黃慧 張曉潔 傅瀟雅 郝偉 向小軍

狂飲在青少年人群中較為常見(jiàn)[1]。研究發(fā)現(xiàn)間歇性酒精暴露（adolescent intermittent ethanol exposure，AIE）能較好地模擬青少年狂飲，經(jīng)過(guò)AIE處理的大鼠，酒精消耗量增加，焦慮水平升高[2-3]。然而研究結(jié)果并不一致，部分研究報(bào)道AIE雖然能增強(qiáng)大鼠對(duì)酒精的犒賞效應(yīng)，但降低焦慮水平[4-5]。C57BL/6小鼠對(duì)酒精存在天然偏好，較容易形成穩(wěn)定的酒精條件性位置偏愛(ài) （conditioned place preference，CPP）[6]，也是焦慮行為相關(guān)研究中頻繁用到的動(dòng)物[7]。目前AIE研究多以大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，缺乏小鼠的研究，AIE對(duì)小鼠酒精犒賞效應(yīng)及焦慮行為的作用尚不明確。故本研究擬在青少年期C57BL/6小鼠中通過(guò)AIE建立狂飲模型，利用酒精CPP評(píng)價(jià)酒精犒賞效應(yīng)，使用高架十字迷宮（elevated plus maze，EPM）實(shí)驗(yàn)測(cè)試其焦慮水平，以探討青少年狂飲對(duì)酒精犒賞及焦慮行為的影響，以期為青少年狂飲的早期干預(yù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物100只SPF級(jí)4周齡健康雄性C57BL/6小鼠，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，動(dòng)物飼養(yǎng)間內(nèi)溫度（23±1）℃，濕度 55%±5%，小鼠自由進(jìn)食及飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)流程本研究由兩部分實(shí)驗(yàn)構(gòu)成。實(shí)驗(yàn)1，將20只小鼠隨機(jī)分成AIE組及NS組，每組10只，一組接受AIE處理，一組接受生理鹽水處理；24 h后2組小鼠均行酒精的CPP實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)2，另取80只小鼠經(jīng)EPM測(cè)試后，分為高、低焦慮組（20只/組），中間水平焦慮小鼠淘汰；高、低焦慮組中再分別隨機(jī)分為AIE組、NS組 （10只/組），分別接受AIE處理或生理鹽水處理；24 h后，4組小鼠再次行EPM測(cè)試。在實(shí)驗(yàn)2中，高焦慮NS組及低焦慮NS組各死亡2只小鼠，故最終只有8只小鼠的數(shù)據(jù)納入分析。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 AIE方法 利用AIE模擬青少年狂飲。AIE方法參照VETRENO等[8]的研究：小鼠腹腔注射25%酒精（3 g/kg），連續(xù)給藥 2 d 后，停止 2 d，后繼續(xù)給藥2 d，再停止2 d，即在小鼠出生后36 d、37 d、40 d、41 d、44 d、45 d、48 d、49 d 時(shí)腹腔注射酒精，一共給藥8次，總耗時(shí)16 d。生理鹽水處理即按照上述流程給予小鼠等體積生理鹽水腹腔注射。

