張輝 周文平 劉剛瓊 張文靜 張金盈

1鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科（鄭州450052）；2鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院心內(nèi)科（鄭州450052）

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）進(jìn)程中存在YKL-40 高表達(dá)［1］。本研究探討YKL-40 RNA 干擾（RNA interference，RNAi）對(duì)載脂蛋白E 基因敲除小鼠（apolipoprotein E-deficient mice，apoE-/-小鼠）頸動(dòng)脈AS 斑塊的影響。

1 材料與方法

1.1 材料YKL-40 shRNA慢病毒載體目的基因序列為：5′-GCTCCAGTGCTGCTCTGCATA-3′。12 周齡雄性apoE-/-小鼠72 只，購(gòu)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部，均采用高脂喂養(yǎng)。Trizol 試劑購(gòu)自美國(guó)GIBCO 公司；油紅O、單核細(xì)胞趨化因子-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）及脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2（lipoprotein associated phospholipase A2，Lp-PLA2）等ELISA 試劑盒購(gòu)自鄭州森斯科貿(mào)生物制品有限公司。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)鄭州大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2.1 小鼠AS 模型的建立及動(dòng)物分組本研究采用左頸總動(dòng)脈縮窄性套管法誘導(dǎo)AS 形成并建立apoE-/-小鼠AS 模型［2-3］：麻醉滿意后apoE-/-小鼠頸正中切口，分離左頸總動(dòng)脈，在動(dòng)脈上套扎長(zhǎng)3 mm 內(nèi)徑0.3 mm 的硅膠套管并固定［2-3］，術(shù)后縫合切口，繼續(xù)高脂喂養(yǎng)。8 周后apoE-/-小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（n = 24），病毒陰性對(duì)照（negative control，NC，n = 24）組和觀察組（n = 24），再次分離左頸總動(dòng)脈，去除硅膠套管并分別局部滴注生理鹽水、陰性對(duì)照病毒（5 × 107TU）、YKL-40 RNA 干擾慢病毒（5×107TU）。6 周后收集斑塊制作6 μm冰凍切片采用HE 和油紅O 染色并進(jìn)行病理組織學(xué)分析。

1.2.2 血漿MCP-1、Lp-PLA2及血脂水平測(cè)定小鼠麻醉后取血，離心后取上層血漿檢測(cè)，測(cè)定Lp-PLA2、MCP-1、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、甘油三酯（triglyceride，TG）及總膽固醇（total cholesterol，TC）、水平。

1.2.3 組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)使用Image-Pro Plus 5.0圖像分析軟件對(duì)HE 染色及油紅O 染色切片進(jìn)行定量分析，檢測(cè)斑塊面積、纖維帽厚度及脂質(zhì)含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法本研究采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有計(jì)量資料以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，正態(tài)性檢驗(yàn)后進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），兩兩比較采用Student-Newman-Keuls（SNK）檢驗(yàn)，P ＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 各組間體質(zhì)量和LDL-C、HDL-C、TC 及TG水平比較對(duì)照組、NC 組與觀察組小鼠相比，體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），且沒有小鼠在慢病毒轉(zhuǎn)染后死亡，說明本實(shí)驗(yàn)以及慢病毒轉(zhuǎn)染是安全的。另外，各組間LDL-C、HDL-C、TC 及TG 水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05，表1）。

2.2 YKL-40 RNAi 對(duì)AS 斑塊形態(tài)及組分的影響對(duì)照組、NC 組與觀察組小鼠AS 斑塊纖維帽厚度分別為（9.14 ± 0.84）、（9.22 ± 0.91）、（13.15 ±1.21）μm，觀察組斑塊纖維帽厚度明顯高于對(duì)照組和NC組（P ＜0.05）。對(duì)照組、NC組與觀察組斑塊面積分別為（6.21 × 104）、（6.17 × 104）、（4.76 ×104）μm2，觀察組斑塊面積明顯低于對(duì)照組和NC 組（P ＜0.05）。對(duì)照組、NC 組與觀察組斑塊脂質(zhì)含量分別為30.14%、29.73%、22.95%，觀察組斑塊脂質(zhì)含量明顯低于對(duì)照組和NC 組（P ＜0.05，圖1）。對(duì)照組與NC 組相比脂質(zhì)含量、纖維帽厚度及斑塊面積均無顯著性差異，這表明觀察組得出的有益作用并非由病毒侵染所導(dǎo)致的非特異性免疫應(yīng)答所引起，進(jìn)一步證實(shí)了RNAi 的干擾有效。

表1 各組小鼠體質(zhì)量和血脂水平Tab.1 Body weight and plasma lipid levels among all groups ±s

表1 各組小鼠體質(zhì)量和血脂水平Tab.1 Body weight and plasma lipid levels among all groups ±s

注：組間比較采用方差分析，*P＞0.05

體質(zhì)量（g）LDL-C（mmol/L）HDL-C（mmol/L）TC（mmol/L）TG（mmol/L）對(duì)照組28.44±3.73 29.11±4.68 3.05±0.52 25.74±2.58 2.69±0.82 NC 組29.32±3.71*29.85±4.97*3.23±0.51*25.22±2.44*2.62±0.79*觀察組29.15±3.66*30.32±4.56*3.17±0.58*25.50±2.51*2.65±0.88*

2.3 YKL-40 RNAi 對(duì)血漿炎癥因子Lp-PLA2及MCP-1 水平的影響與對(duì)照組和NC 組小鼠相比，觀察組血漿炎癥因子Lp-PLA2及MCP-1 水平明顯降低，這說明YKL-40 RNAi 治療可降低炎癥因子Lp-PLA2及MCP-1 的水平（P ＜0.05）；另外對(duì)照組與NC 組相比，Lp-PLA2及MCP-1 水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表2）。

