謝 盈， 劉 鴿， 汪 炬

(暨南大學(xué)生物醫(yī)藥研究院， 廣東 廣州 510632)

角質(zhì)形成細(xì)胞是人體皮膚表面脂質(zhì)(包括脂肪酸和膽固醇)的主要來(lái)源[1-2]。脂質(zhì)代謝非常復(fù)雜，涉及大量的蛋白酶和各種轉(zhuǎn)錄因子，并受到一系列相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor, PPAR)、肝X受體(liver X receptor, LXR)和類(lèi)視黃醇 X 受體(retinoid X receptor, RXR)3類(lèi)核受體及固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterol regulatory element binding protein, SREBP)介導(dǎo)的脂質(zhì)代謝通路是研究脂質(zhì)代謝調(diào)控機(jī)制的首要環(huán)節(jié)，其中SREBP是脂質(zhì)代謝通路中的關(guān)鍵調(diào)控因子，調(diào)控外源脂質(zhì)的攝入和內(nèi)部脂質(zhì)合成等過(guò)程[3]。SREBP-1c屬于SREBP家族，是脂質(zhì)代謝信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[4]。SREBP-1c的靶基因主要有脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)、乙酰輔酶A合成酶(acetyl-CoA synthase,ACS)、硬脂酰輔酶A脫飽和酶(stearoyl-CoA desaturase,SCD)和羥甲基戊二酰輔酶A還原酶(3-hydro-xy-3-methylglutaryl-CoA reductase,HMGCR)，其啟動(dòng)子上均含有固醇調(diào)節(jié)元件(sterol regulatory element, SRE；即SREBP-1c結(jié)合區(qū))，活化后的SREBP-1c進(jìn)入細(xì)胞核與其靶基因啟動(dòng)子上的SRE結(jié)合，激活脂質(zhì)合成基因的翻譯，從而控制脂質(zhì)的合成。

成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(fibroblast growth factor receptor, FGFR)的結(jié)構(gòu)包括細(xì)胞外區(qū)域、跨膜區(qū)和細(xì)胞內(nèi)區(qū)域3個(gè)部分，在氨基末端包含有3個(gè)免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)樣結(jié)構(gòu)域，分別被稱(chēng)作 D1環(huán)、D2環(huán)與D3環(huán)[5],其中FGFR1、FGFR2和FGFR3可通過(guò)選擇性剪切得到2種亞型：FGFR-IIIb和FGFR-IIIc。FGF7的受體為FGFR2-IIIb，且FGF7是FGFs家族中唯一一個(gè)只與1種受體結(jié)合的[6]。FGFs主要在間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，通過(guò)旁分泌機(jī)制分泌到細(xì)胞外，與細(xì)胞膜表面特異性受體FGFRs結(jié)合，進(jìn)而引起胞內(nèi)相關(guān)信號(hào)通路的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，在維持組織器官正常發(fā)育及穩(wěn)定性方面起關(guān)鍵性調(diào)控作用[7]。目前FGF7對(duì)表皮脂質(zhì)合成的調(diào)控機(jī)制尚不明確，由于脂質(zhì)的異常分泌在炎癥性皮膚病(如痤瘡和銀屑病等)的發(fā)生機(jī)制中起著關(guān)鍵作用，因此抑制皮膚組織中脂質(zhì)合成途徑可能具有治療炎癥性疾病的潛力。本研究選擇人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT來(lái)展開(kāi)研究，揭示了角質(zhì)形成細(xì)胞中FGF7信號(hào)通路對(duì)脂質(zhì)合成的調(diào)控機(jī)制，及FGFR2-IIIb D3胞外段對(duì)脂質(zhì)合成的抑制作用。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

FGFR2-IIIb D3胞外段是本課題組表達(dá)純化；HaCaT細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)保存。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶購(gòu)自Gibco；生物素標(biāo)記試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自Thermo Scientific；RNA提取試劑盒購(gòu)自Magen；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa；鏈霉親和素-FITC和油紅O購(gòu)自Sigma；抗AKT、p-AKT和p-FGFR抗體及AKT抑制劑MK-2206購(gòu)自CST；CCK-8購(gòu)自DOJINDO；DAPI、PMSF和RIPA購(gòu)自碧云天；抗SREBP-1抗體購(gòu)自Abcam；抗FGFR2抗體購(gòu)自Santa Cruz；HRP-羊抗兔IgG抗體和HRP-羊抗鼠IgG抗體購(gòu)自聯(lián)科生物。

