徐 思，李 野

（四川師范大學(xué) 體育學(xué)院，四川 成都610100）

0 引言

運(yùn)動誘導(dǎo)的線粒體生成是運(yùn)動性適應(yīng)的主要標(biāo)志（Little et al.,2011），也是運(yùn)動訓(xùn)練促使運(yùn)動能力增強(qiáng)的生理基礎(chǔ)（鄭莉芳 等,2018）。運(yùn)動應(yīng)激適應(yīng)性線粒體生成依賴組織細(xì)胞對運(yùn)動誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)的感知，并啟動下游調(diào)控線粒體生成因子的激活（Margaritelis et al.,2018），但其分子機(jī)制目前尚無定論。

長非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是真核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一類長度大于200 nt的RNA分子，一般不編碼蛋白質(zhì)，多數(shù)具有mRNA樣結(jié)構(gòu)（經(jīng)過剪切，具有PolyA尾巴，與啟動子有結(jié)合能力），是基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的不可或缺的組成部分（Hung et al.,2010），調(diào)控作用范圍涉及轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平及表觀遺傳水平（Salmena et al.,2011），以信號分子、誘餌分子、引導(dǎo)分子、骨架分子等方式在細(xì)胞增殖、分化、應(yīng)激適應(yīng)、自噬以及死亡過程中呈現(xiàn)多重調(diào)控機(jī)制（Mercer et al., 2009）。氧化應(yīng)激是調(diào)控應(yīng)激適應(yīng)發(fā)生的基本信號通路（Araki et al.,2016; Bisht et al.,2017; Kandola et al.,2015; Schieber et al.,2014），LncRNA在多個層次參與應(yīng)激適應(yīng)相關(guān)的氧化應(yīng)激信號通路調(diào)控（Chen et al.,2014; Fuschi et al., 2019; Tehrani et al.,2018），是調(diào)節(jié)應(yīng)激適應(yīng)性組織結(jié)構(gòu)與功能重塑的主要調(diào)控分子（史華俊 等,2012; Mercer et al.,2013; Valadkhan et al., 2016），而LncRNA在運(yùn)動應(yīng)激誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激應(yīng)答與涉及線粒體生成的正性適應(yīng)調(diào)控通路和機(jī)制上的相關(guān)分子及其作用仍然有待闡明。

GABPB1-AS1是核呼吸因子2β1亞基（GABPB1）（Hayashi et al.,2013）的反義RNA，全長4 139 nt，僅見于人類基因組。GABPB1-AS1是定位于細(xì)胞質(zhì)的短壽LncRNA，一般狀態(tài)下半衰期很短，因而在細(xì)胞質(zhì)中含量很低（Tani et al.,2013）。在多種因素導(dǎo)致的細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)下，GABPB1-AS1在細(xì)胞質(zhì)中積累，積累程度與氧化應(yīng)激刺激強(qiáng)度成正比（Tani et al.,2014），并且與細(xì)胞生存率呈正相關(guān)（Alkhateeb et al.,2019）。目前尚不清楚GABPB1-AS1這一表達(dá)特征的生理意義以及分子機(jī)制。

本研究檢測人源細(xì)胞氧化應(yīng)激模型中GABPB1-AS1在應(yīng)激因素消除后的表達(dá)特征及其對線粒體生成調(diào)控通路關(guān)鍵因子的調(diào)控作用，探討其在應(yīng)激適應(yīng)性線粒體生成過程中的調(diào)控信號通路和作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

雙氧水購買于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；DMEM（dulbecco minimum essential medium）培養(yǎng)基和0.25%胰蛋白酶（美國Hyclone公司）；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（美國Gibco公司）；Lipofectamine 2000（Thermo Scientific）；ribo FECTTM CP轉(zhuǎn)染試劑（廣州銳博生物科技有限公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo Scientific）；實(shí)時定量PCR（real time quantitative PCR，qRT-PCR）試劑（美國Kapa Biosystems公司）；miR-101 mimic和inhibitor以及對應(yīng)的negative control（廣州銳博生物科技有限公司）；RiboLock RNase Inhibitor（100 U/ml）、RNase A+T、RNA提取試劑盒、蛋白定量試劑盒、體外轉(zhuǎn)錄試劑（Thermo Scientific）；ACTIN抗體和辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記羊抗兔/小鼠二抗、GABPB1、PCG-1α抗體（ProteinTech）；膠回收試劑盒（美國Promega公司）；本研究使用的引物及寡聚核酸均由上海吉瑪生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成（表1）。

