何京亞，桑廣澤，喬友備，賀欣，余喆，吳紅

（空軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系藥物化學(xué)與藥物分析學(xué)教研室，西安710032）

以嗎啡為代表的麻醉性鎮(zhèn)痛藥物因作用于中樞神經(jīng)阿片受體，能強(qiáng)效緩解疼痛，是臨床上最常用的鎮(zhèn)痛藥物。國(guó)內(nèi)常用的阿片類麻醉性鎮(zhèn)痛藥主要有嗎啡、哌替啶、芬太尼、二氫埃托啡、羥考酮、可待因等[1]。其中芬太尼系人工合成的強(qiáng)效麻醉性鎮(zhèn)痛藥，親脂性高，易于透過(guò)血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)與阿片受體結(jié)合，產(chǎn)生強(qiáng)效鎮(zhèn)痛作用，其鎮(zhèn)痛效能約為嗎啡的80～100倍[2-4]。但枸櫞酸芬太尼在機(jī)體內(nèi)吸收、代謝、消除迅速，需重復(fù)給藥才能維持有效血藥濃度。目前上市的芬太尼緩釋制劑主要包括芬太尼透皮貼劑、芬太尼口腔黏膜貼片和芬太尼口頰含片，但我國(guó)上市的僅有透皮貼劑。芬太尼透皮貼劑起效緩慢，20～48 h后才能發(fā)揮較好的鎮(zhèn)痛作用，適于慢性鈍痛治療，且易發(fā)生累積中毒[2-7]。

口腔黏膜給藥作為芬太尼的新型給藥途徑，具有可避免肝臟首過(guò)效應(yīng)、不易致敏、滲透性高、使用方便等特點(diǎn)，無(wú)需用水吞服，特別適合吞咽困難的患者，且可根據(jù)止痛需要決定口頰片在口腔中停留的時(shí)間，一旦出現(xiàn)不適，可隨時(shí)終止用藥。1998年美國(guó)Cephalon公司上市了芬太尼口腔黏膜給藥制劑（商品名：Actiq）[8-9]；2006年11月Cephalon公司采用OraVescent@釋藥發(fā)明技術(shù)開(kāi)發(fā)了首個(gè)芬太尼口腔泡騰片（商品名：Fentora）[10-15]，F(xiàn)entora起效迅速，5～10 min即可達(dá)到有效血藥濃度，但是其鎮(zhèn)痛作用短暫，不能完全滿足長(zhǎng)時(shí)間鎮(zhèn)痛的需要。世界衛(wèi)生組織對(duì)癌癥患者制定了合理應(yīng)用止痛藥的3條基本原則，即三階梯止痛原則：經(jīng)口、按時(shí)、逐級(jí)，目前鎮(zhèn)痛藥的口腔給藥研究已經(jīng)成為鎮(zhèn)痛領(lǐng)域中最具發(fā)展前景的研究之一[16-17]。本課題組在參考Actiq、Fentora制劑基礎(chǔ)上制備了芬太尼口頰片，構(gòu)建了雙相釋藥體系。其中，速釋層采用泡騰聯(lián)合崩解技術(shù)，藥物釋放后經(jīng)口腔黏膜吸收快速達(dá)到有效血藥濃度；緩釋層采用高分子骨架黏性輔料制備，可直接黏附于口腔黏膜并緩慢釋藥，長(zhǎng)時(shí)間維持有效血藥濃度，實(shí)現(xiàn)快速、持久的鎮(zhèn)痛效果。本文采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法檢測(cè)比格犬體內(nèi)枸櫞酸芬太尼血藥濃度，并研究芬太尼口頰片在比格犬體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)。

1 材料

1.1 儀器

Usorvall ST40R臺(tái)式高速離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司）；Masshunter液相色譜輸液泵、RW20渦旋振蕩器（德國(guó)IKA公司）；6460三重四級(jí)桿LC/MS（美國(guó)安捷倫公司）。

1.2 藥品與試劑

芬太尼口頰片（空軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系藥物分析學(xué)教研室自制，批號(hào)：20161104，規(guī)格：675 μg）；枸櫞酸芬太尼對(duì)照品（批號(hào)：171204-200704，純度：100%）、卡馬西平對(duì)照品（批號(hào)：100142-201105，純度：99.7%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 動(dòng)物

比格犬，♂，體質(zhì)量為（15±2）kg，由成都達(dá)碩生物科技有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：No.6100-1960000098，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（川）2014-189，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)空軍軍醫(yī)大學(xué)相關(guān)藥物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審查。

2 方法與結(jié)果

2.1 枸櫞酸芬太尼血藥濃度的測(cè)定

2.1.1 溶液的配制 ①對(duì)照品貯備液。精密稱取枸櫞酸芬太尼對(duì)照品10.0 mg，甲醇溶解配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的貯備液，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩＂趦?nèi)標(biāo)貯備液。精密稱量卡馬西平對(duì)照品50.0 mg，甲醇溶解配制成質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL的貯備液，4℃冰箱保存?zhèn)溆?，臨用時(shí)用甲醇稀釋至所需濃度。

