范越，張文娓，田明*，隋思逸，康天濟(jì)，唐慧蓮，田冰，王旭，閆麗莉

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

黃芪桂枝五物湯出自于張仲景的《金匱要略》，由桂枝、黃芪、大棗、生姜和芍藥5味中藥材共同組成，具有調(diào)和營(yíng)衛(wèi)，溫經(jīng)通痹的功效，治療血痹氣痹，至今在中醫(yī)臨床中仍被廣泛的應(yīng)用，其辨證要點(diǎn)是肌膚麻木不仁、或疼痛，在臨床中糖尿病周圍神經(jīng)病變符合血痹證辨證要點(diǎn)。本課題的前期研究也證明了其療效作用[1-2]。為了更好的控制黃芪桂枝五物湯顆粒質(zhì)量，建立其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，采用薄層色譜法對(duì)黃芪、白芍進(jìn)行定性鑒別；采用高效液相色譜法測(cè)定制劑中主藥黃芪的指標(biāo)性成分——毛蕊異黃酮苷。具體研究結(jié)果如下。

1 試驗(yàn)材料

1.1 儀器

紫外分析儀(上海顧村電光儀器廠，ZF-I型)；高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司，Waters1515型)；紫外檢測(cè)器(美國(guó)Waters公司，Waters 2487型)；可見紫外光譜掃描儀(日本島津，UV-1601PC)；超聲波清洗機(jī)(陜西鵬展科技，MP5200H)；電子分析天平(梅特勒—托利多儀器上海有限公司，AB204-N)；硅膠G薄層板(自制)；玻璃點(diǎn)樣毛細(xì)管(華西醫(yī)科大學(xué)儀器廠)。

1.2 試藥

白芍對(duì)照藥材(批號(hào)：120905-201008)、芍藥苷對(duì)照品(批號(hào)：110736-201136)、黃芪甲苷對(duì)照品(批號(hào)：110781-201113)、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品均來源于中國(guó)藥品生物制品檢定所；甲醇(色譜純)；甲醇、乙醚、乙酸乙酯、甲酸、三氯甲烷、正丁醇等試劑均為分析純；黃芪桂枝五物湯顆粒劑(自制)。

2 薄層色譜鑒別

2.1 黃芪TLC鑒別

2.1.1 黃芪的供試品溶液制備

取本品顆粒劑10 g，研細(xì)，加入蒸餾水40 mL使其溶解，用乙醚振搖提取2次，每次40 mL，棄去乙醚液，水溶液用水飽和的正丁醇提取2次，每次40 mL，合并正丁醇液，0.5%的氫氧化鈉溶液洗滌2次，每次40 mL，正丁醇液用水洗至中性，置水浴上蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備

取黃芪甲苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每毫升含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.1.3 陰性供試品溶液的制備

取按制備工藝處方1/10量制成不含黃芪的陰性樣品，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制成陰性供試品溶液。

2.1.4 薄層色譜方法

參照薄層色譜法[3](《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇-水(13∶7∶2)的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。日光燈下檢視，斑點(diǎn)為棕褐色。

2.2 白芍的TLC鑒別

2.2.1 供試品溶液的制備

取本品5 g，研細(xì)，加甲醇15 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?5 mL使溶解，加水飽和正丁醇提取3次，每次15 mL，合并正丁醇提取液，再用正丁醇飽和的水洗滌3次，每次15 mL，取正丁醇液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備

取芍藥苷照品適量，加甲醇制成每毫升含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2.3 對(duì)照藥材溶液的制備

取白芍對(duì)照藥材1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。

2.2.4 陰性供試品溶液的制備

取按制備工藝處方1/10制成不含白芍的陰性樣品，按照“2.2.1”項(xiàng)下方法制成陰性供試品溶液。

2.2.5 薄層色譜方法

照薄層色譜法《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅥB試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液10 μL、對(duì)照品溶液各1 μL、對(duì)照藥材6 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(8∶1∶2∶0.04)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。

2.3 結(jié)果分析

在日光燈下，供試品有Rf值為0.31的藍(lán)色斑點(diǎn)、Rf值為0.67的深黃色斑點(diǎn)；對(duì)照藥材只有一個(gè)Rf值為0.31的藍(lán)色斑點(diǎn)；對(duì)照品也有一個(gè)Rf值為0.31的藍(lán)色斑點(diǎn)；陰性對(duì)照有Rf值為0.67的深黃色斑點(diǎn)。供試品在Rf值為0.31處的斑點(diǎn)與對(duì)照藥材和對(duì)照品斑點(diǎn)相互對(duì)應(yīng)。陰性樣品在芍藥苷對(duì)照品相應(yīng)的位置上沒有斑點(diǎn)。經(jīng)多批樣品試驗(yàn)，本法靈敏度高，專屬性好。

3 毛蕊異黃酮苷含量測(cè)定方法的建立

3.1 最佳吸收波長(zhǎng)的測(cè)定

用甲醇配制一定濃度的毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品溶液，再用甲醇作為空白對(duì)照，在紫外分光光度計(jì)上于200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，掃描結(jié)果見圖1。根據(jù)掃描結(jié)果可知，毛蕊異黃酮葡萄糖苷在260 nm處有最大吸收，參考2010年版《中國(guó)藥典》及相關(guān)文獻(xiàn)中毛蕊異黃酮苷的測(cè)定方法，確定260 nm為最佳吸收波長(zhǎng)。

