易秋艷，崔學(xué)文，羅軍，劉文躍，袁軍#

（1.四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測院微生物中心，成都611731；2.四川明欣藥業(yè)有限責(zé)任公司質(zhì)量部，成都 611130）

結(jié)核病是由結(jié)核桿菌感染引起的慢性傳染病，肺結(jié)核對個人、家庭和社會的危害極大[1]。利福布汀為利福霉素S的螺旋哌啶衍生物，在臨床中主要用于分支桿菌感染所致疾病如結(jié)核及鳥分枝桿菌-胞內(nèi)分支桿菌復(fù)合體（MAC）感染，其對結(jié)核桿菌的抑制作用比利福平約強(qiáng)4倍[2]，應(yīng)用前景良好。目前，利福布?。ㄔ纤帲┘袄２纪∧z囊僅一家企業(yè)生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號為國藥準(zhǔn)字H20070294（利福布?。?、H20070296（利福布汀膠囊）；現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的YBH05792007[3]（利福布?。?、YBH05812007[4]（利福布汀膠囊），在這兩個標(biāo)準(zhǔn)中，有關(guān)物質(zhì)的檢查均采用高效液相色譜（HPLC）法測定，色譜系統(tǒng)相同，但筆者經(jīng)試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)行方法中利福布汀與相鄰雜質(zhì)峰不能達(dá)到有效分離，雜質(zhì)檢出率較低，經(jīng)網(wǎng)上檢索后也未見利福布汀有關(guān)物質(zhì)檢查研究的相關(guān)文獻(xiàn)報道。為此，筆者參照《美國藥典》（USP）[5]、《歐洲藥典》（EP）9.0[6]和相關(guān)文獻(xiàn)[7-15]，對現(xiàn)行方法進(jìn)行了改進(jìn)，以提高雜質(zhì)檢出率，提高對該產(chǎn)品的質(zhì)量控制水平。

1 材料

1.1 儀器

LC-2010CHT高效液相色譜（HPLC）儀（日本Shimadzu公司）；2695 HPLC儀（美國Waters公司）；CPA225D十萬分之一電子天平（德國Sartorius公司）。

1.2 藥品與試劑

利福布汀原料藥（批號：15070356、16050656、17020156，純度：96.6%、97.3%、97.0%）、利福布汀膠囊（批號：16010157、16010257、17090257，規(guī)格：0.15 g）均來源于四川明欣藥業(yè)有限責(zé)任公司；利福布汀對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：130586-200901，純度：97.2%）；水為超純水，乙腈為色譜純，磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、鹽酸等均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Agilent XDB-C8（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈-0.1 mol/L磷酸二氫鉀溶液（用2 mol/L氫氧化鈉調(diào)pH至6.5±0.1）（50∶50，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：254 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.1.2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取約10 mg利福布汀原料藥，用2 mL甲醇溶解后，加2 mol/L氫氧化鈉溶液1 mL，靜置4 min，加2 mol/L鹽酸溶液1 mL中和，再用流動相稀釋至50 mL。取此溶液10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，利福布汀峰前應(yīng)出現(xiàn)1個大的及2個小的降解產(chǎn)物峰。利福布汀峰與相鄰降解產(chǎn)物峰之間的分離度應(yīng)不小于1.3；理論板數(shù)按利福布汀峰計應(yīng)不低于2 000。系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜圖見圖1A。

圖1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms of system suitability tests

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液 （1）原料藥。取適量本品，精密稱量，以流動相溶解并稀釋制成每1 mL中含利福布汀1.0 mg的溶液，即得。（2）膠囊。取內(nèi)容物適量，精密稱量，以流動相溶解并稀釋制成每1 mL中含利福布汀1.0 mg的溶液，濾過，取續(xù)濾液即得。

2.2.2 對照溶液 取適量利福布汀對照品，以流動相溶解并稀釋制成每1 mL中含利福布汀0.01 mg的溶液，作為對照溶液。

2.2.3 靈敏度溶液 取對照溶液適量，以流動相準(zhǔn)確稀釋20倍，即得。

2.3 線性關(guān)系考察

取用流動相逐級稀釋的利福布汀對照品系列溶液（每 1 mL 中含利福布汀 0.000 8、0.001、0.010、0.012、0.016 mg），測定峰面積，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）、峰面積為縱坐標(biāo)（y），進(jìn)行線性回歸，得線性方程為y＝4.114×107x+7.178×102（r＝1.000 0），利福布汀的檢測質(zhì)量濃度線性范圍為0.000 8～0.016 mg/mL。

