郭曼莉 高玉元 張晴曦 聶坤 王麗娟

帕金森?。≒arkinson disease，PD）是最常見的神經(jīng)退行性疾病之一，其主要的病理改變是黑質(zhì)-紋狀體多巴胺能神經(jīng)元的脫失。α-突觸核蛋白（alpha-synuclein，α-syn）異常聚集形成的的路易小體，與神經(jīng)元的死亡密切相關(guān)[1]。α-突觸核蛋白基因（SNCA）A53T點(diǎn)突變是家族性PD常見致病突變類型[2-3]。β淀粉樣蛋白（Aβ）級(jí)學(xué)說是阿爾茲海默?。ˋlzheimer disease，AD）的主流學(xué)說，Aβ1-42是AD主要病理成分，有多種聚合形態(tài)，其中Aβ1-42寡聚體毒性最強(qiáng)。研究表明，Aβ1-42參與PD的病理發(fā)病過程，與PD患者認(rèn)知損害和步態(tài)障礙相關(guān)[4-5]。Aβ1-42寡聚體可促進(jìn)α-syn的聚集和神經(jīng)元的死亡。自噬是神經(jīng)元內(nèi)重要的蛋白途徑，αsyn的自噬性降解障礙被認(rèn)為是PD的重要病理過程。Aβ1-42對(duì)PD自噬功能的影響鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。本研究將建立α-synA53T過表達(dá)的帕金森病體外模型，檢測Aβ1-42寡聚體處理前后細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白 p62、LC3、Beclin-1的變化，以探究 Aβ1-42寡聚體在PD中對(duì)細(xì)胞自噬的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)SHSY5Y細(xì)胞由廣州賽庫生物技術(shù)有限公司進(jìn)行STR鑒定，以含體積分?jǐn)?shù)0.10的胎牛血清、100 U/mL的青鏈霉素雙抗的DMEM/F-12培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37°C、含體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次。

1.2 細(xì)胞慢病毒轉(zhuǎn)染在轉(zhuǎn)染前1 d，將處于對(duì)數(shù)生長期的SHSY5Y細(xì)胞按每孔105個(gè)細(xì)胞接種于24孔板中，使其在轉(zhuǎn)染次日達(dá)到80%的融合度。24 h后吸去舊培養(yǎng)液，加入新的無血清培養(yǎng)液，在培養(yǎng)液中分別加入純化的攜帶SNCAA53T慢病毒液和攜帶空載體病毒液 （廣州復(fù)能基因有限公司），12 h更換為含 10%FBS的 DMEM/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng);慢病毒感染72 h后，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)加入終濃度為 1 μg/mL嘌呤霉素篩選 SNCAA53T穩(wěn)定過表達(dá)的 SHSY5Y細(xì)胞（SHSY5YA53T組），以及空載體對(duì)照細(xì)胞（SHSY5YCON組），細(xì)胞繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)。

1.3 熒光實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)法檢測SNCA在SHSY5Y細(xì)胞中的表達(dá)細(xì)胞轉(zhuǎn)染慢病毒后嘌呤霉素篩選 7 d，將 SHSY5YA53T組，SHSY5YCON組，SHSY5Y正常細(xì)胞組細(xì)胞用Trizol法提取總RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和熒光實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增，以檢測SNCAmRNA的表達(dá)情況。引物使用Primer-BLAST在線設(shè)計(jì)，華大基因科技有限公司合成。SNCA引物的上游序列為：5'-AA GAGGGTGTTCTCTATGTAGGC-3'，下游序列為：5'-GCTCCTCCAACATTTGTCACTT-3'；內(nèi)參照ACTB引物的上游序列為：5'-GGCACCCAGCACAATGAAG-3'，下游序列為：5'-CCGATCCACACGGAGTACTTG-3'。 qPCR 反應(yīng)參數(shù)為：95°C 預(yù)變性 30 s，95°C 5 s、60°C 30 s，循環(huán) 40 次。

1.4 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖將處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞按每孔105接種于96孔板中，加入不同濃度的 Aβ1-42寡聚體，置于 37°C、體積分?jǐn)?shù) 0.05 CO2。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，每孔加入 10 μL CCK-8溶液，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)避光孵育4 h;在酶標(biāo)儀450 nm測定吸光度。