表1 本研究使用的引物和寡聚核酸序列 Table 1 Primers and Oligonucleic Acid Sequences

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù)方案

HUVEC細(xì)胞采用DMEM培養(yǎng)基（含10% FBS、100 U/ ml penicillin、100 μg/ml streptomycin），于CO2培養(yǎng)箱（37℃，5% CO2）中培養(yǎng)。使用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)或其他實(shí)驗(yàn)。

采用終濃度200 μM的H2O2處理HUVEC細(xì)胞3 h，構(gòu)建細(xì)胞氧化應(yīng)激模型。作用3 h后洗脫H2O2，更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分別于2 h、4 h、8 h、16 h、24 h收集細(xì)胞用于核酸及蛋白質(zhì)檢測等試驗(yàn)。以正常培養(yǎng)HUVEC細(xì)胞作為對照，記為0 h。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

GABPB1-AS1的小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）和對照組NC序列見表1。GABPB1-AS1過表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建方法：使用GABPB1-AS1序列引物對（表1）從HUVEC細(xì)胞cDNA中擴(kuò)增片段，使用NheI 與BamHI酶切質(zhì)粒后將片段插入pcDNA3.1載體中。

取生長狀態(tài)良好的HUVEC細(xì)胞均勻鋪于6孔板，將細(xì)胞密度控制在30%左右，12 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作，miR-101 mimic和inhibitor以及對應(yīng)的negative control使用ribo FECTTM CP轉(zhuǎn)染試劑按照說明書步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作，GABPB1-AS1 siRNA和過表達(dá)質(zhì)粒使用Lipofectamine 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.5 RNA抽提和qPCR-RCR檢測

轉(zhuǎn)染48～72 h后，收集各組細(xì)胞。按照試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，用分光光度計(jì)檢測OD260/D280得到RNA濃度，再按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作得到cDNA。qRT-PCR檢測按照說明書操作，反應(yīng)體系20 μl，反應(yīng)程序：94℃ 3 min，94℃ 10 s，60℃ 15 s，72℃ 20 s，40個循環(huán)。數(shù)據(jù)分析采用相對定量法（2-ΔΔCT）。GAPDH基因作為定量實(shí)驗(yàn)的內(nèi)參，引物序列見表1。

1.6 蛋白提取和western bloting實(shí)驗(yàn)

收集轉(zhuǎn)染的各組細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞2次，加入蛋白酶抑制劑（PIC，Roche）的細(xì)胞裂解液在冰上裂解20 min，渦旋5次，每次10 s。4℃、13 000 rpm/min 離心10 min，收集上清液，BCA法測定蛋白濃度。將得到的蛋白溶液和上樣緩沖液按5:1混合，煮沸10 min，得到細(xì)胞總蛋白樣品。采用10% SDS-PAGE分離膠電泳分離細(xì)胞總蛋白，濕轉(zhuǎn)法將蛋白從SDS-PAGE膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，電轉(zhuǎn)結(jié)束后，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，將硝酸纖維素膜分別置于抗體稀釋液中，4℃孵育過夜。使用PBST（PBS+0.2% Tween20）漂洗5次，每次5 min，再將洗脫后的膜置于HRP標(biāo)記的二抗稀釋液（稀釋比例1:10 000），室溫孵育1 h，再漂洗5次，每次5 min，顯影。以ACTIN作為內(nèi)參蛋白。

1.7 GABPB1-AS1/miR-101-RNA pull down實(shí)驗(yàn)

GABPB1-AS1（包含miR-101結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域）序列克隆至載體pcDNA3.1，PCR引物序列見表1，將構(gòu)建好的載體用BamH I酶切后，使用Roche體外轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄和生物素標(biāo)記。轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，加入DNase I消化轉(zhuǎn)錄模板，使用TRIzol抽提體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，定量后取3 ug RNA與HUVEC細(xì)胞提取液混合進(jìn)行RNA pull down實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)體系為25 mM Tris-Cl [pH 7.4]，150 mM NaCl，0.5% NP-40，0.5 mM DTT and 1×complete protease inhibitors（Roche），室溫孵育2～4 h后加入鏈霉素偶聯(lián)的T1 beads（Roche），孵育30 min后，洗脫5次，抽提RNA，逆轉(zhuǎn)錄后qRT-PCR檢測吸附的miR-101。