1.3.2 CPP實(shí)驗(yàn) 利用CPP實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)酒精的犒賞效應(yīng)。CPP裝置及分析系統(tǒng)購(gòu)自上海吉量軟件科技有限公司。該裝置由4個(gè)CPP箱組成，4只小鼠可同時(shí)進(jìn)行CPP實(shí)驗(yàn)。每個(gè)CPP箱由兩側(cè)箱體及中間箱構(gòu)成，左側(cè)箱體為黑白橫條紋及網(wǎng)格底板，右側(cè)箱體為黑白豎條紋及橫杠底板。中間箱較狹窄，與兩側(cè)箱體之間有活動(dòng)擋板隔斷，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要開(kāi)啟或關(guān)閉。裝置自帶紅外傳感器，能自動(dòng)記錄小鼠的活動(dòng)情況，并將數(shù)據(jù)傳輸至分析系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)方法參照VALLOF等[9]的研究。第1天進(jìn)行預(yù)適應(yīng)，將中間箱擋板取出，小鼠從中間箱放入，小鼠在CPP裝置中自由活動(dòng)30 min。第2天進(jìn)行預(yù)測(cè)試，將中間箱擋板取出，小鼠從中間箱放入，小鼠在CPP裝置中自由活動(dòng)15 min，記錄其在兩側(cè)箱體中停留的時(shí)間，選擇停留時(shí)間較短一側(cè)箱體作為小鼠CPP訓(xùn)練的伴藥側(cè)，即CPP訓(xùn)練時(shí)給予酒精后小鼠放入的一側(cè)，記錄預(yù)測(cè)試伴藥側(cè)停留時(shí)間。訓(xùn)練（第3～10天）：將中間箱擋板放入，左右兩側(cè)箱體與中間箱隔斷，第3、5、7、9天上午8點(diǎn)，小鼠分批次腹腔注射20%酒精（2 g/kg，12.5 mL/kg）后隨即放入伴藥側(cè)活動(dòng) 50 min；第 4、6、8、10 天上午8點(diǎn)，小鼠分批次腹腔注射等體積生理鹽水（12.5 mL/kg）后隨即放入非伴藥側(cè)活動(dòng)50 min。測(cè)試（第11天）：末次訓(xùn)練24 h后，將中間箱擋板取出，小鼠從中間箱放入，小鼠在CPP裝置中自由活動(dòng)15 min，記錄小鼠在伴藥側(cè)停留的時(shí)間。CPP值（單位：s）為測(cè)試時(shí)伴藥側(cè)停留時(shí)間與預(yù)測(cè)試時(shí)伴藥側(cè)停留時(shí)間之差。若測(cè)試伴藥側(cè)停留時(shí)間比預(yù)測(cè)試伴藥側(cè)停留時(shí)間顯著延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則說(shuō)明小鼠形成酒精CPP。

1.3.3 EPM實(shí)驗(yàn)及分組 利用EPM實(shí)驗(yàn)評(píng)估小鼠的焦慮行為。實(shí)驗(yàn)流程參照吳冰潔等[10]的研究，上午8點(diǎn)小鼠轉(zhuǎn)運(yùn)到行為學(xué)實(shí)驗(yàn)室專(zhuān)用臨時(shí)籠架，適應(yīng)環(huán)境30 min；之后，小鼠面朝EPM開(kāi)放臂，放置于開(kāi)放臂與閉合臂接合處，自由活動(dòng)5 min。記錄開(kāi)放臂及閉合臂停留時(shí)間，計(jì)算開(kāi)放臂時(shí)間比（the percentage of time spent in the open arms，OT%），OT%=開(kāi)放臂時(shí)間/（開(kāi)放臂時(shí)間+閉合臂時(shí)間）×100%。高、低焦慮小鼠分組標(biāo)注參照HUANG等[11]的研究：根據(jù) OT%的第 25百分位數(shù)（P25）及第75百分位數(shù)（P75）將小鼠分為低焦慮組（OT%≥P75）和高焦慮組（OT%≤P25），其余小鼠（P25＜OT%＜P75）均被淘汰。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)1中，測(cè)試伴藥側(cè)停留時(shí)間與預(yù)測(cè)試伴藥側(cè)停留時(shí)間的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，CPP值組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)2分別在高、低焦慮組中，前后兩次開(kāi)放臂時(shí)間比在AIE組和NS組間比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)1小鼠酒精CPP值實(shí)驗(yàn)1中，AIE組小鼠測(cè)試和預(yù)測(cè)試伴藥側(cè)停留時(shí)間分別為（401.6±20.9）s和（285.5±14.3）s，前者較后者延長(zhǎng)（t=4.502，P=0.001）；NS組小鼠測(cè)試和預(yù)測(cè)試伴藥側(cè)停留時(shí)間分別為（352.0±12.6）s 和（281.2±14.1）s，前者較后者延長(zhǎng)（t=2.504，P=0.041）。AIE 組和 NS組 CPP值分別為（116.1±12.9）s 和（70.8±14.8）s，AIE 組CPP 值比 NS 組更高（t=2.274，P=0.035）。

