張瑜，張富賡，張少?gòu)?qiáng)，朱明丹，肖學(xué)鳳，杜武勛#

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，天津301617；2.天津市環(huán)湖醫(yī)院藥劑科，天津 300350；3.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，天津 300150；4.天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津 301617）

芪藶強(qiáng)心膠囊由《金匱要略》中的葶藶大棗瀉肺湯加減而成[1]，由黃芪、附子、人參、丹參、葶藶子等11味飲片組成，用以治療輕、中度充血性心力衰竭，具有益氣溫陽(yáng)、活血通絡(luò)、利水消腫的功效[2]。對(duì)于高血壓、心肌病、冠心病、肺心病等合并慢性心力衰竭患者，在標(biāo)準(zhǔn)西醫(yī)治療基礎(chǔ)上，加用芪藶強(qiáng)心膠囊能夠進(jìn)一步緩解臨床癥狀，減輕藥物副作用[3-5]。相關(guān)研究表明，芪藶強(qiáng)心膠囊不僅具有強(qiáng)心、利尿、擴(kuò)血管作用，同時(shí)還能通過(guò)抑制心肌炎癥反應(yīng)與抗氧化應(yīng)激，改善心肌細(xì)胞能量代謝，抑制心室重構(gòu)[6-7]。芪藶強(qiáng)心膠囊中是哪些有效成分進(jìn)入體內(nèi)發(fā)揮藥效作用暫不明確。中藥藥動(dòng)學(xué)是目前闡明這些問(wèn)題的根本途徑[8-9]。因此，本課題組根據(jù)中藥君臣佐使的配伍原則，以芪藶強(qiáng)心膠囊中臣藥葶藶子為研究對(duì)象進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)研究，其中葶藶子的有效成分主要以芥子堿硫氰酸鹽、槲皮素和山柰酚為主[10-13]?；诖?，筆者建立高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）法，考察芪藶強(qiáng)心膠囊臣藥葶藶子中芥子堿硫氰酸鹽、槲皮素和山柰酚在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)，為進(jìn)一步明確芪藶強(qiáng)心膠囊的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

LC-20A色譜儀（日本島津公司）；API 4000質(zhì)譜儀（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）；XS 205電子天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）；MIKRO 220R低溫高速離心機(jī)（德國(guó)Hettich公司）；Sorvall RC-6Plus離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司）；Targin VX-02多管蝸旋振蕩器（北京踏錦科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

芪藶強(qiáng)心膠囊（石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：140805，其中芥子堿硫氰酸鹽1.167 mg/g、槲皮素0.019 mg/g、山柰酚0.030 mg/g）；芥子堿硫氰酸鹽對(duì)照品（批號(hào)：111702-201504，純度：99.5%）、槲皮素對(duì)照品（批號(hào)：100081-201509，純度：98.6%）、山柰酚對(duì)照品（批號(hào)：110861-201509，純度：99.0%）、氯霉素（內(nèi)標(biāo)）對(duì)照品（批號(hào)：130555-201203，純度：99.8%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，甲酸為分析純，水為超純水。