1.5 Aβ1-42寡聚體的制備[6-7]冰上用HFIF將Aβ1-42多肽（英國ABCAM）充分溶解至1mmol/L，室溫下于通風(fēng)處內(nèi)揮發(fā)過夜，制備得Aβ1-42肽膜。使用時(shí)用預(yù)冷的無水DMSO溶解肽膜至5 mmol/L，加入PBS獲得100 μmol/L的Aβ1-42單體母液。取適量的Aβ1-42單體母液于4℃放置24 h，制備得Aβ1-42寡聚體。

1.6 細(xì)胞接種與處理細(xì)胞吹打制成單細(xì)胞懸液，用DMEM/F-12培養(yǎng)液將細(xì)胞密度稀釋為1×106/L，每孔2000 μL接種至多聚-L-賴氨酸預(yù)處理的6孔板中，于37°C、含體積分?jǐn)?shù)0.05的 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分組處理：A53T組：無血清培養(yǎng)基孵育SHSY5YA53T24 h；CON組：無血清培養(yǎng)基孵育SHSY5YNC24 h；A53T+Aβ 單組：10 μmol/L 的Aβ1-42單體孵育SHSY5YA53T24h；CON+Aβ單組： 用10 μmol/L的Aβ1-42單體孵育SHSY5YNC24 h。A53T+Aβ寡組：10 μmol/L 的 Aβ1-42寡聚體孵育SHSY5YA53T24 h；CON+Aβ 寡組：用 10 μmol/L 的Aβ1-42寡聚體孵育SHSY5YNC24 h。

1.7 Western blot法測定 p62、LC3、Beclin-1 表達(dá)變化 各組細(xì)胞處理后，使用RIPA（碧云天）裂解提取總蛋白，用BCA法進(jìn)行蛋白定量后，按20 μg加樣量進(jìn)行免疫沉淀。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，將PVDF膜用脫脂奶粉常溫封閉2 h，分別置于p62（1：1000，CST，兔多克隆抗體）、LC3 一抗(1∶1000，CST)、Beclin-1(1：1000，CST)、GAPDH 一抗(1：10000，CST)孵育，4°C搖床過夜，然后與 HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶10000)室溫孵育1 h后，用 ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒曝光顯色，條帶的強(qiáng)弱用ImageJ分析軟件進(jìn)行灰度分析。以 Beclin-1、p62、LC3-Ⅱ與GAPDH的平均灰度的比值表示 Beclin-1、p62、LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用GraphPad Prism6軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示，兩組間比較采用單因素方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 外源SNCA在SHSY5Y細(xì)胞中的表達(dá)細(xì)胞轉(zhuǎn)染慢病毒后嘌呤霉素篩選7 d，SHSY5YA53T組mRNA和α-syn表達(dá)水平較SHSY5Y組明顯增高（P＜0.05），基因過表達(dá) 41 倍。 SHSY5YCON組和SHSY5Y正常細(xì)胞比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）。SNCAmRNA RT-qPCR結(jié)果和α-syn Western blot結(jié)果見圖1。

圖1 外源α-syn基因在SHSY5Y細(xì)胞中的表達(dá) A為SNCA mRNA在各組細(xì)胞中的表達(dá)；B為α-syn在各組細(xì)胞中的表達(dá)量。 *P＜0.05

2.2 SHSY5Y組、SHSY5YCON 組、SHSY5YA53T組細(xì)胞增殖不受抑制SHSY5Y組、SHSY5YCON組、SHSY5YA53T組細(xì)胞分別接種至 96孔板，1×104細(xì)胞/孔，相同條件下培養(yǎng)，CCK-8法連續(xù)5日檢測細(xì)胞活力，結(jié)果顯示，各組細(xì)胞生長狀況良好。各組細(xì)胞增殖速度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

2.3 Aβ1-42寡聚體抑制細(xì)胞的增殖不同濃度的Aβ1-42寡聚體處理 SHSY5YCON組、SHSY5YA53T組細(xì)胞24 h，細(xì)胞的增殖均受抑制，隨著Aβ1-42寡聚體濃度的增加，細(xì)胞增殖的抑制效果更明顯。SHSY5YA53T組的抑制效果較SHSY5YCON組顯著。

圖2 不同濃度Aβ1-42寡聚體干預(yù)細(xì)胞24 h后細(xì)胞的活力檢測*：與 SHSY5YCON對(duì)照組相比，P＜0.05;#：與 0 μmmol/LAβ1-42寡聚體處理組相比，P＜0.05

2.4 細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)Western blot結(jié)果顯示，與SHSY5YCON對(duì)照組相比，Aβ1-42單體和寡聚體處理后，SHSY5YA53T組細(xì)胞Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）見圖3。兩組間P62蛋白表達(dá)均有增加趨勢，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.489）。

