肖忠盛 龍泓 丁成明 肖友忠

南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院1胃腸外科，2肝膽外科（湖南衡陽(yáng)421001）

結(jié)直腸癌作為最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，已經(jīng)成為引起成人死亡的第3 大癌癥，嚴(yán)重威脅人類(lèi)生命健康，在美國(guó)每年約有14 萬(wàn)人被診斷為結(jié)直腸癌，病死率高達(dá)36%左右［1］。而在我國(guó)，發(fā)病率同樣逐年遞增，結(jié)直腸癌發(fā)病初期為腺瘤性息肉，進(jìn)而發(fā)展成為腺瘤，最終形成惡性腫瘤，其發(fā)生展是一個(gè)多階段、多因素的過(guò)程，但其機(jī)制仍不完全明了。相比人類(lèi)和哺乳動(dòng)物的正常細(xì)胞在有氧條件下優(yōu)先進(jìn)行有氧氧化供能，癌細(xì)胞不論是在有氧還是無(wú)氧條件均以糖酵解途徑供能，這種獨(dú)特的能量代謝方式使得癌細(xì)胞在缺氧條件下更耐受［2］，因此糖酵解也常常作為衡量抗腫瘤效應(yīng)的重要指標(biāo)。該特性與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲密切相關(guān)，但其對(duì)結(jié)直腸癌作用的機(jī)制仍未明確，因此了解結(jié)直腸癌中糖酵解的調(diào)控機(jī)制，對(duì)防治結(jié)直腸癌將具有重要意義。白藜蘆醇（resveratrol，Res）最早發(fā)現(xiàn)于1939年，廣泛存在于葡萄、虎杖、花生、桑椹等植物中［3］。研究表明白藜蘆醇在體內(nèi)或體外對(duì)于肺癌、肝癌、乳腺癌等多種癌癥具有顯著抑制效應(yīng)，阻礙癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡［3-4］。同時(shí)，mTOR 信號(hào)通路作為腫瘤研究中常見(jiàn)信號(hào)通路，其過(guò)度激活可引起多種癌細(xì)胞增殖［5-6］，劉添文等［7］通過(guò)下調(diào)mir-143 的表達(dá)，證明其可以通過(guò)調(diào)控mTOR 通路促進(jìn)大腸癌的發(fā)生和發(fā)展。但白藜蘆醇是否可能通過(guò)mTOR 信號(hào)通路調(diào)控結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展暫未見(jiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道。本研究探討白藜蘆醇對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞（LoVo 細(xì)胞）增殖及糖酵解的影響，并分析這種作用與mTOR 信號(hào)通路的可能關(guān)系，為白藜蘆醇作為一種單獨(dú)或聯(lián)合使用的抗結(jié)直腸癌藥物提供潛在可能。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料人結(jié)直腸癌細(xì)胞株LoVo，購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏中心（American TypeCulture Collection，ATCC）。F12K 培養(yǎng)基培（美國(guó)Gibco 公司）；白藜蘆醇（≥99%）、mTOR 抑制劑Rapamycin（美國(guó)Selleck Chemicals 公司）；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）（美國(guó)Sigma 公司）；Cell MeterTM2-NBDG 葡萄糖攝取檢測(cè)試劑盒（美國(guó)AAT Bioquest 公司）；乳酸（LD）檢測(cè)試劑盒、ATP 含量測(cè)定試劑盒均（南京建成生物工程研究所）；己糖激酶（HK）活性檢測(cè)試劑盒、丙酮酸激酶（PK）活性檢測(cè)試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；mTOR、p-mTOR（Ser2448）和GAPDH 抗體均（美國(guó)Santacruze 公司）；BCA 蛋白定量檢測(cè)試劑盒、ECL 檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Thermo 公司）

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)人結(jié)直腸癌細(xì)胞株LoVo 常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素雙抗溶液的F12K 培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱，選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增值將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LoVo 細(xì)胞懸液調(diào)整濃度至1 × 104個(gè)/mL 后，接種到96 孔培養(yǎng)板，每孔200 μL，細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度的白藜蘆醇（0.0125、0.025、0.05、0.1、0.2 mmol/L）處理細(xì)胞。每個(gè)濃度設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置不加細(xì)胞的零孔和不加白藜蘆醇的陰性對(duì)照孔，分別培養(yǎng)24 h，48 h 和72 h。采用MTT 試劑盒檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖抑制情況。