2 主要方法

2.1等溫滴定量熱法(isothermal titration calorimetry, ITC)研究FGFR2-IIIb D3胞外段與FGF7的結(jié)合力 用Buffer B分別對(duì)FGFR2-IIIb D3胞外段和FGF7進(jìn)行透析，測(cè)定質(zhì)量濃度，并稀釋至實(shí)驗(yàn)所需的摩爾濃度。取400 μL 濃度為500 μmol/L的FGFR2-IIIb D3胞外段加入到樣品池中，參比池中加入同等體積的緩沖液作為對(duì)照。取50 μL濃度為5 μmol/L的FGF7及緩沖液于上樣針中用于滴定，反應(yīng)溫度為25 ℃，每次滴加2 μL，2次滴加間隔時(shí)間設(shè)為120 s，共滴加20次。

2.2Real-time PCR檢測(cè) FGFR1、FGFR2-IIIc、FGFR2-IIIb、FGFR3、FGFR4、SREBP-1c、FAS、ACS、SCD和HMGCR的mRNA表達(dá) 使用RNA提取試劑盒抽提細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以β-actin為內(nèi)參照，進(jìn)行real-time PCR檢測(cè)。β-actin的正向引物序列為5’-ACGTGGACATCCGCAAAG-3’，反向引物序列為5’-GACTCGTCATACTCCTGCTTG-3’；FGFR1的正向引物序列為5’-CAAAAAGCTTGAAGACCTCACA-3’，反向引物序列為5’-CTGACACGGACTCATCAACAGT-3’；FGFR2-IIIb的正向引物序列為5’-TGGAGAATGAATACGGGTCC-3’，反向引物序列為5’-TCGGTCACAATTGAACAGAGC-3’；FGFR2-IIIc的正向引物序列為5’-GGATATCCTTTCACTCTGCATGGT-3’，反向引物序列為5’-TGGAGTAAATGGCTATCTCCAGGTA-3’；FGFR3的正向引物序列為5’-ATGGGCGCCCCTGCCTGC-3’，反向引物序列為5’-CGTCCGCGAGCCCCCACT-3’；FGFR4的正向引物序列為5’-CACCGTCAAGTTCCGCTGT-3’，反向引物序列為5’-ACCACGCTCTCCATCACGA-3’；SREBP-1c的正向引物序列為5’-GGAGCCATGGATTGCACTTT-3’，反向引物序列為5’-TCAAATAGGCCAGGGAAGTCA-3’；FAS的正向引物序列為5’-CAGGCACACACGATGGAC-3’，反向引物序列為5’-CGGAGTGAATCTGGGTTGAT-3’；ACS的正向引物序列為5’-CCCAGTTTATCCCAATGCTG-3’，反向引物序列為5’-GGGCGCCATAGAACTGATT-3’；SCD的正向引物序列為5’-CCGGGAGAATATCCTGGTTT-3’，反向引物序列為5’-GCGGTACTCACTGGCAGAGT-3’；HMGCR的正向引物序列為5’-TGGCTCTTTCAGAGAGGTCTCA-3’，反向引物序列為5’-TGCCTTCAGAGGTGAGCTGTA-3’。PCR條件為: 95 ℃ 5 s; 58 ℃ 5 s，72 ℃ 30 s，39個(gè)循環(huán)。循環(huán)延伸末端收集熒光信號(hào)，所得數(shù)據(jù)用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析計(jì)算。

