01vsLPS alone;▲P<0.05,▲▲P<0.01vsLPS+Doxy.

圖3 雷帕霉素或3-MA對LPS及多西環(huán)素刺激THP-1細(xì)胞后LC3B及NF-κB蛋白水平的影響

Figure 4. The effects of Rapa or 3-MA on the inflammatory cytokine production in LPS-stimulated THP-1 cells treated with Doxy. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsLPS alone;▲P<0.05vsLPS+Doxy.

圖4 雷帕霉素及3-MA對LPS及多西環(huán)素刺激THP-1細(xì)胞后促炎細(xì)胞因子水平的影響

細(xì)胞自噬是真核生物對細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)進(jìn)行自身周轉(zhuǎn)的重要過程，在進(jìn)化中高度保守。自噬是細(xì)胞基本功能，參與調(diào)節(jié)多種重要的生理過程，被認(rèn)為是機(jī)體調(diào)節(jié)免疫及對抗應(yīng)激的重要防線[4-5]。mTOR是具有負(fù)性調(diào)控作用的關(guān)鍵的自噬上游信號分子，同時它在細(xì)胞的生長、增殖、分化和凋亡中也起著重要的調(diào)控作用。研究顯示，mTOR及細(xì)胞自噬在過度炎癥反應(yīng)引起的急性肺損傷發(fā)生中起了重要的作用[13]，但其確切機(jī)制及如何調(diào)節(jié)炎癥應(yīng)答卻仍未被闡明。越來越多的證據(jù)表明[14-15]，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞自噬水平能減輕過度炎癥造成的急性肺損傷，抑制mTOR在肺巨噬細(xì)胞及肺泡上皮細(xì)胞均顯示保護(hù)作用。杜濤等[16]研究認(rèn)為LPS通過PI3K/Akt/mTOR通路調(diào)控巨噬細(xì)胞自噬，但本研究結(jié)果顯示，多西環(huán)素抑制mTOR誘導(dǎo)自噬，而LPS上調(diào)p-mTOR的水平，卻誘導(dǎo)自噬增加，提示LPS通過非mTOR依賴的途徑誘導(dǎo)自噬，但其確切作用機(jī)理仍需進(jìn)一步研究加以證實(shí)。

我們的前期工作發(fā)現(xiàn)多西環(huán)素主要通過抑制NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而發(fā)揮抗炎作用[6]。而多西環(huán)素同時能上調(diào)巨噬細(xì)胞自噬水平，那么細(xì)胞自噬是否同時參與調(diào)控炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程？本研究結(jié)果顯示，盡管尚未能明確多西環(huán)素與雷帕霉素是否具有協(xié)同作用，但上調(diào)細(xì)胞自噬抑制了NF-κB蛋白的水平，且自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素增加了多西環(huán)素對細(xì)胞因子的抑制作用；反之，抑制自噬導(dǎo)致NF-κB蛋白水平增加，并減弱了多西環(huán)素對細(xì)胞因子生成的抑制作用，提示細(xì)胞自噬可能參與了多西環(huán)素對巨噬細(xì)胞炎癥因子水平調(diào)控過程。上述結(jié)果與Hu等[17]研究的結(jié)果相符。此外，Harris等[18]報道IL-1β的前體能特異性的被自噬體靶定并隔離，雷帕霉素誘導(dǎo)自噬能促進(jìn)其降解而減少成熟的IL-1β釋放。提示自噬可能在多個環(huán)節(jié)參與炎癥細(xì)胞因子的調(diào)控。動物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)[19]，自噬相關(guān)蛋白LC3B基因敲除小鼠由于自噬缺陷而增加了高氧誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞的死亡。反之，自噬蛋白LC3過表達(dá)能增加細(xì)胞自噬功能，并有效地抑制小鼠急性肺損傷，增加小鼠存活率[20]。由此可見，自噬參與了炎癥的發(fā)生發(fā)展過程，調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬水平有望減輕體內(nèi)失控的炎癥反應(yīng)。

綜上所述，多西環(huán)素抑制mTOR上調(diào)單核/巨噬細(xì)胞自噬水平，并降低LPS誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞因子水平。鑒于本研究獲得的主要是針對炎癥早期細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，尚不能模擬體內(nèi)的藥物作用及代謝過程，需進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)藥物干預(yù)的研究以闡明細(xì)胞自噬在不同病理過程中對調(diào)控炎癥應(yīng)答的作用。