1.8 GABPB1-AS1/GABPB1 RNA pull down實(shí)驗(yàn)

分別將GABPB1第1外顯子正義方向序列（1～447 nt）和反義方向序列（1～447 nt）按1.7方法體外轉(zhuǎn)錄和生物素標(biāo)記，轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，加入DNase I消化轉(zhuǎn)錄模板，使用TRIzol抽提體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，定量后各取3 ug RNA分別與HUVEC細(xì)胞提取液混合進(jìn)行RNA pull down實(shí)驗(yàn)。用于檢測GABPB1-AS1對GABPB1的親和作用的HUVEC細(xì)胞提取液（反應(yīng)體系同前）加入100 U/ml的RNase-inhibitor，室溫孵育1 h后加入鏈霉素偶聯(lián)的T1 beads（Roche），孵育30 min后，洗脫5次，抽提RNA，逆轉(zhuǎn)錄后qRT-PCR檢測吸附的GABPB1序列。

1.9 RNase保護(hù)試驗(yàn)（RNase protection assay，RPA）

如前所述的HUVEC細(xì)胞分離的RNA置于37℃ 1 h，然后用RNase A+T 37℃處理30 min。RNase A+T能降解單鏈RNA，但不能降解雙鏈RNA。RNase A+T處理后，用TRIzol提取RNA，生成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR檢測。

1.10 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用SPSS17.0軟件處理，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)確定兩組間均值差異的顯著性，顯著性水平差異為P＜0.05。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 GABPB1-AS1在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)下高表達(dá)，上調(diào)PGC-1α蛋白水平

HUVEC細(xì)胞經(jīng)200 μM的H2O2作用3 h后細(xì)胞邊界略見皺縮，數(shù)量減少約10%，其他未見顯著異常（圖1A）。

qRT-PCR檢測H2O2作用后繼續(xù)培養(yǎng)2 h、4 h、8 h和16 h的HUVEC細(xì)胞的GABPB1-AS1的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，H2O2處理的GABPB1-AS1在2 h和4 h表達(dá)水平增高至3.468倍和3.640倍，均顯著高于正常培養(yǎng)的HUVEC細(xì)胞（P＜0.01），8 h和16 h表達(dá)水平略下降，分別為2.77倍和2.20倍，顯著高于正常培養(yǎng)的HUVEC細(xì)胞中GABPB1-AS1（P＜0.01，P＜0.05）。采用western bloting檢測對應(yīng)時段PGC-1α蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，與正常培養(yǎng)的HUVEC細(xì)胞中PGC-1α蛋白水平相比，2～16 h PGC-1α蛋白水平均顯著提高（圖1B）。

采用siRNA敲低HUVEC細(xì)胞的GABPB1-AS1，western bloting檢測其對PGC-1α蛋白水平的影響。結(jié)果表明，敲低GABPB1-AS1后PGC-1α蛋白水平下降（圖1C）。

構(gòu)建GABPB1-AS1過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HUVEC細(xì)胞，western bloting檢測其對PGC-1α蛋白水平的影響。結(jié)果表明，過表達(dá)GABPB1-AS1后PGC-1α蛋白水平升高（圖1D）。

圖1 H2O2氧化應(yīng)激誘導(dǎo)高表達(dá)的GABPB1-AS1調(diào)控PGC-1α蛋白水平上調(diào) Figure 1.The Overexpression of GABPB1-AS1 which was Induced by H2O2 Oxidative Stress Up-regulates the Protein Level of PGC-1α

2.2 1-AS1通過競爭性吸附miR-101，降低其對PGC-1α-mRNA翻譯的抑制作用

生物信息分析顯示，miR-101種子區(qū)與GABPB1-AS1在chr15:50655684-50655705位置存在強(qiáng)結(jié)合點(diǎn)，同時miR-101種子區(qū)在PGC-1α的3'UTR有結(jié)合位點(diǎn)（http:// www.targetscan.org/cgi-bin/targetscan/vert_72）（圖2A）。

采用RNA pull down實(shí)驗(yàn)，利用體外轉(zhuǎn)錄的GABPB1-AS1結(jié)合HUVEC細(xì)胞中內(nèi)源miR-101，qRT-PCR檢測與GABPB1-AS1結(jié)合的miR-101。結(jié)果顯示，與GABPB1-AS1結(jié)合的miR-101顯著高于對照組（P＜0.01，圖2B）。