2.3Western blot法檢測(cè)FGF7、AKT抑制劑和FGFR2-IIIb D3胞外段對(duì)HaCaT細(xì)胞的FGFR2、p-FGFR、AKT和p-AKT表達(dá)的影響 選取生長(zhǎng)良好且密度為80%～90%的HaCaT細(xì)胞進(jìn)行鋪板(6孔板)。細(xì)胞以每孔2×104個(gè)密度接種于6孔板中，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓過(guò)夜。添加FGFR2-IIIb胞外段(33.3 μmol/L)和AKT抑制劑MK-2206(1 μmol/L)，30 min后加入FGF7(10 μg/L)處理細(xì)胞2 h。取出細(xì)胞培養(yǎng)板，吸凈板中培養(yǎng)基，用經(jīng)4 ℃預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，吸凈PBS，全程將細(xì)胞培養(yǎng)板置于冰上操作。每孔加入100 μL～150 μL的細(xì)胞裂解液(含1%蛋白酶抑制劑，可根據(jù)孔中細(xì)胞數(shù)量做適當(dāng)調(diào)整)，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板使細(xì)胞裂解液與細(xì)胞充分接觸，冰上靜置2 min。用細(xì)胞刮盡可能的將細(xì)胞全部刮下，將細(xì)胞裂解混合物轉(zhuǎn)移至經(jīng)預(yù)冷的EP管中，渦旋振蕩數(shù)次，每次數(shù)秒，冰上孵育10 min使細(xì)胞在細(xì)胞裂解液的作用下充分裂解。10 min后4 ℃、13 400 r/min離心20 min。上清轉(zhuǎn)至潔凈且經(jīng)提前預(yù)冷的EP管中，從中取7 μL 用于BCA測(cè)濃度，剩余蛋白加入適量5×loading buffer，混勻后沸水浴5 min，室溫13 400 r/min離心5 min，即可進(jìn)行SDS-PAGE分離蛋白，或保存于-20 ℃中。

2.4油紅O染色檢測(cè)FGF7、AKT抑制劑和FGFR2-IIIb D3胞外段對(duì)HaCaT細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積的影響 選取生長(zhǎng)良好且密度為80%～90%的HaCaT細(xì)胞進(jìn)行鋪板(共聚焦皿)。消化細(xì)胞，盡可能將細(xì)胞吹打?yàn)閱渭?xì)胞懸液。取20 μL左右細(xì)胞懸液于細(xì)胞計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)3遍，取平均值。HaCaT細(xì)胞每孔以1×104個(gè)密度接種于共聚焦皿中，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)加入FGFR2-IIIb胞外段(33.3 μmol/L)和AKT抑制劑MK-2206(1 μmol/L)，30 min后加入FGF7(10 μg/L)，孵育24 h。PBS清洗，4%中性甲醛固定30 min。蒸餾水清洗2 次，每次2 min。60%異丙醇浸洗10 s。油紅O染料(0.5%油紅O溶于異丙醇中，使用時(shí)用蒸餾水按 3∶2 稀釋?zhuān)ㄐ詾V紙過(guò)濾)室溫避光孵育30 min。60%異丙醇浸洗2次，每次2 min。蒸餾水清洗2次，每次1 min。蘇木素復(fù)染10 min(20×濃縮蘇木素染液，使用時(shí)與蒸餾水按 1∶20 稀釋)。自來(lái)水清洗2次，每次1 min。蒸餾水清洗2次，每次1 min。倒置顯微鏡觀察并拍照。

2.5流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)FGF7誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞脂質(zhì)的合成作用 選取生長(zhǎng)良好且密度為80%～90%的HaCaT細(xì)胞進(jìn)行鋪板，饑餓12 h后給藥，胰酶消化收集細(xì)胞。800 r/min離心6 min，吸棄上清，加入PBS緩沖液，重懸細(xì)胞，800 r/min離心6 min，重復(fù)PBS清洗步驟2次。1.5 mL的EP管中取10 μg尼羅紅，用1 mL甲醇將其完全溶解，使其濃度為10 mg/L，4 ℃避光保存，2周內(nèi)使用。加入990 μL PBS制成單細(xì)胞懸液，加入尼羅紅染液10 μL，使終濃度為100 μg/L，室溫孵育30 min短暫渦旋，300目尼龍膜過(guò)濾至流式檢測(cè)專(zhuān)用試管中。激發(fā)波長(zhǎng)485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為565 nm，每個(gè)樣本檢測(cè)20 000個(gè)細(xì)胞，得到每個(gè)細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 FGFR2-IIIb D3胞外段的生物特性分析

