李 波， 鄭 植， 陳芃螈

(四川省醫(yī)學科學院， 四川省人民醫(yī)院兒科， 四川 成都 610072)

急性心力衰竭是一種臨床上常見的心血管系統(tǒng)疾病，感染性內(nèi)毒素血癥誘發(fā)的心力衰竭預后較單純心力衰竭更差[1]。半數(shù)以上的感染性內(nèi)毒素血癥誘發(fā)心力衰竭與革蘭氏陰性菌有關，革蘭氏陰性菌細胞壁外膜上的脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)是其致病的主要原因之一[2]。LPS能夠作用于心肌細胞，誘導心肌組織損傷，導致誘發(fā)心力衰竭[3]。APPL1 (adaptor protein, phosphotyrosine interacting with PH domain and leucine zipper 1)在人體內(nèi)的多個組織和器官中均有表達，參與介導胰島素信號傳遞、胞內(nèi)運輸和細胞增殖等生理過程[4-5]。研究表明，APPL1與心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生具有密切關系，沉默APPL1可以減弱球狀脂聯(lián)素抗缺氧復氧心肌細胞凋亡作用，提高APPL1表達可以顯著增加心肌細胞活力[6-7]。目前對于APPL1在LPS誘導的心肌細胞損傷中作用尚不明確。本實驗探討過表達APPL1對LPS誘導的心肌細胞凋亡及氧化損傷的影響，以期為闡明APPL1在心肌損傷中的作用提供參考資料。

材 料 和 方 法

1 材料

TRIzol試劑、RT-qPCR試劑和逆轉錄試劑盒均購自TaKaRa；HRP標記的IgGⅡ抗購自Proteintech；全蛋白提取液購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；過表達APPL1重組慢病毒載體和陰性對照慢病毒載體由上海銳賽生物技術有限公司構建；超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase, SOD)檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)檢測試劑盒和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；丙二醛(malonaldehyde，MDA)檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所；抗活化的caspase-3(cleaved caspase-3)抗體和APPL1抗體購自Stanta Cruz；活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量檢測試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司。心肌細胞H9c2購自湖南豐暉生物科技有限公司。

2 方法

2.1LPS對心肌細胞中APPL1表達影響 心肌細胞分別經(jīng)過含有0和1 mg/L LPS的細胞培養(yǎng)液(含10%胎牛血清的DMEM)培養(yǎng)，記為對照(control)組和LPS組。用RT-qPCR和Western blot檢測培養(yǎng)24 h后細胞中APPL1的表達變化。

2.1.1RT-qPCR 取control和LPS組的心肌細胞，在細胞中添加TRIzol裂解液，按照TRIzol試劑說明書提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，步驟同逆轉錄試劑盒。取cDNA，以SYBR進行定量PCR，β-actin作為內(nèi)參照，分析APPL1的表達量。設置PCR條件為：95 ℃反應30 s，95 ℃反應3 s；60 ℃反應30 s，40個循環(huán)。引物由上海生工合成，APPL1的上游引物序列為5’-CAGGGTGGAAATTTAATGAG-3’，下游引物序列為 5’-AGGTGATCTGAAAACAATATC-3’。β-actin 的上游引物序列為 5’-GCAGGAGTA2CGAT-GAGTC-3’，下游引物序列為 5’-ACGCAGCTCAGTAACAGT-3’。

2.1.2Western blot 取control和LPS組的心肌細胞，在心肌細胞中添加全蛋白提取液，每5×106個細胞中添加500μL的提取液，在4 ℃震蕩30 s后，離心，吸取上清(全蛋白液)。用BCA法對蛋白定量。在蛋白樣品中以1∶4的體積比添加SDS-PAGE上樣緩沖液，100 ℃煮沸5 min。以12%的分離膠、5%的濃縮膠進行電泳，每孔按照40 μg蛋白樣品上樣，上樣后用80 V的恒壓電泳45 min后，再以120 V的電壓電泳1.5 h后結束電泳。根據(jù)凝膠大小裁剪PVDF膜，在200 mA恒流條件下轉膜45 min。把PVDF膜取出后，在5%的牛血清白蛋白中孵育1.5 h后，置于1∶400稀釋的APPL1抗體中，置于4 ℃的冷室中孵育過夜。再將PVDF膜放在1∶2 000稀釋的Ⅱ抗孵育液中，在室溫結合1.5 h。ECL發(fā)光，用Konda In-Vivo Imagine System F采集圖像，β-acitn作為內(nèi)參照，用ImageJ軟件分析條帶的灰度值。

