黃俠 卓敏 李時(shí)佳 吳逢春 陳軍 韓俊南 吳凱*※

近年來(lái)，由于腸道菌群與人類健康和疾病的關(guān)系密切而備受關(guān)注。腸道菌群不僅可調(diào)控食物消化能力，維持免疫系統(tǒng)的運(yùn)作，而且能通過(guò)腦—腸—微生物軸影響大腦的活動(dòng)[1-3]。已有動(dòng)物研究表明，改變腸道菌群組成能誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生類似精神類疾病的癥狀和行為[4-5]，并且在動(dòng)物模型中已證實(shí)腸道菌群改變與孤獨(dú)癥存在關(guān)聯(lián)[6-7]。但是，有關(guān)人類精神分裂癥與腸道菌群相關(guān)性的研究仍少有報(bào)道[8-10]，且腸道菌群是個(gè)復(fù)雜且龐大的生態(tài)系統(tǒng)，不同地區(qū)、不同年齡階段人群其腸道菌群都存在一定差異。因此，本研究對(duì)精神分裂癥患者腸道菌群進(jìn)行16S rRNA基因高通量測(cè)序，探索其腸道菌群特征，及可能的病理機(jī)制，為精神分裂癥的臨床診斷和治療提供參考依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象選取2017年4月至2017年12月就診于廣州市惠愛醫(yī)院門診及住院的精神分裂癥患者作為患者組。入組標(biāo)準(zhǔn)：①符合《美國(guó)精神障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)第四版》（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders，F(xiàn)ourth Edition，DSM-Ⅳ）精神分裂癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②年齡18～45歲；③病程≥2年，目前使用的抗精神病藥物種類和劑量在8周內(nèi)穩(wěn)定；④血常規(guī)檢查無(wú)異常；⑤無(wú)精神活性物質(zhì)濫用或依賴（酒精、咖啡因、尼古丁除外）。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有糖尿病、甲狀腺疾病、高血壓、心臟病等可能影響腸道菌群穩(wěn)定性的疾??；②近3個(gè)月內(nèi)有腹瀉；③近3個(gè)月內(nèi)使用過(guò)抗生素類或益生菌類藥物；④妊娠、哺乳期或月經(jīng)期婦女；⑤合并其他符合DSM-Ⅳ診斷標(biāo)準(zhǔn)的精神疾病。共收集16例患者。

對(duì)照組來(lái)自同一時(shí)間段內(nèi)在廣州大學(xué)城公開招募的健康志愿者。入組標(biāo)準(zhǔn)：①不符合DSM-Ⅳ任何精神疾病的診斷；②無(wú)精神疾病史及家族史；③年齡18～45歲；④血常規(guī)檢查無(wú)異常；⑤無(wú)精神活性物質(zhì)濫用或依賴 （酒精、咖啡因、尼古丁除外）。排除標(biāo)準(zhǔn)同患者組。共收集20名對(duì)照者。