1.1FGFR2-IIIb D3胞外段可與FGF7結(jié)合 利用等溫滴定量熱法檢測(cè)FGFR2-IIIb D3胞外段與FGF7的相互作用力。以FGF7對(duì)緩沖液的相互作用力，緩沖液對(duì)FGF7的相互作用力，緩沖液對(duì)緩沖液的相互作用力為空白對(duì)照。FGFR2-IIIb D3胞外段與FGF7結(jié)合常數(shù)K=2.22×108L/mol，說(shuō)明FGFR2-IIIb D3胞外段可與FGF7結(jié)合，見(jiàn)圖1。

Figure 1. Isothermal titration calorimetry was used to analyze the interaction between FGFR2-IIIb D3 extracellular domain and FGF7. The horizontal coordinate of the above figure is time, and the vertical coordinate is thermal power. The peak area represents the total amount of heat released at each titration. The abscissa of the figure below is the molar ratio of protein, and the ordinate is the total heat generated by titration.

圖1 等溫滴定量熱法檢測(cè)FGFR2-IIIb D3胞外段與FGF7的相互作用力

1.2FGFR2-IIIb在HaCaT細(xì)胞中高表達(dá) real-time PCR檢測(cè)FGFR1、FGFR2-IIIc、FGFR2-IIIb、FGFR3和FGFR4的mRNA表達(dá)，結(jié)果顯示，在HaCaT細(xì)胞中FGFR2-IIIb mRNA的表達(dá)明顯高于其它FGFRs家族成員，F(xiàn)GFR2-IIIb mRNA的表達(dá)是FGFR2-IIIc mRNA的2.64倍(P<0.01)，見(jiàn)圖2。

1.3FGFR2-IIIb D3胞外段抑制HaCaT細(xì)胞活力 CCK-8檢測(cè)FGFR2-IIIb D3胞外段對(duì)HaCaT細(xì)胞活力的影響，結(jié)果顯示，F(xiàn)GF7可促進(jìn)HaCaT細(xì)胞活力，與空白對(duì)照組對(duì)比差異顯著(P<0.05)；FGFR2-IIIb D3胞外段可下調(diào)FGF7上調(diào)的HaCaT細(xì)胞活力，隨著FGFR2-IIIb D3胞外段濃度的增加，對(duì)HaCaT細(xì)胞活力的抑制作用也逐漸增強(qiáng)(P<0.01)，且在33.3 μmol/L時(shí)抑制效果最好，抑制率達(dá)60%，見(jiàn)圖3。

Figure 2. The mRNA expression of FGFRs in HaCaT cells was detected by real-time PCR. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsFGFR2Ⅲb group.

圖2 HaCaT細(xì)胞中FGFRs mRNA的表達(dá)

2 FGFR2-IIIb D3胞外段對(duì)脂質(zhì)合成通路的抑制作用

2.1FGFR2-IIIb D3胞外段可抑制FGF7激活的SREBP-1c mRNA的表達(dá) 在HaCaT細(xì)胞中FGF7可顯著上調(diào)SREBP-1c mRNA的表達(dá)，F(xiàn)GFR2-IIIb D3胞外段和AKT抑制劑MK-2206均可抑制其表達(dá)(P<0.05),見(jiàn)圖4。這說(shuō)明FGF7在HaCaT細(xì)胞中通過(guò)AKT信號(hào)調(diào)控皮膚脂質(zhì)的合成。

2.2FGFR2-IIIb D3胞外段可抑制FGF7激活的脂質(zhì)合成酶(FAS、ACS、SCD和HMGCR)mRNA的表達(dá) 在HaCaT細(xì)胞中FGF7可上調(diào)脂質(zhì)合成酶(FAS、ACS、SCD和HMGCR)mRNA的表達(dá)，F(xiàn)GFR2-IIIb D3胞外段及AKT抑制劑可抑制其上調(diào)，且與FGF7組相比差異顯著(P<0.01),見(jiàn)圖5。這進(jìn)一步說(shuō)明，F(xiàn)GF7在HaCaT細(xì)胞中通過(guò)激活FGF受體以及下游AKT信號(hào)通路調(diào)控皮膚脂質(zhì)合成。