分別采用miR-101的mimic和inhibitor轉(zhuǎn)染HUVEC細(xì)胞，western bloting檢測轉(zhuǎn)染mimic和inhibitor的 HUVEC細(xì)胞中PGC-1α蛋白水平。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染miR-101 mimic的HUVEC細(xì)胞中PGC-1α蛋白水平低于空白對照組；轉(zhuǎn)染inhibitor的HUVEC細(xì)胞中PGC-1α蛋白水平高于空白對照組（圖2C）。

以上結(jié)果提示，存在GABPB1-AS1/miR-101/PGC-1α調(diào)控軸，在氧化應(yīng)激刺激下，GABPB1-AS1半衰期延長，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含量升高，通過“海綿效應(yīng)”競爭性結(jié)合miR-101，解除miR-101結(jié)合于PGC-1α mRNA的3'UTR區(qū)域的翻譯抑制作用，促進(jìn)PGC-1α mRNA翻譯，提高PGC-1α蛋白水平（圖2D）。

圖2 GABPB1-AS1競爭結(jié)合miR-101上調(diào)PGC-1α蛋白質(zhì)翻譯 Figure 2.GABPB1-AS1 Competitively Binds to miR-101 to Up-regulate the Translation of PGC-1α

2.3 氧化應(yīng)激高表達(dá)的GABPB1-AS1對GABPB1 mRNA的穩(wěn)定性和蛋白水平的調(diào)控作用

采用200 μM的H2O2處理3 h后，去除H2O2，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，qRT-PCR檢測2 h、4 h、8 h、16 h、24 h的GABPB1-AS1及其正義鏈的RNA水平，western bloting檢測對應(yīng)的GABPB1蛋白水平。結(jié)果顯示，GABPB1-AS1與其正義鏈mRNA表達(dá)水平協(xié)同性改變，2～4 h維持高表達(dá)水平，但GABPB1蛋白水平降低，8～24 h GABPB1正反義鏈mRNA均逐漸降低至基線水平左右，而GABPB1蛋白升高（圖3A）。

構(gòu)建載體在HUVEC細(xì)胞中直接過表達(dá)GABPB1-AS1，結(jié)果表明，GABPB1 mRNA和蛋白質(zhì)水平均顯著下降（圖3B）。

生物信息學(xué)分析表明，GABPB1-AS1與其正義鏈的前端有449 nt的互補(bǔ)序列，其中包含GABPB1基因的第一外顯子序列全長（1～424 nt）（圖3C）（https://www.ncbi.nlm.nih. gov/gene/100129387），提示，GABPB1-AS1可能與其正義鏈在細(xì)胞質(zhì)中以互補(bǔ)結(jié)合的二聚體形式存在，并調(diào)節(jié)其正義鏈的穩(wěn)定性和表達(dá)行為。

采用RNA pull down實(shí)驗(yàn)，利用體外轉(zhuǎn)錄的生物素標(biāo)記的GABPB1-AS1 mRNA的前端1～447 nt序列結(jié)合內(nèi)源GABPB1以驗(yàn)證二者的結(jié)合關(guān)系，同時用RPA試驗(yàn)檢測正反義鏈重疊聚合狀態(tài)對RNaseA+T降解GABPB1 mRNA的保護(hù)作用，分析GABPB1-AS1與GABPB1 mRNA的結(jié)合性、結(jié)合位點(diǎn)以及對mRNA穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明，體外轉(zhuǎn)錄的GABPB1-AS1與內(nèi)源GABPB1 mRNA可以在1～447 nt區(qū)域直接結(jié)合，結(jié)合反義鏈的GABPB1 mRNA水平與加入RNase抑制劑的GABPB1 mRNA水平無顯著差異，而單鏈GABPB1 mRNA被RNase降解而顯著降低。證明內(nèi)源性正反義鏈也處于結(jié)合狀態(tài)，GABPB1 mRNA與其反義鏈形成二聚體結(jié)構(gòu)可以促進(jìn)其穩(wěn)定性，防止被RNase降解（圖3D）。

以上結(jié)果提示，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)GABPB1-AS1及其正義鏈mRNA高表達(dá)，二者重疊區(qū)域互補(bǔ)結(jié)合，維持GABPB1 mRNA穩(wěn)定，應(yīng)激結(jié)束后，GABPB1-AS1半衰期恢復(fù)，加速降解，釋放GABPB1 mRNA翻譯，上調(diào)其蛋白水平（圖3E）。