圖1 毛蕊異黃酮苷光譜圖

3.2 色譜條件

色譜柱十八烷基硅烷鍵合硅膠柱；流動(dòng)相：乙腈-0.2%甲酸(15∶85)；檢測(cè)波長(zhǎng):260 nm；流速1.0 mL/min；柱溫：室溫;進(jìn)樣量:10 μL。

3.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品適量，加甲醇使溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，定容，搖勻，制成對(duì)照品溶液(216 μg/mL)。

3.4 供試品溶液的制備

取顆粒劑適量，研細(xì)，精密稱定3.056 3g，加水20 mL溶解，用正丁醇萃取3次，每次20 mL，合并正丁醇提取液，蒸干，殘?jiān)眉状既芙猓⒍ㄈ葜? mL容量瓶中，微孔濾膜(0.45 μm)過濾，作為供試品溶液。

3.5 陰性對(duì)照溶液制備

按制備工藝處方1/10取除黃芪外其余所有藥材，按照制備工藝制備，制成黃芪陰性樣品；按照“3.4”供試品溶液處理方法，制成陰性對(duì)照品溶液。

3.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及線性范圍的確定

精密吸取3.3項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mL分別置于5 mL容量瓶中，分別加入甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密吸取上述溶液各10μL注入液相色譜儀，記錄峰面積，標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)見表1。以峰面積A為縱坐標(biāo)，含量C為橫坐標(biāo)作線性回歸，得回歸方程A=28 878C+53 179，R=0.999 2,線性范圍0.216～1.512 μg,在此范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，結(jié)果見圖2。

表1 毛蕊異黃酮葡萄糖苷線性回歸數(shù)據(jù)

圖2 毛蕊異黃酮葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.7 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取“3.4”項(xiàng)下供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，按含量測(cè)定項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果，毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積RSD為1.54%，表明本方法精密度良好，見表2。

3.8 重復(fù)性考察

分別精密稱取同一批號(hào)下的黃芪桂枝五物湯顆粒劑(批號(hào)：20130401)6份，按“3.4”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備成供試品溶液，吸取供試品溶液和108 μg/mL的對(duì)照品溶液10 μL，注入液相色譜儀中，測(cè)定峰面積，計(jì)算毛蕊異黃酮苷含量。結(jié)果RSD值小于5%，符合要求，重現(xiàn)性較好，表明本方法重復(fù)性良好。見表3。

表2 毛蕊異黃酮葡萄糖苷精密度試驗(yàn)結(jié)果

表3 毛蕊異黃酮葡萄糖苷重復(fù)性考察結(jié)果

3.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取“3.4”項(xiàng)下的供試品溶液，在12 h內(nèi)，每小時(shí)進(jìn)樣1次，每次10 μL，結(jié)果毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積在0～10 h內(nèi)的RSD=1.761 0%;在11 h時(shí)測(cè)得峰面積2 485 296,在0～11 h的RSD=4.127 9%>3%。結(jié)果表明在10 h內(nèi)樣品溶液穩(wěn)定性良好。結(jié)果見表4。

表4 毛蕊異黃酮葡萄糖苷穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明11 h內(nèi)，樣品溶液中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量較穩(wěn)定，而樣品從提取至測(cè)定一般在1 h內(nèi)即可全部完成，建立的檢測(cè)方法可行。

3.10 加樣回收率試驗(yàn)

分別精密稱取同一批次黃芪桂枝五物湯顆粒劑(批號(hào)：20130401)6份，精密加入2.43 mg/mL的毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品溶液1 mL，按照“3.4”項(xiàng)下供試品溶液處理方法處理，并進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表5。

回收率=(測(cè)得量-制劑含量)/添加對(duì)照品量×100%

表5 毛蕊異黃酮葡萄糖苷加樣回收率結(jié)果

結(jié)果,回收率在95%～105%之間，表明所建立的方法測(cè)定毛蕊異黃酮葡萄糖苷準(zhǔn)確、可行。

3.11 樣品測(cè)定

取6批黃芪桂枝五物湯顆粒，分別精密稱取3 g，按照“3.4”項(xiàng)下供試品溶液處理方法處理，精密量取10 μL供試品，并采用高效液相色譜法(《中國(guó)藥典》2010版一部附錄VID)注入液相色譜儀測(cè)定，結(jié)果見表6。

表6 黃芪桂枝五物湯顆粒中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量

根據(jù)上述6批樣品的含量測(cè)定，平均每克顆粒劑含毛蕊異黃酮苷1.615 0 mg，由于藥材隨產(chǎn)地、批次不同，其含量略有差異。根據(jù)中藥新藥的研究要求，暫定黃芪桂枝五物湯顆粒劑每克含毛蕊異黃酮葡萄糖苷總計(jì)不少于1.20 mg。即每袋中的毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量不得少于12.0 mg。

4 討論

本研究對(duì)黃芪桂枝五物湯顆粒中的黃芪和白芍進(jìn)行了薄層色譜鑒別,其結(jié)果斑點(diǎn)集中,層次清晰,重復(fù)性好,陰性無(wú)干擾,具有可操作性,因此可以作為黃芪桂枝五物湯顆粒的定性鑒別方法。采用高效液相色譜法建立了黃芪中毛蕊異黃酮苷含量測(cè)定方法，建立制劑中的最低限度，有效的控制了制劑的質(zhì)量,并為藥理、藥效學(xué)基礎(chǔ)研究、臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。