2.3FGFR2-IIIb D3胞外段可下調(diào)FGF7激活的p-FGFR、p-AKT和SREBP-1的表達(dá) FGF7可上調(diào)HaCaT細(xì)胞中p-FGFR、p-AKT及SREBP-1的表達(dá)，而FGFR2-IIIb D3胞外段和AKT抑制劑下調(diào)FGF7激活的p-FGFR、p-AKT、SREBP-1的表達(dá)(P<0.01),見(jiàn)圖6。這說(shuō)明FGF7通過(guò)激活FGFR2-IIIb信號(hào)通路中PI3K-AKT信號(hào)調(diào)控SREBP-1c的表達(dá)，調(diào)控下游脂質(zhì)合成酶的表達(dá)，從而調(diào)控皮膚脂質(zhì)的合成；FGFR2-IIIb D3胞外段通過(guò)與FGF7結(jié)合抑制FGFR2-IIIb信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而抑制皮膚脂質(zhì)的合成。

Figure 3. The effect of FGF7 and FGFR2-IIIb D3 extracellular domain on viability of HaCaT cells. The FGF7 and FGFR2-IIIb D3 extracellular segment groups were used as blank controls, and only FGF7 group was added as a positive control. The abscissa is the concentration of extracellular domain of FGFR2-IIIb D3, the ordinate indicates the percentage of cell proliferation. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsblank control group;#P<0.05,##P<0.01vsFGF7 group.

圖3 FGF7和FGFR2-IIIb D3胞外段對(duì)HaCaT細(xì)胞活力的影響

Figure 4. The mRNA expression of SREBP-1c in HaCaT cells treated with FGF7, FGFR2-IIIb D3 extracellular domain and AKT inhibitor MK-2206. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;##P<0.01vsFGF7 group.

圖4 HaCaT細(xì)胞中SREBP-1c mRNA的表達(dá)

2.4FGFR2-IIIb D3胞外段可抑制FGF7激活的脂質(zhì)合成 分別用油紅O染色法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)FGFR2-IIIb D3胞外段對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞中脂質(zhì)合成的影響。結(jié)果顯示，F(xiàn)GF7誘導(dǎo)后HaCaT細(xì)胞的脂質(zhì)含量明顯上調(diào)，用FGFR2-IIIb D3胞外段和AKT抑制劑MK-2206處理后，脂質(zhì)含量下調(diào)，見(jiàn)圖7、8。這說(shuō)明在HaCaT細(xì)胞中FGFR2-IIIb D3胞外段可通過(guò)AKT信號(hào)通路抑制FGF7上調(diào)的脂質(zhì)合成，即FGF7可激活FGFR2-IIIb信號(hào)通路中PI3K-AKT信號(hào)進(jìn)而調(diào)控皮膚脂質(zhì)的表達(dá)。

討 論

角質(zhì)形成細(xì)胞是皮膚脂質(zhì)合成的主要場(chǎng)所，因此我們選擇HaCaT細(xì)胞(人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞)進(jìn)行研究。本文通過(guò)real-time PCR、Western blot和油紅O染色等實(shí)驗(yàn)方法研究FGF7對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞中脂質(zhì)合成的調(diào)控作用。Real-time PCR結(jié)果表明，F(xiàn)GF7可上調(diào)SREBP-1c mRNA及SREBP-1c下游脂質(zhì)合成酶(FAS、ACS、SCD和HMGCR)mRNA的表達(dá)；Western blot結(jié)果表明，F(xiàn)GF7可上調(diào)p-FGFR、p-AKT和SREBP-1蛋白的表達(dá)；油紅O染色和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，F(xiàn)GF7可促進(jìn)脂質(zhì)的合成。同時(shí)，當(dāng)加入AKT抑制劑MK-2206后，F(xiàn)GF7上調(diào)的SREBP-1c及其脂質(zhì)合成酶的mRNA和蛋白水平均被抑制，脂質(zhì)的合成也受到抑制。因此，F(xiàn)GF7可通過(guò)AKT調(diào)控皮膚脂質(zhì)的合成，即FGF7通過(guò)與細(xì)胞膜上受體FGFR2-IIIb結(jié)合后激活FGFR2-IIIb信號(hào)通路中PI3K-AKT信號(hào)，調(diào)控SREBP-1c及其脂質(zhì)合成酶的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控皮膚脂質(zhì)的合成。

Figure 5. The mRNA expression of lipid synthases (FAS, ACS, SCD and HMGCR) in HaCaT cells treated with FGF7 and FGFR2-IIIb D3 extracellular domain or AKT inhibitor MK-2206. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsFGF7 group.