圖3 氧化應(yīng)激狀態(tài)GABPB1-AS1結(jié)合GABPB1 mRNA保持其穩(wěn)定并調(diào)控其應(yīng)激后表達(dá) Figure 3.GABPB1-AS1 Binds to GABPB1 mRNA to Maintain its Stability and Regulate its Expression after Oxidative Stress

3 討論

本研究實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)高表達(dá)的LncRNA GABPB1-AS1在應(yīng)激結(jié)束后調(diào)控適應(yīng)階段的PGC-1α翻譯水平上調(diào)，其機(jī)制是通過海綿作用吸附miR-101，解除其對PGC-1α mRNA翻譯的抑制作用。同時，本研究顯示，LncRNA GABPB1-AS1是核質(zhì)互作信號分子。氧化應(yīng)激條件下GABPB1-AS1維持其正義鏈mRNA穩(wěn)定，應(yīng)激結(jié)束后釋放正義鏈mRNA表達(dá)蛋白，其生理意義為調(diào)控GABPB1 mRNA翻譯和NRF2入核，協(xié)同PGC-1α調(diào)節(jié)適應(yīng)性線粒體生成。這是人類特有的應(yīng)激適應(yīng)性線粒體生成機(jī)制。

細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)是運(yùn)動應(yīng)激的直接結(jié)果和基本狀態(tài)（Thirupathi et al.,2017），運(yùn)動應(yīng)激誘導(dǎo)的活性氧（ROS）是運(yùn)動適應(yīng)性調(diào)控的重要信號途徑（Radak et al.,2013），線粒體生成和抗氧化適應(yīng)是運(yùn)動性適應(yīng)的標(biāo)志性特征（Perry, 2017）。PGC-1α是調(diào)控線粒體生物合成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，能夠激活大量線粒體代謝功能與抗氧化功能相關(guān)蛋白的表達(dá)（Petr et al.,2018），運(yùn)動應(yīng)激可以通過上調(diào)PGC-1α途徑啟動線粒體生成（孫易 等 2017）。研究表明，多種因素導(dǎo)致的氧化應(yīng)激及化學(xué)損傷性應(yīng)激均可以顯著上調(diào)GABPB1-AS1細(xì)胞含量，上調(diào)程度與應(yīng)激強(qiáng)度和持續(xù)時間成正比（Alkhateeb et al.,2019）。我們研究了應(yīng)激因素消除后GABPB1-AS1的表達(dá)行為及其對適應(yīng)性線粒體生成的調(diào)控作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)高表達(dá)的GABPB1-AS1含量在應(yīng)激因素消除后逐漸下降，最終恢復(fù)至基線水平，在此過程中，PGC-1α蛋白水平增高。過表達(dá)GABPB1-AS1具有相同的作用，而敲低GABPB1-AS1則抑制PGC-1α蛋白水平。前期試驗(yàn)結(jié)果表明：200 μM的H2O2刺激HUVEC細(xì)胞3 h對PGC-1α的mRNA水平?jīng)]有顯著影響，提示，GABPB1-AS1在轉(zhuǎn)錄后水平促進(jìn)PGC-1α的表達(dá)。生物信息學(xué)分析表明，miR-101在GABPB1-AS1序列及PGC-1α mRNA的3'UTR上均有結(jié)合位點(diǎn)。已有研究表明，miR-101參與神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激應(yīng)答（Li et al.,2015）。本研究采用RNA pull-down實(shí)驗(yàn)證明，GABPB1-AS1與miR-101可以互補(bǔ)結(jié)合。并且證明，上調(diào)miR-101表達(dá)可以下調(diào)PGC-1α蛋白水平，抑制miR-101水平則PGC-1α蛋白水平上調(diào)。綜合以上結(jié)果認(rèn)為，miR-101可以通過結(jié)合于PGC-1α mRNA的3'UTR抑制其翻譯過程，GABPB1-AS1是定位于細(xì)胞質(zhì)的RNA，與miR-101互補(bǔ)結(jié)合，應(yīng)激狀態(tài)下細(xì)胞質(zhì)內(nèi)高水平的GABPB1-AS1競爭性吸附miR-101，解除其對PGC-1α翻譯的抑制作用，上調(diào)其蛋白水平。