本次研究經(jīng)過(guò)廣州市惠愛醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有受試者簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA提取和16S rRNA測(cè)序 采集所有受試者的新鮮糞便樣本于50 mL無(wú)菌采便盒內(nèi)，-80℃保存。根據(jù)TIANamp Stool DNA Kit（天根生化科技有限公司）說(shuō)明書提取總DNA，用NanoDrop 2000c（Thermo Scientific）測(cè)定DNA的濃度和純度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的完整性。以細(xì)菌16S rRNA基因的V3可變區(qū)為目標(biāo)片段，擴(kuò)增DNA構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)，使用Ion PGMTM測(cè)序儀（博奧木華基因科技有限公司）進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 生物信息學(xué)分析 采用 Qiime（Quantitative Insights into Microbial Ecology）1.8.0 軟件 （http：//qiime.org/）對(duì)原始序列進(jìn)行優(yōu)化處理，得到高質(zhì)量序列[11]。以UCLUST算法為基礎(chǔ)，將高質(zhì)量序列以97%核苷酸序列相似性聚類成可操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs）， 應(yīng)用 Green-Gene數(shù)據(jù)庫(kù)（version 13.8）對(duì)OTUs進(jìn)行物種信息注釋。基于OTUs的注釋信息，計(jì)算α多樣性（Chao1指數(shù)、Ace指數(shù)、Shannon指數(shù)和 Simpson指數(shù)）。根據(jù)細(xì)菌的門和屬兩個(gè)水平上序列數(shù)的統(tǒng)計(jì)信息，將各物種豐度歸一化到同一數(shù)量級(jí)，用log2（患者組/對(duì)照組）計(jì)算樣品之間物種豐度的倍數(shù)差異，進(jìn)而分析不同菌群相對(duì)豐度的組間差異[12]。采用線性判別效應(yīng)分析（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）描述兩組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的菌群標(biāo)志物，并用線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）估計(jì)每個(gè)差異菌群的效應(yīng)大小，本研究LDA判別界值取1.5。為深入了解腸道菌群在兩組中發(fā)揮的生物學(xué)作用，利用PICRUSt軟件，結(jié)合GreenGene數(shù)據(jù)庫(kù)和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)16S rRNA數(shù)據(jù)進(jìn)行功能譜預(yù)測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS 23.0。兩組被試年齡、腸道菌群α多樣性指數(shù)等正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）描述，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。性別等組間比較采用Fisher精確檢驗(yàn)。門、屬水平上的腸道菌群相對(duì)豐度呈偏態(tài)分布，采用中位數(shù)（下四分位數(shù)，上四分位數(shù)）[M（QL，QU）]描述，過(guò)濾掉在少于 20%被試中存在的OTUs后，采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 人口學(xué)資料患者組年齡（33.63±8.04）歲，男性 7例，女性 9例；對(duì)照組年齡（27.60±7.07）歲，男性16名，女性 4名。兩組年齡（t=-2.391，P=0.022）、性別（P=0.038）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?；颊呓M的病程為（5.19±3.76）年，發(fā)病年齡為（28.44±7.44）歲，使用抗精神病藥物為奧氮平、利培酮、舒必利中兩種或三種。

2.2 菌群多樣性分析對(duì)36例糞便樣本DNA進(jìn)行測(cè)序，共獲得12436779條高質(zhì)量序列，其中患者組6556239條。通過(guò)序列相似性聚類，得到5475個(gè) OTUs，其中患者組4513個(gè)，對(duì)照組 4545個(gè)，3583個(gè)為兩組共有。α多樣性分析表明，兩組的 Chao1 指數(shù)（t=-1.056，P=0.298）、Ace 指數(shù)（t=-1.254，P=0.218）、Shannon 指數(shù)（t=0.070，P=0.945）和 Simpson 指數(shù)（t=0.155，P=0.878）均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表 1）。

2.3 菌群結(jié)構(gòu)分析在門水平上，對(duì)照組的優(yōu)勢(shì)菌群主要屬于厚壁菌門 （Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes），占總細(xì)菌的93.73%，梭桿菌門（Fusobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）合占1.99%，其它細(xì)菌占剩下的4.28%。與對(duì)照組相比，患者組的優(yōu)勢(shì)菌群未改變，厚壁菌門和擬桿菌門占總細(xì)菌的90.60%，厚壁菌門與擬桿菌門的相對(duì)豐度比值、梭桿菌門與變形菌門相對(duì)豐度比值較對(duì)照組略變大，放線菌門的相對(duì)豐度有所增加，但變化均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。低豐度的TM7門菌群在患者組中的相對(duì)豐度較對(duì)照組增加，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-2.042，P=0.041）（表 2）。