圖5 HaCaT細(xì)胞中脂質(zhì)合成酶(FAS、ACS、SCD和HMGCR)mRNA的表達(dá)

Figure 6. The effect of FGF7, FGFR2-IIIb D3 extracellular domain and AKT inhibitor on the expression of p-FGFR, p-AKT and SREBP-1 in HaCaT cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsFGF7 group.

圖6 FGF7、FGFR2-IIIb D3胞外段和AKT抑制劑對(duì)p-FGFR、p-AKT及SREBP-1的表達(dá)的影響

我們采用等溫滴定量熱法研究FGFR2-IIIb D3胞外段與FGF7的相互作用，以緩沖液對(duì)緩沖液的相互作用、緩沖液對(duì)FGF7的相互作用及FGF7對(duì)緩沖液的相互作用為空白對(duì)照，將實(shí)驗(yàn)組的結(jié)果和空白對(duì)照組的結(jié)果利用Origin軟件進(jìn)行融合后得到FGFR2-IIIb D3胞外段與FGF7的相互作用。ITC結(jié)果表明FGFR2-IIIb D3胞外段可與FGF7結(jié)合。FGFR2-IIIb信號(hào)通路可促進(jìn)細(xì)胞活力，而FGFR2-IIIb胞外段可與細(xì)胞膜上受體競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合FGF7進(jìn)而阻斷FGFR2-IIIb信號(hào)通路，從而抑制細(xì)胞活力，而CCK8結(jié)果也表明FGFR2-IIIb D3胞外段可抑制HaCaT細(xì)胞活力。

FGFR2-IIIb信號(hào)通路主要有3條：Ras-MAPK途徑、PI3K-AKT途徑和PLCγ途徑[8-9]。有肺癌的研究報(bào)道暗示，脂質(zhì)的合成可能與AKT信號(hào)通路相關(guān)[10]，real-time PCR、Western blot、油紅O染色和流式細(xì)胞術(shù)等實(shí)驗(yàn)均證明FGFR2-IIIb D3胞外段可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性地與FGF7的結(jié)合，阻斷FGF7通過(guò)AKT調(diào)控的皮膚脂質(zhì)合成的信號(hào)通路，從而抑制角質(zhì)形成細(xì)胞脂質(zhì)的合成。

綜上所述，本研究闡明了FGF7與細(xì)胞膜上受體FGFR2-IIIb結(jié)合后激活FGFR2-IIIb信號(hào)通路中的PI3K-AKT信號(hào)，調(diào)控SREBP-1c及其脂質(zhì)合成酶的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控角質(zhì)形成細(xì)胞中脂質(zhì)的合成。同時(shí)，我們構(gòu)建的FGFR2-IIIb D3胞外段可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性地與FGF7結(jié)合阻斷FGFR2-IIIb信號(hào)通路，進(jìn)而阻斷皮膚脂質(zhì)合成通路。

Figure 7. Oil red O staining was used to detect the deposition of lipids in HaCaT cells after treatment with FGF7, FGFR2-IIIb D3 extracellular domain and AKT inhibitor MK-2206 (blue-purple: DAPI; red: lipid; ×200).

圖7 油紅染色檢測(cè)HaCaT細(xì)胞中脂質(zhì)的含量

Figure 8. Flow cytometry was used to detect the expression of lipids in HaCaT cells after treatment with FGF7, FGFR2-IIIb D3 extracellular domain and AKT inhibitor MK-2206. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsFGF7 group.

圖8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) HaCaT細(xì)胞中脂質(zhì)的含量