1.3 動(dòng)物

SD大鼠，♂，6只，體質(zhì)量（220±20）g，SPF級(jí)，由解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（軍）-2014-0004，動(dòng)物房溫度（22±2）℃，濕度（50±10）%，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)天津中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜及質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Agilent ZOBRAX XDB-C18（50 mm×4.6 mm，3.5 μm）；流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液（A）-含0.1%甲酸的乙腈溶液（B）梯度洗脫（0.01～0.6 min，7%B；0.6～0.8 min，7% →15%B；0.8～7.8 min，15%→65%B；7.8～8.8 min，65%→100%B；8.8～9.8 min，100%B；9.8～9.81 min，100%→7%B；9.81～12 min，7%B）；流速：0.45 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：10μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源（ESI）；檢測(cè)模式：負(fù)離子模式；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；噴霧電壓：－4 200 V；脫溶液溫度：600 ℃；氣簾氣：20 L/min；霧化氣：65 L/min；加熱輔助氣：55 L/min。定量離子為芥子堿硫氰酸鹽質(zhì)荷比（m/z）310.2→251.2（解簇電壓：－170 V，碰撞能量：－52 V，出口電壓：－13 V），槲皮素m/z301.1→150.7（解簇電壓：－70 V，碰撞能量：－26 V，出口電壓：－5 V），山柰酚m/z286.2→242.0（解簇電壓：－75 V，碰撞能量：－46 V，出口電壓：－11 V），氯霉素m/z320.9→151.9（解簇電壓：－50 V，碰撞能量：－20 V，出口電壓：－15 V）。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取芥子堿硫氰酸鹽、槲皮素和山柰酚對(duì)照品適量，以二甲基亞砜（DMSO）溶解制成質(zhì)量濃度為2 mg/mL的對(duì)照品貯備液。精密量取上述對(duì)照品貯備液適量，通過(guò)甲醇-水溶液（1∶1，V/V）稀釋得到芥子堿硫氰酸鹽質(zhì)量濃度為0.5、1、2.5、10、25、100、250、1 000 ng/mL、槲皮素及山柰酚質(zhì)量濃度均為1、2、5、20、50、200、500、2 000 ng/mL的混合對(duì)照品溶液。以上溶液均保存于4℃冰箱。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液的制備 精密稱取氯霉素對(duì)照品適量，用甲醇-乙腈溶液（1∶1，V/V）溶解并制成質(zhì)量濃度為20 ng/mL的內(nèi)標(biāo)溶液，置于4℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 血漿樣品處理

取大鼠血漿樣品50 μL，加入10 μL維生素C溶液（1.4 mg/mL，抗氧化劑）和150 μL 內(nèi)標(biāo)溶液，蝸旋30 s，離心10 min（4 ℃，15 000 r/min），取上清液，氮?dú)獯蹈桑瑴y(cè)定前用100 μL 50%甲醇水復(fù)溶，取10μL進(jìn)樣分析。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性 取空白血漿、空白血漿+混合對(duì)照品溶液、灌胃給藥20 min后大鼠血漿，按“2.3”項(xiàng)下方法處理血漿樣品，再按“2.1”項(xiàng)下色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果，芥子堿硫氰酸鹽、槲皮素、山柰酚和氯霉素互不干擾，峰形良好，且不會(huì)受到大鼠血漿樣品中雜質(zhì)及內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，表明方法專屬性良好。典型MRM色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 典型MRM色譜圖Fig 1 Representation MRM chromatograms

2.4.2 線性關(guān)系與定量下限 取空白血漿50 μL，分別加入不同質(zhì)量濃度的芥子堿硫氰酸鹽、槲皮素和山柰酚的混合對(duì)照品溶液，配制成芥子堿硫氰酸鹽質(zhì)量濃度為0.05、0.1、0.25、1、2.5、10、25、100 ng/mL，槲皮素和山柰酚質(zhì)量濃度均為0.1、0.2、0.5、2、5、20、50、200 ng/mL的系列溶液。按“2.3”項(xiàng)下方法處理血漿樣品，“2.1”項(xiàng)下色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，以各成分對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），對(duì)照品與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸，得到芥子堿硫氰酸鹽的回歸方程為y＝2.91×10－2x+0.015（r＝0.999 4），線性范圍為0.05～100 ng/mL，定量下限為0.05 ng/mL；槲皮素的回歸方程為y＝4.5×10－3x+0.001 7（r＝0.999 7），線性范圍為0.1～200 ng/mL，定量下限為0.1 ng/mL；山柰酚的回歸方程為y＝8.0×10－4x+0.001 3（r＝0.999 9），線性范圍為0.1～200 ng/mL，定量下限為0.1 ng/mL。