表1 精神分裂癥患者與對(duì)照腸道菌群α多樣性分析

表2 精神分裂癥患者與對(duì)照門水平上的腸道菌群相對(duì)豐度及其比值

在屬水平上，對(duì)照組糞便中占主導(dǎo)地位菌屬有擬桿菌屬（Bacteroides，21.02%）、普雷沃氏菌屬（Prevotella，10.43%）、糞桿菌屬（Faecalibacterium，6.58%）和巨單胞菌屬（Megamonas，1.36%），而患者組以擬桿菌屬（34.39%）、糞桿菌屬（4.35%）、梭桿菌屬 （Fusobacterium，1.09%）、 巨單胞菌屬（0.23%）為優(yōu)勢(shì)菌屬（圖1，表3）。與對(duì)照組相比，患者組有8個(gè)菌屬的相對(duì)豐度均升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其中5個(gè)屬于放線菌門，分別為放線菌屬（Actinomyces）（Z=-2.010，P=0.044）、羅氏菌屬 （Rothia）（Z=-2.702，P=0.007）、 斯卡多維亞氏菌屬（Scardovia）（Z=-2.701，P=0.007）、奇異菌屬（Atopobium）（Z=-2.076，P=0.038）和伊格爾茲氏菌屬 （Eggerthella）（Z=-2.019，P=0.043）；3 個(gè)屬于厚壁菌門，分別為乳桿菌屬（Lactobacillus）（Z=-2.570，P=0.010）、Moryella（Z=-3.014，P=0.003）和G07菌屬（Z=-1.983，P=0.047）（表 3）。進(jìn)一步LEfSe分析發(fā)現(xiàn)，以上8個(gè)組間差異菌屬中，除羅氏菌屬和伊格爾茲氏菌屬之外，其余6個(gè)在兩組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）（圖 2A）。

此外，在科水平上，患者組中消化鏈球菌科（Peptostreptococcaceae）、乳桿菌科（Lactobacillaceae）、放線菌科（Actinomycetaceae）3個(gè)科的相對(duì)菌群豐度高于對(duì)照組 （P＜0.05），而組織菌科（Tissierellaceae）的相對(duì)豐度低于對(duì)照組（P＜0.05）（圖 2B）。

圖1 對(duì)照組和患者組在屬水平上腸道主要菌群組成分布圖

圖2 對(duì)照組和患者組腸道菌群組成的LEfSe分析。A為僅對(duì)LDA≥1.5的分類群進(jìn)行可視化；B為兩組間差異最大的菌群

2.4 菌群功能分析功能分析結(jié)果顯示患者組和對(duì)照組有多種生物學(xué)途徑存在差異 （P＜0.05），包括β-丙氨酸、核黃素、磷酸鹽、脂肪酸和丙酮酸等代謝途徑，苯甲酸、二甲苯、二噁英、萘、氯烷烴和氯烯烴等降解途徑，四環(huán)素和脂肪酸生物合成途徑，糖酵解/糖異生、戊糖磷酸途徑等（圖3）。

圖3 對(duì)照組和患者組腸道菌群功能預(yù)測(cè)分析。圖中為相對(duì)豐度在兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的生物學(xué)途徑（P＜0.05），右側(cè)P值為校正后的值

3 討論

健康人腸道菌群主要由厚壁菌門（60%～80%）、擬桿菌門（20%～30%）、放線菌門（＜10%）和變形菌門（＜1%）組成[13-18]。本研究也發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組中相對(duì)豐度較高的門類為厚壁菌門（46%）和擬桿菌門（47%），只是兩者的占比稍有變化，可能是本研究樣本量較小，不足以顯示其分布狀況，也可能與受試者的飲食習(xí)慣和地理環(huán)境等因素有關(guān)。本研究中，與對(duì)照組相比，患者的腸道菌群發(fā)生改變：在門水平，TM7門菌群相對(duì)豐度偏高；在科水平，消化鏈球菌科、乳桿菌科和放線菌科的菌群相對(duì)豐度偏高，而組織菌科的相對(duì)豐度偏低；在屬水平，6個(gè)菌屬的相對(duì)豐度均偏高，其中3個(gè)屬于放線菌門（放線菌屬、奇異菌屬和斯卡多維亞氏菌屬），3個(gè)屬于厚壁菌門 （乳桿菌屬、Moryella和G07菌屬）。SCHWARZ等[19]研究發(fā)現(xiàn)首發(fā)精神病患者糞便中乳桿菌屬的相對(duì)豐度比健康對(duì)照組高，且乳桿菌屬豐度與癥狀的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)；此外，SHEN等[9]發(fā)現(xiàn)在精神分裂癥緩解期患者腸道中乳桿菌屬的相對(duì)豐度也高于健康對(duì)照組。本研究與這些文獻(xiàn)結(jié)果一致，同時(shí)也提示乳桿菌屬相對(duì)豐度升高與精神分裂癥的發(fā)生發(fā)展有一定相關(guān)性[20]。總的來(lái)說(shuō)，本研究發(fā)現(xiàn)精神分裂癥患者腸道菌群較健康對(duì)照者發(fā)生改變，這些變化的菌群可能在精神分裂癥發(fā)病中發(fā)揮重要生物學(xué)作用，有望為精神分裂癥的臨床診斷和治療提供一定參考。