2.2細胞轉染和分組 心肌細胞培養(yǎng)密度為40%時，把培養(yǎng)液上清吸棄，分別添加APPL1重組慢病毒載體和陰性對照慢病毒載體，同時加入轉染增強劑Polybrene，繼續(xù)培養(yǎng)12 h以后，把病毒液吸棄，添加新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)3 d以后，用1 mg/L的嘌呤霉素篩選4 d。把穩(wěn)定轉染APPL1重組慢病毒載體和陰性對照慢病毒載體的心肌細胞經(jīng)含有1 mg/L LPS的細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)后記為Lv-APPL1和Lv-NC。Control和LPS組處理方法同2.1。用RT-qPCR和Western blot檢測LPS、Lv-NC和Lv-APPL1組細胞培養(yǎng)24 h后細胞中APPL1的表達變化。

2.3MTT檢測細胞活力 取control、LPS、Lv-NC和Lv-APPL1組細胞按照上述各組的分組，分別接種到96孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)24 h后，在每個孔內(nèi)添加5 g/L的MTT溶液，置于37 ℃孵育4 h，把上清溶液吸棄以后，加入100 μL的DMSO溶液，震蕩反應10 min，紫色結晶溶解以后，測定570 nm的A值(以空白孔調(diào)零)。相對活力(%)=實驗組A÷對照組A×100%

2.4流式細胞術檢測細胞凋亡 取control、LPS、Lv-NC和Lv-APPL1細胞按照上述各組的分組，培養(yǎng)24 h后，用胰蛋白酶消化后，配制成單細胞懸浮液，收集106個細胞，以300 μL的結合緩沖液懸浮以后，添加PI和Annexin V-FITC染液，繼續(xù)加入200 μL的結合緩沖液，流式細胞儀檢測凋亡變化。同時用Western blot方法檢測細胞中cleaved caspase-3蛋白水平，步驟同上。

2.5LDH和MDA水平檢測 取control、LPS、Lv-NC和Lv-APPL1細胞按照上述各組的分組，培養(yǎng)24 h后，收集培養(yǎng)液上清及細胞，用硫代巴比妥酸法檢測細胞中MDA含量，用2,4-二硝基苯肼顯色法檢測培養(yǎng)液中LDH水平，步驟參照試劑盒標準流程。

2.6SOD和GSH-Px活性檢測 取control、LPS、Lv-NC和Lv-APPL1細胞按照上述各組的分組，培養(yǎng)24 h后，以胰蛋白酶消化后，反復凍融法將細胞裂解以后，用黃嘌呤氧化酶法檢測細胞中SOD活性，5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)比色法測定細胞中GSH-Px活性，步驟均同試劑盒標準操作流程。

2.7流式細胞術檢測細胞中ROS水平 取control、LPS、Lv-NC和Lv-APPL1細胞按照上述各組的分組，培養(yǎng)24 h后，用4 ℃預冷的PBS將細胞洗滌3次以后，添加0.25%的胰蛋白酶消化后，收集細胞，添加10 μmol/L的DCFH-DA染液500 μL，置于37 ℃孵育30 min后，離心棄上清，用冰預冷的PBS洗滌以后，配制成1×108/L的懸浮液，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為530 nm，用流式細胞儀檢測熒光強度，以熒光強度表示ROS水平。

3 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)均經(jīng)過SPSS 21.0軟件統(tǒng)計分析，計量資料按照均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，兩組數(shù)據(jù)間比較用t檢驗，多組差異比較用單因素方差，組間比較用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 LPS降低心肌細胞中APPL1表達水平

心肌細胞經(jīng)過LPS處理以后，細胞中的APPL1 mRNA和蛋白水平均顯著降低(P<0.05)，LPS抑制心肌細胞中APPL1的表達，見圖1、表1。

Figure 1. Western blot was used to detect the expression level of APPL1 in LPS-induced cardiomyocytes.

圖1 Western blot檢測APPL1在LPS誘導的心肌細胞中的表達水平

表1 LPS處理后心肌細胞中APPL1表達水平

Table 1. Expression of APPL1 in cardiac myocytes after LPS treatment (Mean±SD.n=3)

GroupAPPL1 mRNAAPPL1 proteinControl1.000.46±0.05LPS0.65±0.08?0.21±0.03?

