牛曉靜，魯靜，曹英杰，段曉穎，徐立然

(河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450008)

大孔吸附樹脂是一類不溶于酸和堿的有機(jī)高分子聚合物,具有較大的比表面積和特殊的吸附性能，在污水處理、環(huán)境污染等去除有毒有害物質(zhì)方面被廣泛運(yùn)用。近年來，大孔吸附樹脂在天然產(chǎn)物純化工藝中也被廣泛運(yùn)用，是提取分離天然植物中有效成分的一種高效手段[1-2]。

課題組徐立然教授根據(jù)多年治療獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)的臨床經(jīng)驗(yàn)，總結(jié)擬定了益元康方并在臨床長期應(yīng)用[3-6]。該方由靈芝、西洋參、淫羊藿組成，具有健脾益脾功能，用于治療AIDS免疫功能低下，癥見乏力、倦怠、神疲、肢冷、易感冒、腹瀉、舌苔淡白、脈弱，在臨床應(yīng)用多年療效顯著。為獲取淫羊藿中有效組分之一——總黃酮，本試驗(yàn)通過比較淫羊藿總黃酮在11種不同型號大孔吸附樹脂上的吸附與解吸性能篩選最佳樹脂，應(yīng)用正交試驗(yàn)和均勻試驗(yàn)的方法對所選最佳樹脂純化淫羊藿總黃酮的動(dòng)態(tài)吸附和解析工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，為淫羊藿總黃酮的分離純化提供穩(wěn)定可行的工藝參數(shù)。

1 材料

TU-1800PC型紫外分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；CP225D型電子天平(德國賽多利斯集團(tuán))；BSA224S-CW型電子天平(德國賽多利斯集團(tuán))。

淫羊藿藥材(批號：140301，產(chǎn)地：甘肅隴南)，經(jīng)我院陳天朝主任藥師鑒定均符合《中國藥典》2015年版一部相關(guān)項(xiàng)下規(guī)定；淫羊藿苷對照品(批號：110737-200415，中國藥品生物制品檢定院提供)；甲醇、乙醇等試劑均為分析純；大孔吸附樹脂D-101、AB-8、DM130、DM301、HPD-600、HPD-100、HPD-400、HPD-300、HPD-826、X-5、NKA-9(河北滄州寶恩化工有限公司提供)。

2 方法與結(jié)果

2.1 樹脂預(yù)處理

稱取各樹脂用95%乙醇浸泡過夜，以乙醇濕法裝柱，用80%乙醇洗脫，控制流速為1.5 mL/min，收集乙醇洗脫液至加等量的純化水不顯渾濁為止，再繼續(xù)收集乙醇洗脫液，以95%乙醇為空白對照，采用分光光度法，在波長200～760 nm范圍內(nèi)掃描，直至洗脫液在紫外-可見光區(qū)無吸收即可，然后用大量的純化水洗至無醇味。

2.2 上樣液的制備

取淫羊藿100 g，置圓底燒瓶中，加15倍量60%乙醇，提取2次，每次165 min，合并濾液，減壓濃縮回收，得其濃縮液。精密稱取上述濃縮液適量置燒杯中, 加適量的蒸餾水，充分?jǐn)嚢枞芙夂?，過濾，測定含量，備用。

2.3 樹脂型號篩選

采用單因素試驗(yàn)，通過對靜態(tài)吸附與解吸試驗(yàn)，優(yōu)選樹脂型號：大孔吸附樹脂D-101、AB-8、DM130、DM301、HPD-600、HPD-100、HPD-400、HPD-300、HPD-826、X-5、NKA-9，共計(jì)11種。

2.3.1 不同樹脂對淫羊藿總黃酮的吸附-解吸附性能

精密稱取已處理好的樹脂抽濾至干，分別稱取5.0 g，置100 mL具塞三角瓶中，加樣品液20 mL(0.5 g生藥量/mL)，每隔5 min振搖10 s，振蕩吸附，持續(xù) 2 h，然后靜置24 h，使其達(dá)到飽和吸附，取樣，依法測定吸附后溶液的淫羊藿總黃酮的含量[7]。按下式計(jì)算吸附容量。