2.1.2 色譜與質(zhì)譜條件色譜柱：Agilent C18（50 mm×4.6 mm，2.7 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.02%甲酸水溶液（95∶5，V/V）；流速：0.5 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；柱溫：30 ℃。檢測(cè)離子：枸櫞酸芬太尼質(zhì)荷比（m/z）337.1→188.0，碰撞能：30 eV，裂解能：130 V；卡馬西平m/z237.1→194.1，碰撞能：40 eV，裂解能：150 V；噴霧電壓：3 500 V；毛細(xì)管溫度：350℃；霧化氣流速：12.0 L/min。采用電噴霧電離源（ESI），正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）掃描分析。

2.1.3 血漿樣品的預(yù)處理 取比格犬血漿200 μL，置于離心管中，加10μL內(nèi)標(biāo)溶液（50 ng/mL）渦旋振蕩30 s，加入1 mL甲醇，渦旋混勻后12 000 r/min離心15 min，移取800 μL上清液至1.5 mL離心管，氮?dú)獯蹈桑瑲堅(jiān)?0 μL甲醇復(fù)溶，12 000 r/min離心15 min，取上清液5 μL進(jìn)行LC-MS/MS分析。

2.1.4 專屬性考察 取比格犬空白血漿200 μL，除用10 μL甲醇代替內(nèi)標(biāo)溶液外其余按“2.1.3”項(xiàng)下方法處理，再按“2.1.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析得空白血漿樣品的色譜圖；將50 ng/mL枸櫞酸芬太尼對(duì)照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液加入空白血漿中，按上述方法操作得空白血漿+枸櫞酸芬太尼+內(nèi)標(biāo)的色譜圖。結(jié)果表明，空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾枸櫞酸芬太尼和卡馬西平的測(cè)定，枸櫞酸芬太尼的保留時(shí)間為1.1 min，卡馬西平的保留時(shí)間為1.3 min。色譜圖見(jiàn)圖1。

2.1.5 線性關(guān)系考察 精密量取對(duì)照品貯備液適量，甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為 3 250.0、1 000.0、550.0、100.0、55.0、32.5、10.0 ng/mL的對(duì)照品系列溶液。分別吸取上述對(duì)照品系列溶液20 μL加入到200 μL空白血漿中，按照“2.1.3”項(xiàng)下方法處理，取上清液5 μL進(jìn)行LC-MS/MS分析。以枸櫞酸芬太尼色譜峰面積與卡馬西平色譜峰面積之比為縱坐標(biāo)（y），枸櫞酸芬太尼質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），進(jìn)行線性回歸。得回歸方程為y＝0.964 7x+5.284 1（r＝0.998），結(jié)果表明，枸櫞酸芬太尼在 1.0～325.0 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，定量下限為1.0 ng/mL。

2.1.6 精密度試驗(yàn) 按“2.1.5”項(xiàng)下方法，取比格犬空白血漿200 μL加入枸櫞酸芬太尼對(duì)照品配制低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度（2、50、300 ng/mL）的血漿樣品，按照“2.1.3”項(xiàng)下方法處理，取上清液5 μL進(jìn)行LC-MS/MS分析，每一濃度進(jìn)行6樣本分析，連續(xù)測(cè)定3 d，根據(jù)當(dāng)日回歸方程計(jì)算樣品的質(zhì)量濃度，計(jì)算日內(nèi)、日間RSD。結(jié)果表明，本分析方法的日內(nèi)RSD＜5%（n＝6），日間RSD＜6%（n＝3），符合2015年版《中國(guó)藥典》（四部）生物樣品分析指導(dǎo)原則的有關(guān)規(guī)定。精密度結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1LC-MS/MS圖Fig 1 LC-MS/MS chromatograms

表1 精密度結(jié)果Tab 1 Results of precision

2.1.7 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 按“2.1.5”項(xiàng)下方法，取比格犬空白血漿200 μL加入枸櫞酸芬太尼對(duì)照品配制低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度（2、50、300 ng/mL）的血漿樣品，按照“2.1.3”項(xiàng)下方法處理，取上清液5 μL進(jìn)行LC-MS/MS分析，每一濃度進(jìn)行6樣本分析，根據(jù)當(dāng)日回歸方程計(jì)算樣品的質(zhì)量濃度，以測(cè)得濃度與配制濃度的比值計(jì)算回收率。結(jié)果顯示，低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度血漿樣品的平均回收率分別為（94.65±6.32）%、（96.74±4.61）%、（99.21±3.24）%，RSD分別為5.7%、4.2%、3.2%（n＝6）。