2.4.3 精密度與準(zhǔn)確度 取空白血漿，分別加入適量混合對(duì)照品溶液，得到芥子堿硫氰酸鹽（0.1、1、80 ng/mL）、槲皮素（0.2、2、160 ng/mL）、山柰酚（0.2、2、160 ng/mL）低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的血漿質(zhì)控樣品（QC），按“2.3”項(xiàng)下方法處理血漿樣品，按“2.1”項(xiàng)下色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。于同日內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算日內(nèi)精密度及準(zhǔn)確度；連續(xù)測(cè)定3 d，計(jì)算日間精密度及準(zhǔn)確度。結(jié)果，血漿中芥子堿硫氰酸鹽、槲皮素、山柰酚日內(nèi)精密度的RSD均≤9.63%（n＝6），準(zhǔn)確度在94.67%～101.21%、98.11%～102.00%、100.17%～102.71%之間；日間精密度的RSD均≤11.55%（n＝6），且準(zhǔn)確度分別在98.43%～99.20%、98.97%～102.88%、99.54%～102.85%之間，滿足生物樣品測(cè)定的要求。

2.4.4 基質(zhì)效應(yīng) 取空白血漿50 μL，加入芥子堿硫氰酸鹽、槲皮素及山柰酚低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的QC樣品，每個(gè)質(zhì)量濃度平行制備6份，按“2.3”項(xiàng)下方法處理血漿樣品，再按“2.1”項(xiàng)下色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，記錄各成分峰面積（A）；另取甲醇水溶液代替空白血漿，測(cè)得成分峰面積（B），基質(zhì)效應(yīng)計(jì)算公式為A/B×100%。結(jié)果，芥子堿硫氰酸鹽、槲皮素、山柰酚血漿樣品低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的基質(zhì)效應(yīng)分別為101.61%～86.70%（RSD≤7.63%，n＝6）、101.41%～80.94%（RSD≤9.61%，n＝6）、79.92%～103.24%（RSD≤6.03%，n＝6）。基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果Tab 1 Results of matrix effect

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取空白血漿50 μL，加入芥子堿硫氰酸鹽、槲皮素及山柰酚低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的QC樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法處理血漿樣品后，分別在室溫放置24 h、自動(dòng)進(jìn)樣器中放置24 h、－20℃條件下反復(fù)凍融3次、－80℃條件下放置30 d考察樣品穩(wěn)定性。結(jié)果，芥子堿硫氰酸鹽、槲皮素、山柰酚樣品在上述條件下穩(wěn)定，各成分測(cè)得濃度均值與標(biāo)示濃度的RE≤14.69%。

2.5 藥動(dòng)學(xué)研究

取大鼠6只，給藥前禁食12 h，自由飲水。灌胃給予1.3 g/kg芪藶強(qiáng)心膠囊混懸液[根據(jù)臨床用量換算而得，人與大鼠的換算系數(shù)Rab為6.17[14]]，于給藥后0.083、0.167、0.333、0.667、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24 h經(jīng)目?jī)?nèi)眥靜脈叢取血約0.5 mL，置于肝素化抗凝管中，離心10 min（4 ℃，12 000 r/min），取上層血漿，按“2.3”項(xiàng)下方法處理血漿樣品，并按“2.1”項(xiàng)下色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，采用DAS 3.0軟件非房室模型計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。結(jié)果，大鼠灌胃芪藶強(qiáng)心膠囊后血漿中芥子堿硫氰酸鹽、槲皮素和山柰酚的藥-時(shí)曲線見(jiàn)圖2，主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表2。

圖2 大鼠體內(nèi)芥子堿硫氰酸鹽、槲皮素和山柰酚的藥-時(shí)曲線Fig 2 Plasma concentration-time curves for sinapine thiocyanate，quercetin and kaempferol in rats

表2 大鼠灌胃芪藶強(qiáng)心膠囊后芥子堿硫氰酸鹽、槲皮素和山柰酚的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s，n＝6）Tab 2 Pharmacokinetic parameters for sinapine thiocyanate，quercetin and kaempferol in rats after intragastric administration of Qili qiangxin capsule（±s，n＝6）