表2 各組組炎癥因子水平Tab.2 The expression of inflammatory cytokines in the each group ±s

表2 各組組炎癥因子水平Tab.2 The expression of inflammatory cytokines in the each group ±s

注：組間方差分析，*P ＜0.05；與對(duì)照組相比，▲P ＞0.05

Lp-PLA2（μg/L）MCP-1（μg/L）對(duì)照組131.28±14.55 13.56±1.38 NC 組133.68±14.21▲13.99±1.43▲觀察組79.88±9.26*8.62±0.95*

3 討論

AS 是一個(gè)復(fù)雜的的病理生理學(xué)進(jìn)程，在冠心病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。目前普遍認(rèn)為AS 是一種炎癥性疾?。?-4］，YKL-40是一種新的AS 危險(xiǎn)因子和炎癥的標(biāo)記物，可由斑塊局部活化的巨噬細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌［5-7］。AS 進(jìn)程中存在YKL-40 高表達(dá)，YKL-40 在AS 的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［8-9］。研究發(fā)現(xiàn)YKL-40 與內(nèi)皮功能紊亂及斑塊不穩(wěn)定性相關(guān)［9］。YKL-40 在炎癥、細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)、細(xì)胞增殖及血管發(fā)生中發(fā)揮重要作用［8］。研究［8-9］顯示，YKL-40 水平升高與冠狀動(dòng)脈及腦血管事件的發(fā)生相關(guān)，且YKL-40 水平增加與冠狀動(dòng)脈病變進(jìn)展相關(guān)。

圖1 對(duì)照組、NC 組與觀察組的斑塊形態(tài)學(xué)分析Fig.1 Plaque morphology of the control，NC and treatment groups

抑制AS 炎癥因子及基因治療是未來治療AS的新途徑［2］。已證實(shí)RNA 干擾可以高效特異性地抑制靶基因的表達(dá)［3］。慢病毒載體具有轉(zhuǎn)染效率高，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，安全、有效等特點(diǎn)［3］。本研究首先構(gòu)建apoE-/-小鼠AS 模型，然后合成針對(duì)YKL-40的慢病毒載體并對(duì)apoE-/-小鼠頸動(dòng)脈斑塊進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染，降低YKL-40 的表達(dá)，觀察YKL-40 RNA干擾對(duì)病變局部脂質(zhì)含量、纖維帽厚度以及斑塊面積的影響，并進(jìn)一步觀察Lp-PLA2以及MCP-1 等炎癥基因表達(dá)水平的變化。

本研究表明，YKL-40 RNA 干擾可以降低apoE-/-小鼠促炎因子Lp-PLA2及MCP-1 的水平，降低斑塊脂質(zhì)含量，減少斑塊面積并增加纖維帽厚度，這說明YKL-40 RNA 干擾后AS 斑塊穩(wěn)定性升高。研究［10］表明不穩(wěn)定斑塊是主要心血管事件及腦卒事件發(fā)生的主要原因。本研究表明，YKL-40 RNA 干擾可以降低炎癥基因的表達(dá)，增高斑塊纖維帽厚度，降低斑塊脂質(zhì)含量，小鼠頸動(dòng)脈斑塊穩(wěn)定性升高，易損性降低，進(jìn)一步證實(shí)了YKL-40 RNA 干擾治療AS 的有效性。

炎癥反應(yīng)在AS 的發(fā)生發(fā)展以及斑塊失穩(wěn)定和破裂過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Lp-PLA2及MCP-1是AS 進(jìn)程中重要的炎癥因子，Lp-PLA2可水解氧化磷脂生成溶血磷脂膽堿和氧化非酯化脂肪酸［11］，這些水解產(chǎn)物都具有強(qiáng)大的促炎作用和致AS 作用，可促進(jìn)引起單核細(xì)胞聚集、內(nèi)皮功能紊亂并促進(jìn)動(dòng)脈管壁以及斑塊局部慢性炎癥的發(fā)生和發(fā)展［12-13］。故Lp-PLA2是可導(dǎo)致斑塊失穩(wěn)定，斑塊破裂和臨床心腦血管事件的發(fā)生［14-15］。MCP-1 可促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞在AS 斑塊部位聚集，并介導(dǎo)對(duì)單核細(xì)胞及炎癥細(xì)胞的遷移和活化。因此，本研究結(jié)果進(jìn)一步表明，YKL-40 RNA 干擾通過降低Lp-PLA2 及MCP-1 等炎癥因子的水平，降低斑塊脂質(zhì)含量并降低斑塊易損性。

此外，筆者排除了本研究的有益結(jié)果來自于病毒非特異性免疫反應(yīng)的可能性，因?yàn)閷?duì)照組與NC 組相比，各參數(shù)間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。AS 過程中YKL-40 等炎癥因子表達(dá)增加。抑制AS 的炎癥因子是未來治療AS 的新途徑［2，15］。因此，慢病毒介導(dǎo)的YKL-40 RNA 干擾提供了一種安全，有效的治療AS 的方法。

本研究結(jié)果表明，YKL-40 RNA 干擾可降低小鼠YKL-40 水平，進(jìn)而降低Lp-PLA2及MCP-1 等炎癥因子水平，進(jìn)而降低斑塊脂質(zhì)含量并降低斑塊易損性，這些有益作用是獨(dú)立于降脂作用之外的。因此，慢病毒介導(dǎo)的YKL-40 RNA 干擾提供了一個(gè)治療AS 的新途徑。