3 討論

本研究通過構(gòu)建α-synA53T過表達(dá)的SHSY5Y細(xì)胞模型模擬PD神經(jīng)元的病理特點(diǎn)，結(jié)果提示，α-synA53T過表達(dá)的SHSY5Y細(xì)胞，增殖存活率無明顯下降，α-synA53T過表達(dá)對(duì)細(xì)胞無明顯的毒性作用，PAL、SCARLATA等[8-9]研究認(rèn)為只有在特定的氧化應(yīng)激或炎癥等誘發(fā)因素干擾下，過表達(dá)αsyn才有細(xì)胞毒性作用。

圖3 Western Blot法檢測自噬相關(guān)蛋白的表達(dá) A：自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)情況；B：LC3-Ⅱ的相對(duì)表達(dá)水平；C：p62蛋白的相對(duì)表達(dá)水平；D：Beclin-1蛋白的相對(duì)表達(dá)水平 *P＜0.05，**P＜0.001

相關(guān)臨床研究發(fā)現(xiàn)與健康對(duì)照相比，Aβ1-42在PD患者腦組織中沉積增多[4]，且與PD患者認(rèn)知損害和步態(tài)障礙相關(guān)[4-5]。GILBERT等[10]發(fā)現(xiàn)降低Aβ的表達(dá)可以延緩α-syn相關(guān)的神經(jīng)退行性改變。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Aβ1-42寡聚體處理后，αsynA53T過表達(dá)SHSY5Y細(xì)胞和對(duì)照組SHSY5Y細(xì)胞增殖受抑制，在兩組細(xì)胞中均具有明顯的細(xì)胞毒性，對(duì)α-synA53T過表達(dá)組細(xì)胞的毒性作用更顯著，與LIN等[11]研究結(jié)果相符。自噬是神經(jīng)元清除異常折疊蛋白的重要途徑，在AD中，Aβ1-42可損害自噬功能引起tau蛋白的沉積[12-13]。本研究對(duì)比Aβ1-42寡聚體處理前后，SHSY5YA53T組和SHSY5YCON對(duì)照組自噬相關(guān)蛋白 LC3-Ⅱ，p62，Beclin-1的表達(dá)水平，SHSY5YA53T組LC3-Ⅱ蛋白和Beclin-1蛋白的表達(dá)相比對(duì)照組減少，p62蛋白表達(dá)未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 LC3-Ⅱ是目前最廣泛檢測的自噬指標(biāo)，隨細(xì)胞內(nèi)自噬功能激活增多，Beclin-1下調(diào)提示細(xì)胞自噬功能活性受抑制[14]。α-synA53T過表達(dá)的細(xì)胞中，Aβ1-42寡聚體可抑制細(xì)胞的自噬功能，在對(duì)照組細(xì)胞中，未觀察到自噬相關(guān)蛋白的改變。p62作為另一重要的自噬指標(biāo)，可連接LC3-Ⅱ，介導(dǎo)泛素化底物的自噬性降解，本研究兩組細(xì)胞中，p62蛋白改變均不明顯，可能與p62蛋白變化的滯后性相關(guān)[15]。本研究設(shè)立Aβ1-42單體處理對(duì)照組，自噬蛋白變化趨勢與Aβ1-42寡聚體處理組相符，可能為細(xì)胞37℃孵育過程與寡聚化處理過程相似，Aβ1-42單體產(chǎn)生聚集[7]。

綜上所述，通過慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建人α-synA53T過表達(dá)的SHSY5Y細(xì)胞模型，可以穩(wěn)定模擬PD神經(jīng)元α-syn過表達(dá)的病理表現(xiàn)，可作為PD發(fā)病機(jī)制研究的體外模型。Aβ1-42寡聚體抑制該細(xì)胞模型的存活和增殖，與對(duì)照組細(xì)胞相比，Aβ1-42寡聚體處理后，過表達(dá)組LC3-Ⅱ、Beclin-1自噬相關(guān)蛋白表達(dá)減少，提示Aβ1-42寡聚體通過抑制細(xì)胞的自噬功能在PD發(fā)病過程中促進(jìn)神經(jīng)元的死亡。本研究的不足之處是，Aβ1-42寡聚體在PD體外模型中抑制自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ的表達(dá)，Aβ1-42寡聚體也可能是PD自噬功能受損的產(chǎn)物，后續(xù)研究仍需進(jìn)一步探索Aβ1-42寡聚體在PD自噬損傷過程的具體機(jī)制。