1.2.3 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞培養(yǎng)至60% ～70%融合度時(shí)，分別采用0.08 mmol/L 白藜蘆醇和10 nmol/L Rapamycin 處理48 h，并設(shè)置對(duì)照組。用0.25% 胰酶消化成單細(xì)胞懸液，按1 000 個(gè)細(xì)胞/孔接種60 mm 細(xì)胞培養(yǎng)皿中，于37℃5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，3 天更換一次培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞10 d，實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞克隆形成情況。

1.2.4 葡萄糖攝取能力及乳酸水平檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞培養(yǎng)至60% ～70%融合度時(shí)，分別采用0.08 mmol/L 白藜蘆醇和10 nM Rapamycin 處理48 h，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組。細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后，（1）按照葡萄糖攝取檢測(cè)試劑盒方法測(cè)定不同處理組葡萄糖攝取量；（2）乳酸含量測(cè)定：收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清，采用乳酸含量檢測(cè)試劑盒測(cè)定不同處理后乳酸含量。

1.2.5 細(xì)胞ATP 含量檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞培養(yǎng)至60% ～70%融合度時(shí)，分別采用0.08 mmol/L 白藜蘆醇和10 nmol/L Rapamycin 處理48 h，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組。0.25% 胰酶消化細(xì)胞收集于離心管中，10 000 r/min 離心5 min，棄上清，每管加入裂解液100 μL。待細(xì)胞充分裂解后，4 ℃，12 000 r/min 離心10 min，收集細(xì)胞上清，采用ATP 含量測(cè)定試劑盒檢測(cè)不同處理組ATP 含量。

1.2.6 糖酵解酶關(guān)鍵酶酶活水平測(cè)定己糖激酶和丙酮酸激酶活性檢測(cè)：將對(duì)數(shù)期的細(xì)胞用0.25% 胰酶消化成單細(xì)胞懸液，以2 × 105個(gè)細(xì)胞/孔接種至12 孔板中，貼壁后分別加入0.08 mmol/L 白藜蘆醇和10 nmol/L Rapamycin 處理48 h，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，培養(yǎng)48 h 后，收集細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照500 萬(wàn)細(xì)胞加入1 mL提取液，超聲波破碎細(xì)胞（冰浴，功率20%，超聲3 s，間隔10 s，重復(fù)5 次）；8 000 g 4℃離心10 min，收集細(xì)胞上清，采用己糖激酶及丙酮酸激酶活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)不同處理組激酶活性水平。

1.2.7 Western Blot 檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)p-mTOR 和mTOR 蛋白表達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞中加入0.08 mmol/L 白藜蘆醇和10 nmol/L mTOR 抑制劑Rapamycin 處理48 h 后，提取蛋白，使用BCA 試劑盒進(jìn)行蛋白定量；制備PAGE 膠并上樣，進(jìn)行電泳分離，電轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上5%脫脂牛奶室溫封閉1 h 分別加入mTOR 抗體（1∶1 000）、p-mTOR 抗體（1∶1000）和GAPDH 抗體（1∶1 000），4 ℃孵育過(guò)夜；TBST 洗滌3 次，按照1∶10 000 稀釋HRP 標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育1 h，TBST 洗滌3 次，ChemiDoc 成像系統(tǒng)（BioRad）進(jìn)行ECL 曝光成像，分析其灰度值，以GAPDH 作為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)按照均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行正態(tài)性分析和方差齊性檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較用單因素方差分析，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇對(duì)LoVo 細(xì)胞增值的影響采用不同濃度的白藜蘆醇（0.0125、0.025、0.05、0.1、0.2 mmol/L）分別處理LoVo 細(xì)胞24、48 和72 h。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著白藜蘆醇濃度的增加，白藜蘆醇對(duì)LoVo 細(xì)胞增殖抑制率均逐漸上升，均具有一定的時(shí)間和劑量依賴(lài)性，如表1 所示。白藜蘆醇作用于LoVo 細(xì)胞24、48、72 h 的半數(shù)抑制濃度分別為0.17、0.08、0.05 mmol/L。后續(xù)選擇0.08 mmol/L白藜蘆醇作用48 h 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