吸附率(%)=(上柱前總黃酮質(zhì)量-吸附平衡后剩余總黃酮質(zhì)量)/上柱前總黃酮質(zhì)量×100%

上述吸附飽和的樹脂用適量的水沖去樹脂表面的溶液和雜質(zhì)，濾干，置于100 mL具塞錐形瓶中，精密加入25 mL 60%乙醇解吸附，于振蕩器上室溫振蕩24 h 使充分解吸附之后，移取上清液，依法測定吸光度并計(jì)算解吸附后溶液的淫羊藿總黃酮的含量。按下式計(jì)算解吸率。

解吸率(%)=解吸總黃酮質(zhì)量/吸附總黃酮質(zhì)量×100%

結(jié)果見圖1，綜合吸附率和解吸率可知D-101、AB-8、HPD-600、HPD-300、HPD-400 5種樹脂吸附和解吸附效果較好。因此，進(jìn)一步對上述5種樹脂進(jìn)行動(dòng)態(tài)解吸附動(dòng)力學(xué)考察，優(yōu)選出最佳樹脂。

2.3.2 不同樹脂對淫羊藿總黃酮的解吸附動(dòng)力學(xué)

將靜態(tài)吸附飽和的樹脂過濾抽干,并用適量蒸餾水淋洗至流出液無色，加25 mL 60%的乙醇解吸附，分別在15、45、60、90、120、180、240、300、360 min取樣1次，取樣后用相應(yīng)溶劑補(bǔ)充相等體積，測定各樹脂解吸液中淫羊藿總黃酮的含量。并計(jì)算解吸率，繪制解吸動(dòng)力學(xué)曲線。見圖2，HPD-400解吸速率快，解吸率在120 min內(nèi)基本達(dá)到平衡。

圖1 11種不同型號大孔吸附樹脂對淫羊藿總黃酮的靜態(tài)吸附和解吸

圖2 5種不同大孔吸附樹脂對淫羊藿總黃酮的解吸動(dòng)力學(xué)曲線

2.4 動(dòng)態(tài)吸附正交試驗(yàn)

上樣液的制備：取淫羊藿提取濃縮液適量，加水稀釋成不同濃度，根據(jù)動(dòng)態(tài)吸附比吸附量設(shè)定上樣量(約為6 000 mg)，即1、2、3號試驗(yàn)上樣體積為300 mL，4、5、6號試驗(yàn)上樣體積為200 mL，7、8、9號試驗(yàn)上樣體積為150 mL，分別收集流出液，測定流出液中總黃酮的含量，計(jì)算吸附率%。

因素：上樣液濃度(A)、徑高比(B)、上樣液pH值(C)，采用三因素9水平試驗(yàn)，上樣流速根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定為1.0 mL/min。L9(34)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及安排見表1、2，通過測定總黃酮的含量，計(jì)算吸附率，優(yōu)選最佳吸附工藝。

表1 正交設(shè)計(jì)因素水平表

表2 正交試驗(yàn)安排表及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 正交試驗(yàn)方差分析表

注：F0.05(2,2)=19.00。

通過對表3進(jìn)行直觀分析，三個(gè)因素均有顯著性差異，最佳工藝為：A2B2C1，即：上樣液濃度30 mg/mL，上樣液pH值為4，徑高比1:8。按照上述優(yōu)選出的工藝參數(shù)平行3份進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果吸附率分別為99.36%、99.41%、99.39%，RSD值為0.03%，表明該吸附工藝穩(wěn)定性良好。

2.5 泄露曲線

取已處理好的HPD-400大孔吸附樹脂濕法裝柱，使徑高比為1∶8，取濃度為30 mg/mL，pH值為4的上樣液上樣，控制上樣流速為 1.0 mL/min，分段收集洗脫柱液，每20 mL收集一份，共收集15份，測定接收液中總黃酮濃度，以上樣體積為橫坐標(biāo)，泄露率為縱坐標(biāo)繪制泄露曲線，結(jié)果見圖3。

圖3 HPD-400大孔吸附樹脂上樣吸附泄露曲線

從第7份接收液開始已經(jīng)有總黃酮泄露，但此時(shí)泄露率僅為0.58%，相對于上樣量仍然很小，至第10份接收液泄露液濃度急劇增大，因此選擇泄露液濃度急劇增大前上樣，即4 BV。