2.4 專屬性試驗(yàn)

取利福布汀原料藥（批號：17020156）和膠囊（批號：16010157）內(nèi)容物適量，分別加入2 mol/L鹽酸溶液1 mL，破壞15 min，得酸破壞后樣品；用0.25 mol/L氫氧化鈉溶液2 mL，破壞2 min，得堿破壞后樣品；用6%過氧化氫溶液2 mL，破壞8 min，得氧化破壞后樣品；用130℃高溫破壞6 h，得高溫破壞后樣品；用大于4 000 lx的光近距離照射7 d，得光照破壞后樣品；取上述各破壞后樣品及未破壞的樣品按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液并進(jìn)樣檢測。結(jié)果，檢出多個降解峰，且均不干擾主峰的檢測。專屬性試驗(yàn)色譜圖見圖2。

2.5 檢測限與定量限考察

確定測定峰高約為基線噪音3倍時為檢測限、10倍時為定量限，結(jié)果利福布汀的檢測限為0.025 4 μg/mL，定量限為0.085 2 μg/mL，定量限相當(dāng)于供試品進(jìn)樣量的0.009%，靈敏度符合要求。

2.6 精密度試驗(yàn)

取“2.3”項(xiàng)下利福布汀對照品溶液（0.010 mg/mL），連續(xù)測定6次，計算得利福布汀峰面積的RSD為0.07%（n＝6），表明儀器精密度較好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

分別取同一批利福布汀原料藥及膠囊樣品，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，平行6份，測定供試品溶液中利福布汀及其雜質(zhì)總含量。結(jié)果，原料藥（批號：17020156）中雜質(zhì)總含量的RSD為1.8%（n＝6），膠囊（批號：16010157）中雜質(zhì)總含量的RSD為1.4%（n＝6）；原料藥（批號：17020156）中利福布汀含量的RSD為0.77%（n＝6），膠囊（批號：16010157）中利福布汀含量的RSD為0.92%（n＝6），表明方法重復(fù)性好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取利福布汀原料藥（批號：17020156）和利福布汀膠囊（批號：16010157）內(nèi)容物適量，分別按“2.2.1”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，放置于室溫，分別在0、2、4、8、10、12 h進(jìn)樣測定，計算各雜質(zhì)的峰面積。結(jié)果，原料藥中利福布汀峰面積的RSD為0.07%（n＝6），膠囊中利福布汀峰面積的RSD為0.10%（n＝6），表明原料藥和膠囊的供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

圖2 專屬性試驗(yàn)的高效液相色譜圖Fig 2 HPLC chromatograms of specification test

2.9 耐用性試驗(yàn)

微調(diào)流動相流速（0.9、1.1 mL/min）、流動相中乙腈比例（45%、55%）、流動相 pH（6.3、6.7）、柱溫（25、35 ℃）、不同色譜柱（Kromasil C8、Sepax C8，規(guī)格：均為250 mm×4.6 mm，5 μm），用系統(tǒng)適用性溶液按上述條件進(jìn)行耐用性試驗(yàn)。結(jié)果，各峰的分離度良好，表明方法耐用性較好。耐用性試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 耐用性試驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Results of durability tests

2.10 有關(guān)物質(zhì)檢查法

精密量取“2.2”項(xiàng)下3種溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時間的3倍。供試品溶液色譜圖中如有雜質(zhì)峰，單個雜質(zhì)峰面積不得大于對照溶液主峰面積（1.0%），大于對照溶液主峰面積0.5倍（0.5%）的峰不得多于1個。各雜質(zhì)峰面積的和不得大于對照溶液主峰面積的3倍（3.0%）。供試品溶液色譜圖中小于靈敏度溶液主峰面積的峰可忽略不計（0.05%）。

2.11 與現(xiàn)行方法比較

2.11.1 色譜條件 在現(xiàn)行方法的供試品溶液制備中，采用先加乙腈溶解再用流動相稀釋的方法，制備的質(zhì)量濃度約為0.5 mg/mL；而新方法的供試品溶液制備時，直接用流動相溶解并稀釋制成質(zhì)量濃度約為1.0 mg/mL的溶液。此新方法中的供試品溶液制備方法，可適當(dāng)消除溶劑效應(yīng)，且在進(jìn)樣體積相同的情況下將樣品量提高了1倍，這將更有利于雜質(zhì)的檢出。另外，在現(xiàn)行方法中，采用C18柱進(jìn)行分離，而改進(jìn)方法參照USP、EP的方法，選用C8柱進(jìn)行試驗(yàn)。