表1 白藜蘆醇對(duì)LoVo 細(xì)胞增殖抑制率的影響作用Tab.1 Effect of Res on proliferation inhibition rate of LoVo Cell±s，%

表1 白藜蘆醇對(duì)LoVo 細(xì)胞增殖抑制率的影響作用Tab.1 Effect of Res on proliferation inhibition rate of LoVo Cell±s，%

注：*表示與對(duì)照組相比，P ＜0.05

組別對(duì)照組白藜蘆醇組濃度（mmol/L）0 0.0125 0.025 0.05 0.1 0.2 24 h 1.05±0.12 4.54±1.12*11.74±1.65*25.87±2.73*37.22±5.33*58.73±5.75*48 h 1.35±0.17 8.37±1.24*21.29±3.87*38.77±5.53*48.72±6.93*61.24±5.87*72 h 1.51±0.10 9.91±1.85*28.47±5.62*49.67±6.41*58.78±7.85*69.72±8.29*

2.2 白藜蘆醇對(duì)LoVo 細(xì)胞克隆形成能力的影響平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組、白藜蘆醇組和Rapamycin 組細(xì)胞克隆形成率分別為（57.23 ±4.23）%、（17.36 ± 1.39）%和（18.67 ± 1.57）%。與對(duì)照組比較，白藜蘆醇組和Rapamycin 組細(xì)胞克隆形成率顯著減少（P ＜0.05）；白藜蘆醇組與Rapamycin組比較，細(xì)胞克隆形成率無(wú)顯著性差異（P ＞0.05）。見(jiàn)圖1。

2.3 白藜蘆醇對(duì)LoVo 細(xì)胞葡萄糖攝取能力及乳酸水平的影響與對(duì)照組相比，白藜蘆醇和Rapamycin 作用后，LoVo 細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取能力均顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.5）。同時(shí)，與對(duì)照組相比，經(jīng)過(guò)白藜蘆醇和Rapamycin 處理后，細(xì)胞上清中乳酸含量也顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。而白藜蘆醇組與Rapamycin 組比較，兩組間細(xì)胞葡萄糖攝取能力和乳酸水平無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。見(jiàn)圖2、3。

圖1 白藜蘆醇對(duì)LoVo 細(xì)胞克隆形成能力的影響Fig.1 The effect of Res on colony formation of LoVo cells

圖2 白藜蘆醇對(duì)LoVo 細(xì)胞葡萄糖攝取水平的影響Fig.2 The effect of Res on Glucose Uptake of LoVo cells

2.4 白藜蘆醇對(duì)LoVo 細(xì)胞中ATP 含量及糖酵解關(guān)鍵酶酶活的影響與對(duì)照組相比，LoVo 細(xì)胞經(jīng)白藜蘆醇和Rapamycin 處理后，細(xì)胞中的ATP 含量顯著降低（P＜0.05），而白藜蘆醇組與Rapamycin組比較無(wú)顯著性差異（P＞0.05）如圖4 所示。同時(shí)，白藜蘆醇組與Rapamycin 組細(xì)胞中的HK，PK活性也較對(duì)照組顯著降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖5。

2.5 白藜蘆醇對(duì)LoVo 細(xì)胞中p-mTOR 和mTOR蛋白表達(dá)的影響Western Blot 結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，白藜蘆醇組和Rapamycin 組細(xì)胞中的總mTOR 蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著變化（P ＞0.05），而p-mTOR 水平顯著降低（P＜0.05），且白藜蘆醇組和Rapamycin 組細(xì)胞中mTOR 蛋白和p-mTOR 水平無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。見(jiàn)圖6。