2.2 實(shí)驗(yàn)2小鼠處理前后開(kāi)放臂時(shí)間比實(shí)驗(yàn)2中OT%經(jīng)重復(fù)測(cè)量方差分析，對(duì)于高焦慮小鼠，時(shí)間主效應(yīng) （F=1.952，P=0.181）、AIE分組主效應(yīng)（F=0.250，P=0.624）及二者的交互作用（F=0.098，P=0.759）均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)于低焦慮小鼠，時(shí)間主效應(yīng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=12.199，P=0.003），AIE 分組主效應(yīng)（F=1.910，P=0.186）及二者的交互作用（F=1.648，P=0.218）無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 見(jiàn)表 1。

表1 高、低焦慮小鼠在AIE或NS處理前后EPM實(shí)驗(yàn)開(kāi)放臂時(shí)間比（OT%）

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，與NS組相比，AIE組CPP值更高，提示AIE促進(jìn)青少年期小鼠酒精CPP的形成，青少年狂飲可能會(huì)增加酒精使用障礙的患病風(fēng)險(xiǎn)。該結(jié)果與既往在大鼠研究中的結(jié)果相一致[2-3，12-13]，說(shuō)明狂飲對(duì)酒精犒賞效應(yīng)的促進(jìn)作用可能與動(dòng)物品系無(wú)關(guān)。既往研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，AIE能誘導(dǎo)青少年大鼠杏仁核區(qū)組蛋白甲基化[2]或乙酰化[10]，或前額葉組蛋白乙?；痆3]，進(jìn)而導(dǎo)致其酒精消耗量增加。說(shuō)明青少年期大鼠狂飲可能會(huì)導(dǎo)致某些腦區(qū)組蛋白修飾發(fā)生改變，進(jìn)而增加酒精覓藥行為及飲酒量，促進(jìn)酒精使用障礙的發(fā)生和發(fā)展，但其中的分子生物學(xué)機(jī)制仍需深入探索。

本研究還發(fā)現(xiàn)，AIE處理不改變高、低焦慮小鼠的焦慮水平，提示AIE對(duì)小鼠酒精CPP的促進(jìn)作用與焦慮無(wú)關(guān)。該結(jié)果與既往以Wistar大鼠或SD大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象的研究結(jié)果相一致[14-15]。MARCO等[15]報(bào)道，青少年期Wistar大鼠經(jīng)AIE處理后使用EPM測(cè)量其焦慮水平，發(fā)現(xiàn)其與對(duì)照組無(wú)差異，該結(jié)果在CIPPITELLI等[14]研究中得到驗(yàn)證。另外，PANDE等[12]發(fā)現(xiàn)，給予青少年期SD大鼠AIE處理后進(jìn)行黑白箱實(shí)驗(yàn)及EPM測(cè)試，也發(fā)現(xiàn)其焦慮水平不變。本研究在AIE處理后24 h再次測(cè)量小鼠的焦慮水平，即停止酒精攝入后24 h，小鼠處于酒精戒斷期，而青少年期小鼠對(duì)酒精戒斷所致焦慮不敏感[16]，故焦慮水平不發(fā)生明顯改變。另一個(gè)可能原因是，本研究的酒精劑量不足以使小鼠在停止飲酒24 h后出現(xiàn)戒斷癥狀，因此不會(huì)出現(xiàn)焦慮水平升高，在今后的研究中，需要設(shè)置不同劑量酒精來(lái)加以證實(shí)。此外，AIE實(shí)驗(yàn)中酒精給藥方式可能也會(huì)影響動(dòng)物的焦慮水平：本研究酒精的給藥方式為腹腔注射，小鼠焦慮水平不變；有研究通過(guò)口服給予酒精，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AIE會(huì)升高焦慮水平[17]；而通過(guò)吸入給予酒精，結(jié)果則顯示AIE降低焦慮水平[18]。

本研究初步明確AIE增強(qiáng)小鼠對(duì)酒精的犒賞效應(yīng)，同時(shí)不改變小鼠的焦慮水平，提示臨床中應(yīng)及早對(duì)青少年狂飲進(jìn)行干預(yù)，為青少年狂飲的預(yù)防及早期干預(yù)提供了理論依據(jù)。本研究的不足主要在于缺乏相關(guān)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，未能探討AIE增強(qiáng)酒精犒賞的分子機(jī)制，未來(lái)將會(huì)從組蛋白修飾等方面進(jìn)一步開(kāi)展研究。