2.1.8 基質(zhì)效應(yīng) 取比格犬空白血漿200 μL，除不加對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)溶液外其余按照“2.1.3”項(xiàng)下方法處理后獲得殘?jiān)?，加入相?yīng)質(zhì)量濃度的對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋振蕩，氮?dú)獯蹈?，以甲醇溶解后得到低、中、?個(gè)質(zhì)量濃度（2、50、300 ng/mL）的含有基質(zhì)的樣品，每一濃度進(jìn)行6樣本分析，與不含基質(zhì)的相應(yīng)峰面積的比值考察基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果顯示，低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度樣品基質(zhì)效應(yīng)的RSD分別為4.1%、5.0%、8.3%（n＝6），均＜15%，符合2015年版《中國(guó)藥典》（四部）生物樣品分析指導(dǎo)原則的有關(guān)規(guī)定，表明可以忽略基質(zhì)效應(yīng)對(duì)本試驗(yàn)樣品測(cè)定的影響。

2.1.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.1.5”項(xiàng)下方法，取比格犬空白血漿200 μL加入枸櫞酸芬太尼對(duì)照品配制低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度（2、50、300 ng/mL）的血漿樣品，分別考察于－20℃凍藏4周、3次凍融循環(huán)、室溫（約20℃）放置12 h和預(yù)處理后4℃冷凍24 h的穩(wěn)定性，每一質(zhì)量濃度進(jìn)行3樣本分析。穩(wěn)定性結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 穩(wěn)定性結(jié)果（n＝3）Tab 2Results of stability（n＝3）

2.2 藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)

成人體質(zhì)量按60 kg計(jì)算，根據(jù)人用劑量（900 μg/片）按體質(zhì)量換算法換算犬用劑量為45 μg/kg。取健康比格犬6只，給藥前禁食12 h，自由飲水，然后口頰給予芬太尼口頰片1片，保證藥物的含服時(shí)間在30 min以上，分別于給藥后2、5、10、15、30、45、60、90、120、240、360、480、720 min取犬前肢內(nèi)側(cè)下靜脈血1 mL左右，置于含有肝素鈉的抗凝管中，分離血漿，備用。取各時(shí)間點(diǎn)的血漿樣品，按照“2.1.3”項(xiàng)下方法處理后，按“2.1.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，計(jì)算枸櫞酸芬太尼的血藥濃度，繪制藥-時(shí)曲線。采用藥物臨床評(píng)價(jià)中心開(kāi)發(fā)的DAS 2.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行自動(dòng)運(yùn)算，對(duì)每只比格犬的藥-時(shí)數(shù)據(jù)進(jìn)行智能化處理擬合二室模型，計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。芬太尼口頰片在犬體內(nèi)的藥-時(shí)曲線圖見(jiàn)圖2，藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表3。

由圖2和表3可知，芬太尼口頰片在比格犬體內(nèi)的血藥濃度呈現(xiàn)先快速升高，后緩慢降低的趨勢(shì)，tmax為（32.5±6.1）min，t1/2為（211.8±47.4）min，由此可見(jiàn)，芬太尼口頰片既能在給藥后迅速發(fā)揮作用，又能維持長(zhǎng)時(shí)間的藥效。

圖2 芬太尼口頰片在犬體內(nèi)的藥-時(shí)曲線Fig 2 Blood concentration-time curves of Fentanyl buccal tablet in Beagle dogs

表3 芬太尼口頰片在犬體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s，n＝6）Tab 3 Pharmacokinetic parameters of Fentanyl buccal tablet in Beagle dogs（±s，n＝6）

表3 芬太尼口頰片在犬體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s，n＝6）Tab 3 Pharmacokinetic parameters of Fentanyl buccal tablet in Beagle dogs（±s，n＝6）

參數(shù)AUC0-720 min，ng·min/mL AUC0-∞，ng·min/mL CLz/F，L/（min·kg）cmax，ng/mL t1/2，min tmax，min結(jié)果7 564．0±1 576．7 8 206．3±1 633．5 0．006±0．001 40．3±1．9 211．8±47．4 32．5±6．1

3 討論

一個(gè)合適的內(nèi)標(biāo)物要求其性質(zhì)穩(wěn)定，不易分解，不干擾待測(cè)組分的檢測(cè)。筆者最初選取了3個(gè)化合物（卡馬西平、奈福泮、苯巴比妥）作為待選內(nèi)標(biāo)物。前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，卡馬西平的提取條件、色譜保留行為與待測(cè)化合物枸櫞酸芬太尼接近且回收率較高、質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)，故選擇了卡馬西平作為內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行定量分析。

在血漿樣品處理中，由于枸櫞酸芬太尼在乙酸乙酯中溶解性較差，難以萃取，因此，用甲醇蛋白沉淀法處理樣品，該法處理簡(jiǎn)單、回收率高，適用于測(cè)定比格犬血漿中枸櫞酸芬太尼的濃度。

本文建立了比格犬體內(nèi)枸櫞酸芬太尼血藥濃度測(cè)定的LC-MS/MS法，研究結(jié)果表明，本方法簡(jiǎn)便、可行、準(zhǔn)確。藥動(dòng)學(xué)研究結(jié)果顯示，芬太尼口頰片在比格犬體內(nèi)具有良好的速釋緩釋雙相釋藥特性。