2.6 均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化總黃酮?jiǎng)討B(tài)洗脫工藝

按上述確定的吸附條件，取上樣液分別通過HPD-400樹脂柱進(jìn)行吸附，吸附完成后先用3 BV水洗脫除去未吸附的總黃酮及其他雜質(zhì)，然后按照均勻設(shè)計(jì)安排表，以解吸率為考察指標(biāo)，分別考察洗脫液乙醇濃度(mg/mL)、洗脫液用量(BV)、洗脫流速(mL/min)三個(gè)因素對總黃酮純化的影響，具體見表4和表5。

表4 淫羊藿總黃酮?jiǎng)討B(tài)洗脫均勻設(shè)計(jì)因素水平表

表5 淫羊藿總黃酮?jiǎng)討B(tài)洗脫均勻設(shè)計(jì)安排表及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

利用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行回歸分析，選出最優(yōu)方程：Y=14.667+0.003X1X1+0.325X1X2-2.213X2X3，顯著水平P=0.003<0.05，相關(guān)系數(shù)R=0.962，調(diào)整后相關(guān)系數(shù)R=0.925，表明方程擬合度良好，回歸方程有意義，在置信水平1-0.05=0.95下是可信的。對該方程規(guī)劃求解，優(yōu)選的最佳工藝為：洗脫液乙醇濃度62%，洗脫流速1.0 mL/min，洗脫液用量4 BV。

2.7 總黃酮最佳純化工藝驗(yàn)證

按照上述篩選的工藝進(jìn)行上樣吸附和解吸，收集流出液，測定總黃酮含量。結(jié)果顯示：3批總黃酮含量分別為：70.80%、71.95%、72.78%，RSD為1.38%，平均含量為71.84%，達(dá)到50%以上。表明該總黃酮純化工藝質(zhì)量穩(wěn)定、可行。

3 討論

由于淫羊藿提取物主要含黃酮類成分，根據(jù)黃酮類化合物的理化性質(zhì)可知，其提取物易溶于甲醇、稀乙醇、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑，在熱水中溶解；筆者在制備上樣液試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，淫羊藿提取物的水溶性并不是很好，因此造成上柱液配制濃度不容易控制，而且配制后的溶液容易析出沉淀，在上柱時(shí)容易堵塞。黃酮類化合物因分子中多有酚羥基而呈酸性，故需要通過調(diào)節(jié)溶液的酸堿性使其溶解。

根據(jù)樹脂的吸附性能和被吸附物質(zhì)的性質(zhì)，本試驗(yàn)選用了11種大孔吸附樹脂D-101、AB-8、DM130、DM301、HPD-600、HPD-100、HPD-400、HPD-300、HPD-826、X-5、NKA-9篩選最佳樹脂。通過吸附-解吸附性能、解吸附靜態(tài)動(dòng)力學(xué)研究，結(jié)果HPD-400為最佳。而對大孔吸附樹脂與靶標(biāo)分子的構(gòu)效關(guān)系及其分離規(guī)律的基礎(chǔ)研究有待進(jìn)一步研究。

關(guān)于大孔吸附樹脂純化工藝參數(shù)研究[8-13]，大都采用單因素實(shí)驗(yàn)逐個(gè)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)選，造成實(shí)驗(yàn)時(shí)間過長、步驟繁瑣、只考慮單因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。本文通過正交實(shí)驗(yàn)、均勻設(shè)計(jì)對淫羊藿總黃酮?jiǎng)討B(tài)吸附參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，可以用較少的試驗(yàn)次數(shù)揭示各試驗(yàn)因素對指標(biāo)的影響的大小和規(guī)律，得到更多的信息，顯示出更大的優(yōu)越性，節(jié)約大量的時(shí)間和經(jīng)費(fèi)，也便于實(shí)施。確定的最佳純化工藝參數(shù)為：上樣液濃度30 mg/mL，上樣液pH值為4，徑高比1：8，上樣流速1.0 mL/min，最大上樣量4 BV；解吸先用3 BV水除雜，洗脫液乙醇濃度62%，洗脫流速1.0 mL/min，洗脫液用量4 BV。純化后的總黃酮平均含量為71.84%，比純化前總黃酮含量高3倍，RSD為1.38%，工藝穩(wěn)定可靠。