*P<0.05vscontrol group.

2 APPL1重組慢病毒提高LPS條件下心肌細胞中APPL1表達水平

APPL1重組慢病毒轉染后的心肌細胞經(jīng)過LPS處理后，細胞中的APPL1 mRNA和蛋白水平均顯著升高(P<0.05)，見圖2、表2。

Figure 2. Western blot was used to detect the effect of lentiviral overexpression of APPL1 on the expression of APPL1 in cardiac myocytes under LPS condition.

圖2 Western blot檢測過表達APPL1慢病毒對LPS條件下心肌細胞中APPL1表達影響

表2 過表達APPL1慢病毒感染后經(jīng)LPS處理后的心肌細胞中APPL1表達水平

Table 2. APPL1 expression level in cardiomyocytes treated with LPS after APPL1 overexpression lentivirus infection(Mean±SD.n=3)

GroupAPPL1 mRNAAPPL1 proteinLPS1.000.25±0.03Lv-NC1.04±0.090.24±0.06Lv-APPL12.54±0.18?0.39±0.04?

*P<0.05vsLPS group.

3 過表達APPL1提高LPS條件下心肌細胞活力并誘導心肌細胞凋亡

LPS處理后的心肌細胞活力降低，細胞凋亡率及細胞中cleaved caspase-3蛋白水平升高(P<0.05)。過表達APPL1后的心肌細胞經(jīng)LPS處理后，細胞活力升高，細胞凋亡率及細胞中cleaved caspase-3蛋白水平降低(P<0.05)，見圖3、表3。

Figure 3. Overexpression of APPL1 reduced LPS-induced cardiomyocyte apoptosis. A: flow cytometry was used to detect the effect of overexpression of APPL1 on LPS-induced cardiomyocyte apoptosis； B: effect of overexpression of APPL1 on the level of apoptotic protein cleaved caspase-3 in LPS-induced cardiomyocytes detected by Western blot.

圖3 過表達APPL1減少LPS誘導的心肌細胞凋亡

4 過表達APPL1減輕LPS條件下心肌細胞氧化損傷

LPS處理后的心肌細胞培養(yǎng)液中LDH活性升高，同時細胞中MDA含量也升高。過表達APPL1后的心肌細胞經(jīng)LPS處理后，細胞培養(yǎng)液中LDH活性降低，細胞中MDA水平也降低(P<0.05)，見表4。

5 過表達APPL1提高LPS條件下心肌細胞中抗氧化酶活性并降低細胞中ROS水平

LPS處理后的心肌細胞中SOD和GSH-Px活性降低，細胞中ROS水平升高。過表達APPL1后的心肌細胞經(jīng)LPS處理后，細胞中SOD和GSH-Px活性升高，細胞中ROS水平降低(P<0.05)，見表5。

表3 過表達APPL1的心肌細胞經(jīng)LPS處理后細胞活力、凋亡率及細胞中cleaved caspase-3蛋白水平

Table 3. Cell viability, apoptosis rate and cleaved caspase-3 protein level of cardiomyocytes with APPL1 overexpression after LPS treatment (Mean±SD.n=3)

GroupCell viability (%)Apoptosis rate (%)Cleaved caspase-3Control100.005.63±0.570.21±0.03LPS63.32±7.51&32.26±3.89&0.68±0.08&Lv-NC65.21±8.2030.59±4.620.65±0.06Lv-APPL179.69±5.16?21.40±1.34?0.31±0.04?

*P<0.05vsLPS and Lv-NC group；&P<0.05vscontrol group.

表4 過表達APPL1的心肌細胞經(jīng)LPS處理后細胞中MDA含量及培養(yǎng)液中LDH活性

Table 4. The content of MDA and the activity of LDH in the culture medium of APPL1-overexpressing cardiomyocytes after LPS treatment (Mean±SD.n=3)

GroupLDH (U/L)MDA (μmol/g)Control4.20±0.369.37±0.85LPS35.27±4.69&28.54±3.14&Lv-NC36.20±4.9526.81±3.59Lv-APPL118.26±1.18?16.55±1.27?

*P<0.05vsLPS and Lv-NC group；&P<0.05vscontrol group.