表3 精神分裂癥患者與對(duì)照屬水平上的腸道菌群相對(duì)豐度

大腦的認(rèn)知功能與其能量供應(yīng)能力協(xié)同進(jìn)化，精神分裂癥患者存在認(rèn)知功能障礙，其大腦中能量代謝存在異常[21-22]。對(duì)精神分裂癥患者尸檢的研究將大腦前額葉皮質(zhì)組織樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)和代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，脂肪酸β-氧化酶的轉(zhuǎn)錄水平顯著增加[23]，而血清和尿液分析推測(cè)脂肪酸代謝途徑在患者中占主要地位[24]。本研究發(fā)現(xiàn)精神分裂癥患者體內(nèi)脂肪酸代謝和丙酮酸代謝途徑與健康對(duì)照存在差異。丙酮酸合成、乙酰CoA合成和脂肪酸生物合成是合成短鏈脂肪酸（short chain fat acid，SCFAs）的三種基本反應(yīng)。HE 等[10]通過(guò)分析受試者腸道微生物群的組成和腦內(nèi)細(xì)胞膜破壞的標(biāo)志物（即膽堿），得到精神分裂癥高風(fēng)險(xiǎn)和超高風(fēng)險(xiǎn)受試者腦—腸—微生物軸的特征，其中，超高風(fēng)險(xiǎn)受試者腸道中乳桿菌屬相對(duì)豐度增加可以刺激腫瘤壞死因子 （tumor necrosis factor，TNF）的產(chǎn)生，本研究中也發(fā)現(xiàn)患者組乳桿菌屬水平增加。另外，SCFAs可與體內(nèi)TNF穿過(guò)血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，激活小膠質(zhì)細(xì)胞，干擾神經(jīng)細(xì)胞的膜代謝，進(jìn)而誘發(fā)精神分裂癥[7，25]。據(jù)此，推測(cè)腸道微生物變化可能引起機(jī)體能量代謝異常，菌群代謝物異常，誘導(dǎo)炎癥因子水平改變，進(jìn)而引起精神分裂癥發(fā)生?；诖?，未來(lái)可以擴(kuò)大樣本量進(jìn)行縱向深入的研究，建立腸道微生物與血清代謝物相結(jié)合的預(yù)測(cè)模型，用于精神分裂癥的臨床輔助診斷和治療。

本研究分析精神分裂癥患者和健康對(duì)照者腸道菌群的差異，為精神分裂癥的臨床診斷和治療提供一定參考。但也存在以下局限：樣本量較小，未考慮飲食習(xí)慣、生活方式等對(duì)腸道菌群的影響等，此外，本研究中的患者在入組時(shí)已經(jīng)服用抗精神病藥物，無(wú)法分析患者用藥前后腸道菌群變化情況，不能明確抗精神病藥物對(duì)腸道菌群有何影響。后續(xù)需要擴(kuò)大樣本量，納入患者詳細(xì)的臨床信息，盡可能控制干擾因素進(jìn)行縱向深入研究；針對(duì)首發(fā)未用藥患者進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪，研究用藥前后患者腸道菌群變化情況；對(duì)關(guān)鍵菌株進(jìn)行分離和鑒定，并通過(guò)疾病動(dòng)物模型等研究其在精神分裂癥中的潛在作用機(jī)制。