GABPB1-AS1的正義鏈編碼核呼吸因子-2β1亞基（NRF-2β1，又稱為GA結(jié)合蛋白β1亞基，即GABPB1）促進(jìn)線粒體基因表達(dá)（Ongwijitwat et al.,2006）并引導(dǎo)NRF-2入核（Hayashi et al.,2013）與PGC-1α蛋白共同調(diào)節(jié)多數(shù)線粒體能量代謝基因的表達(dá)，促進(jìn)線粒體生物合成（Goffart et al.,2003），直接影響人體有氧運(yùn)動能力（He et al.,2015; Maciejewska-Kar?owska et al.,2012），是重要的線粒體核質(zhì)互作調(diào)控因子。研究表明，多種因素引起的氧化應(yīng)激均可以引起GABPB1-AS1顯著高表達(dá)（Tani et al.,2014）。本研究證實(shí)，氧化應(yīng)激條件下GABPB1-AS1與GABPB1表達(dá)水平協(xié)同上調(diào)，并在應(yīng)激因素消除后協(xié)同下降，但僅過表達(dá)GABPB1-AS1則會下調(diào)GABPB1的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平。這一結(jié)果提示，GABPB1-AS1作為信號分子參與細(xì)胞核質(zhì)互作機(jī)制對氧化應(yīng)激的應(yīng)答，維持GABPB1 表達(dá)水平與線粒體功能狀態(tài)相協(xié)調(diào)。

LncRNA反義鏈通常會通過互補(bǔ)結(jié)合對其正義鏈及其表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)生調(diào)控作用，影響其mRNA的穩(wěn)定性以及翻譯行為（Canzio et al.,2019）。生物信息分析顯示，GABPB1-AS1與其正義鏈在頭部有449個堿基互補(bǔ)（chr15：50354959～50355408），二者可以通過堿基互補(bǔ)配對形成二聚體結(jié)構(gòu)。本研究RNA pull down實(shí)驗(yàn)和RPA實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，GABPB1-AS1與其正義鏈前端1～447 nt互補(bǔ)重疊形成二聚體結(jié)構(gòu)，這一結(jié)構(gòu)防止GABPB1 mRNA被RNase降解，維持其在氧化應(yīng)激狀態(tài)下的穩(wěn)定性。相比于應(yīng)激結(jié)束后從頭表達(dá)GABPB1，這一方式更有利于快速調(diào)節(jié)線粒體適應(yīng)（de Nadal et al.,2011）。

本研究結(jié)果顯示，H2O2刺激后2～8 h，GABPB1-AS1和GABPB1 mRNA水平均顯著增高，但GABPB1蛋白水平下降，16～24 h GABPB1-AS1和GABPB1 mRNA水平下降，而GABPB1蛋白水平顯著增高。這一結(jié)果提示我們，GABPB1-AS1與其正義鏈的二聚體結(jié)構(gòu)在穩(wěn)定GABPB1 mRNA的同時也阻止其翻譯，其生理意義可能是在細(xì)胞受氧化應(yīng)激影響導(dǎo)致內(nèi)環(huán)境尚未恢復(fù)穩(wěn)態(tài)的條件下儲備mRNA的同時，防止蛋白質(zhì)發(fā)生修飾或折疊錯誤。當(dāng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)恢復(fù)后，GABPB1-AS1半衰期逐漸恢復(fù)，加速降解，釋放出正義鏈mRNA結(jié)合核糖體進(jìn)行翻譯，使GABPB1蛋白水平顯著提高，促進(jìn)NRF-2入核，協(xié)同PGC-1α調(diào)節(jié)線粒體生成。氧化應(yīng)激適應(yīng)過程中GABPB1-AS1半衰期調(diào)節(jié)及其對GABPB1 mRNA的釋放作用的具體機(jī)制，還有待進(jìn)一步闡明。

4 結(jié)論

氧化應(yīng)激誘導(dǎo)高表達(dá)的LncRNA GABPB1-AS1在應(yīng)激適應(yīng)階段通過GABPB1-AS1/miR-101/PGC-1α軸上調(diào)PGC-1α蛋白水平，調(diào)控應(yīng)激適應(yīng)性線粒體生成，GABPB1-AS1作為核質(zhì)互作信號分子參與氧化應(yīng)激適應(yīng)性應(yīng)答，調(diào)控其正義鏈編碼蛋白GABPB1協(xié)同促進(jìn)這一過程。GABPB1-AS1參與調(diào)控的線粒體生成調(diào)控機(jī)制是人類特有的應(yīng)激適應(yīng)機(jī)制。