表5 過表達APPL1的心肌細胞經(jīng)LPS處理后細胞中ROS含量及SOD和GSH-Px活性

Table 5. ROS content and SOD and GSH-Px activity in cardiomyocytes with APPL1 overexpression after LPS treatment (Mean±SD.n=3)

GroupSOD (×103 U/g)GSH-Px (U/g)ROS (fluorescence intensity)Control89.47±9.32816.45±58.2617.48±1.64LPS41.56±4.59&412.20±40.76&89.52±7.63&Lv-NC40.20±3.12408.59±45.1790.58±6.20Lv-APPL164.17±3.79?597.12±50.92?45.01±3.57?

*P<0.05vsLPS and Lv-NC group；&P<0.05vscontrol group.

討 論

LPS是感染性內(nèi)毒素血癥心力衰竭發(fā)生的重要原因，LPS存在于革蘭氏陰性菌細胞壁外膜上，是革蘭氏陰性菌致病發(fā)生的因素[8]。LPS能夠誘導心肌損傷，促進心肌細胞氧化損傷，誘導心肌細胞凋亡[9]。本實驗結果顯示，LPS處理后的心肌細胞活力降低，細胞凋亡率升高，同時細胞中凋亡標志蛋白活化的caspase-3水平升高，細胞中ROS水平也升高，說明成功構建了LPS心肌細胞損傷模型。

APPL1蛋白沒有跨膜區(qū)且具有高親水性，含有3個功能結構域，參與轉錄抑制、小GTP酶結合、信號轉導通路蛋白質結合、增加BAR與GTP酶的結合和BAR結構域脂質特異性發(fā)揮過程[10-14]。APPL1在骨骼肌、腎臟等多種組織中均可表達，參與胰島素信號轉導、神經(jīng)元存活和神經(jīng)突起形成等過程[15-16]。近年研究顯示，APPL1具有抗心肌細胞凋亡作用，在心肌缺氧復氧損傷中發(fā)揮保護作用，沉默APPL1基因可以逆轉球狀脂聯(lián)素對心肌纖維化的抑制作用，另外，APPL1還參與心力衰竭和糖尿病心肌病損傷過程[6, 7, 17-18]。本實驗結果顯示，LPS降低心肌細胞中APPL1的表達，過表達APPL1可以抑制LPS對心肌細胞凋亡促進和活力抑制作用，這說明APPL1能夠減輕LPS誘導的心肌細胞損傷，這與上述研究報道結果類似。

心肌細胞氧化損傷存在于多種原因誘導的心肌損傷中，例如：糖尿病心肌病、心肌肥大、動脈粥樣硬化和膿毒癥心肌損傷等[19-20]。氧自由基能夠被機體內(nèi)的抗氧化酶降解，從而使機體內(nèi)氧自由基處于動態(tài)平衡狀態(tài)[21]。SOD和GSH-Px是存在于人體組織中的抗氧化酶，二者活性降低后是細胞氧化損傷發(fā)生的標志[22]。細胞內(nèi)過量的氧自由基可以引起存在于細胞膜上的脂質發(fā)生過氧化，導致細胞膜的完整性受到破壞，使存在于細胞內(nèi)的LDH釋放至細胞外，而MDA是脂質過氧化的產(chǎn)物。另外，細胞內(nèi)過量的ROS可以誘導細胞內(nèi)caspase凋亡反應激活，促進下游凋亡執(zhí)行因子caspase-3的活化，最終誘導細胞凋亡發(fā)生[23-24]。本實驗表明，過表達APPL1后的心肌細胞中ROS水平降低，細胞中SOD和GSH-Px活性升高，細胞生成的MDA水平也降低，細胞培養(yǎng)培養(yǎng)液中LDH水平降低，細胞中活化的caspase-3蛋白水平降低，說明過表達APPL1可以減輕LPS誘導的心肌細胞氧化損傷，提高心肌細胞中抗氧化酶活性，減少細胞凋亡，表明APPL1可能通過減少LPS誘導的心肌細胞氧化損傷而發(fā)揮抗心肌細胞凋亡的作用，APPL1在心肌組織損傷中可能發(fā)揮保護作用。

綜上所述，APPL1參與LPS誘導的心肌細胞損傷發(fā)生，過表達APPL1可以減少LPS誘導的心肌細胞氧化損傷和凋亡，這對于研究APPL1在心血管系統(tǒng)疾病中的作用具有意義，為研究感染誘導的心肌損傷發(fā)生機制提供了參考。另外，本次實驗研究沒有在原代心肌細胞和體內(nèi)進行驗證，對于其具體的靶向作用機制仍不清楚，在以后的實驗中會對上述部分內(nèi)容進行探討。