表2 大鼠灌胃芪藶強(qiáng)心膠囊后芥子堿硫氰酸鹽、槲皮素和山柰酚的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s，n＝6）Tab 2 Pharmacokinetic parameters for sinapine thiocyanate，quercetin and kaempferol in rats after intragastric administration of Qili qiangxin capsule（±s，n＝6）

藥動(dòng)學(xué)參數(shù)cmax，ng/mL tmax，h t1/2，h CL，mL/（h·kg）Vd，mL·h/kg AUC0-24 h，h·ng/mL AUC0-∞，h·ng/mL芥子堿硫氰酸鹽1．35±0．62 1．5±0．00 3．98±0．99 3 683．82±987．96 28 715．50±7 659．82 3．98±1．21 8．76±2．85槲皮素3．23±1．26 0．67±0．00 3．33±0．41 2 852．33±695．88 13 998．15±4 878．43 10．96±3．42 15．03±5．28山柰酚5．26±1．66 0．67±0．00 4．54±0．85 1 611．85±129．59 10 356．47±1 402．80 13．59±5．35 18．91±1．54

3 討論

芪藶強(qiáng)心膠囊長(zhǎng)期應(yīng)用于臨床，可顯著降低慢性心力衰竭患者明尼蘇達(dá)生活質(zhì)量評(píng)分、減少?gòu)?fù)合終點(diǎn)事件發(fā)生率[15-16]。其相關(guān)的藥理作用報(bào)道較多，但芪藶強(qiáng)心膠囊方中潛在效應(yīng)成分的藥動(dòng)學(xué)特征研究較少，而復(fù)方藥動(dòng)學(xué)研究對(duì)于揭示中藥作用的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制，促進(jìn)中醫(yī)藥的現(xiàn)代化具有重要的意義[17-19]。因此，本課題組以臣藥葶藶子為例，分別選擇質(zhì)量控制成分芥子堿硫氰酸鹽和藥物效應(yīng)成分槲皮素、山柰酚對(duì)芪藶強(qiáng)心膠囊在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征進(jìn)行考察。

藥動(dòng)學(xué)結(jié)果顯示，大鼠灌胃芪藶強(qiáng)心膠囊后槲皮素、山柰酚可被快速吸收入血，0.67 h即達(dá)到峰濃度（cmax），cmax分別為（3.23±1.26）、（5.26±1.66）ng/mL，芥子堿硫氰酸鹽達(dá)峰時(shí)間在1.5 h左右，cmax為（1.35±0.62）ng/mL；3種成分在生物體內(nèi)清除較快，半衰期（t1/2）相接近，在3.33～4.54 h之間，且芥子堿硫氰酸鹽的血漿清除率[CL＝3 683.82 mL/（h·kg）]高于槲皮素[CL＝2 682.33 mL/（h·kg）]及山柰酚[CL＝1 611.85 mL/（h·kg）]，說(shuō)明前者被代謝的速度最快，在體內(nèi)停留的時(shí)間最短；表觀分布容積（Vd）通常與血藥濃度成反比，代表藥物的組織攝取程度[20]，本實(shí)驗(yàn)中Vd從大到小排序依次為芥子堿硫氰酸鹽＞槲皮素＞山柰酚，說(shuō)明芥子堿硫氰酸鹽的組織攝取度多，體內(nèi)分布廣泛；AUC反映藥物進(jìn)入人體循環(huán)的相對(duì)量，是衡量藥物利用程度的重要參數(shù)[21]，本實(shí)驗(yàn)中芥子堿硫氰酸鹽的AUC明顯低于槲皮素、山柰酚，這可能與芥子堿硫氰酸鹽在體內(nèi)清除率高、分布容積大而降低了體內(nèi)的暴露量有關(guān)。

本研究建立了HPLC-MS/MS法測(cè)定芪藶強(qiáng)心膠囊臣藥葶藶子中主要成分芥子堿硫氰酸鹽、槲皮素、山柰酚在大鼠體內(nèi)的血藥濃度，并闡釋各效應(yīng)成分的體內(nèi)過(guò)程，可為進(jìn)一步確定芪藶強(qiáng)心膠囊的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。