2.11.2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取利福布汀原料藥（批號：17020156）按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液，采用現(xiàn)行方法和新方法，進(jìn)樣分析，結(jié)果見圖1A、B。

由圖1可見，在現(xiàn)行方法中，利福布汀峰與相鄰的降解峰3之間的分離度為3.47，遠(yuǎn)小于新方法中利福布汀峰與降解峰3的分離度7.50；另外，采用現(xiàn)行方法時，利福布汀主峰的保留時間約為30 min，較新方法的24 min更長；故新方法的色譜分離能力優(yōu)于現(xiàn)行方法，且檢測時間更短。

2.11.3 樣品中有關(guān)物質(zhì)的檢查 按“2.10”項(xiàng)下方法測定原料藥和膠囊的有關(guān)物質(zhì)（峰面積歸一化法），采用現(xiàn)行方法和改進(jìn)方法進(jìn)行檢查的結(jié)果見表2、表3，色譜圖見圖3、圖4。

表2 采用現(xiàn)行方法檢查利福布汀及膠囊中有關(guān)物質(zhì)的結(jié)果Tab 2 Determination of related substances in rifabutin crude drug and capsules by current methods

表3 采用新方法檢查利福布汀及膠囊中有關(guān)物質(zhì)的結(jié)果Tab 3 Results of related substances in rifabutin crude drug and capsules by new methods

圖3 原料藥中有關(guān)物質(zhì)檢查高效液相色譜圖（批號：15070356）Fig 3 HPLC chromatograms of related substance in crude drug（No.15070356）

由表2、表3及圖3、圖4可見，采用新方法檢出的雜質(zhì)個數(shù)較現(xiàn)行方法多1～5個，雜質(zhì)總量高出0.19%～0.55%，新方法與現(xiàn)行方法比較主峰峰形更好，與雜質(zhì)峰分離更好，檢出的雜質(zhì)個數(shù)更多。

圖4 膠囊中有關(guān)物質(zhì)檢查高效液相色譜圖（批號：17090257）Fig 4 HPLC chromatograms of related substance in capsules（No.17090257）

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

3.1.1 色譜柱的選擇 現(xiàn)行方法采用C18柱進(jìn)行分離，而新方法參照USP和EP的方法，選用C8柱進(jìn)行試驗(yàn)，且色譜柱規(guī)格選用了國內(nèi)常見的250 mm×4.6 mm。由系統(tǒng)適用性試驗(yàn)結(jié)果可見，在利福布汀主峰與其前相鄰雜質(zhì)峰的分離方面，新方法的C8柱優(yōu)于現(xiàn)行方法的C18柱。

3.1.2 溶劑的選擇 在現(xiàn)行方法中，基于利福布汀在乙腈中易溶的特點(diǎn)，所以選用乙腈為溶劑溶解樣品后再用流動相稀釋至刻度的方法。在新方法中，雖然制備的供試品溶液質(zhì)量濃度更高，但只用流動相依然能夠很好地溶解樣品。故最終只選用流動相作為溶劑，消除了先加入乙腈后帶來的溶劑效應(yīng)。

3.2 對樣品破壞試驗(yàn)的探討

從強(qiáng)制破壞試驗(yàn)結(jié)果可以看出，利福布汀原料藥在試驗(yàn)設(shè)計的光照、氧化、酸、熱和堿降解條件下均發(fā)生降解。在按峰面積歸一化法計算雜質(zhì)含量時，筆者發(fā)現(xiàn)利福布汀在氧化降解條件下相對保留時間約為0.41的雜質(zhì)比未破壞時約增加了0.5%；在酸降解條件下相對保留時間約為0.64的雜質(zhì)比未破壞時約增加了1.2%；在高溫降解條件下相對保留時間約為0.19、0.25和0.41的雜質(zhì)比未破壞時分別增加了0.5%、1.1%和0.5%；在堿降解條件下相對保留時間約為0.45、0.64和0.75的雜質(zhì)比未破壞時分別增加了2.4%、4.7%和1.5%。故認(rèn)為對試驗(yàn)中主要降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)分析有待進(jìn)一步研究，以便更好地控制利福布汀的質(zhì)量。

綜上，采用新方法進(jìn)行利福布汀原料藥和膠囊中有關(guān)物質(zhì)的檢查，方法適用性良好，且與現(xiàn)行方法相比較，有出峰更快、峰形更好、分離雜質(zhì)更多的優(yōu)點(diǎn)。故新的方法靈敏、簡單，適用于對利福布汀原料藥及膠囊的有關(guān)物質(zhì)檢查。