圖3 白藜蘆醇對(duì)LoVo 細(xì)胞上清乳酸含量的影響Fig.3 The effect of Res on the lactic acid production of LoVo cells supernate

圖4 白藜蘆醇對(duì)LoVo 細(xì)胞ATP 生成量的影響Fig.4 The effect of Res on ATP production of LoVo cells

圖5 白藜蘆醇對(duì)LoVo 細(xì)胞丙酮酸激酶及己糖激酶活性的影響Fig.5 The effect of Res on activity of HK and PK of the LoVo cells

3 討論

圖6 白藜蘆醇對(duì)LoVo 細(xì)胞mTOR 和p-mTOR 蛋白表達(dá)水平的影響Fig.6 The effect of Res on the expression of mTOR and p-mTOR of the LoVo cells

結(jié)腸癌是一種臨床上常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病率和致死率均較高，盡管目前在針對(duì)結(jié)腸癌的診療上已經(jīng)取得較大進(jìn)展，但臨床預(yù)后情況并不樂(lè)觀，迫切需要新的治療方法的出現(xiàn)。白藜蘆醇是一種天然的多酚類(lèi)化合物，主要來(lái)源于葡萄、花生、桑葚等植物。本研究采用MTT 和平板克隆實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能顯著抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo的增殖作用和細(xì)胞克隆形成能力。王靜宇等［8］發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116 的增殖具有明顯抑制作用，與本研究結(jié)果一致，白藜蘆醇對(duì)結(jié)直腸癌具有明顯的抗腫瘤作用。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展離不開(kāi)能量的供應(yīng)，而糖酵解途徑是腫瘤細(xì)胞的主要供能方式，即使是在氧氣供應(yīng)充足的情況下也優(yōu)先進(jìn)行糖酵解，而非線(xiàn)粒體的氧化磷酸化，這種異常代謝現(xiàn)象被稱(chēng)為有氧糖酵解即Warburg 效應(yīng)。HK 作為糖酵解途徑中第一個(gè)限速酶，在鼻咽癌、乳腺癌等惡性腫瘤細(xì)胞中活性較高［9］。PATRA 等［10］發(fā)現(xiàn)抑制HK 活性可降低有氧糖酵解水平，使癌細(xì)胞代謝方式由有氧糖酵解轉(zhuǎn)變?yōu)檠趸姿峄?。Warburg 效應(yīng)的研究中，同樣發(fā)現(xiàn)抑制PK 能促進(jìn)有氧氧化取代糖酵解，提高腫瘤放、化療效果［11］。因此Warburg 效應(yīng)已經(jīng)成為腫瘤的特征之一，但其發(fā)生機(jī)制一直得到不到合理解釋?zhuān)⑶叶鄶?shù)研究往往只是關(guān)注糖酵解途徑中的關(guān)鍵酶表達(dá)量，而沒(méi)能整理體認(rèn)識(shí)糖酵解途徑的研究機(jī)制。本研究不僅完成對(duì)Warburg 效應(yīng)中關(guān)鍵酶的檢測(cè)，還進(jìn)行了直接對(duì)糖酵解途徑中糖代謝和能量代謝的檢測(cè)，結(jié)果表明在白藜蘆醇藥物干預(yù)下，LOVO 細(xì)胞中HK、PK 活性顯著下調(diào)，并且明顯減少對(duì)葡萄糖的攝取和乳酸、ATP 的生成量，表明白藜蘆醇可以改變結(jié)直腸癌細(xì)胞中糖酵解途徑，而達(dá)到腫瘤抑制的作用。但HK、PK 等代謝酶除了發(fā)揮其本身的代謝功能外，是否在結(jié)直腸癌中也具備激酶的活性，有待進(jìn)一步研究。

mTOR 信號(hào)通路的過(guò)度活化普遍存在于腫瘤細(xì)胞中［12］。mTOR 的活化在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞代謝等生理病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用［13］。PARK 等［14］證實(shí)白藜蘆醇可以通過(guò)抑制mTOR 的表達(dá)而誘發(fā)乳腺癌細(xì)胞MCF-7 的自噬作用；王坦也證實(shí)白藜蘆醇可以抑制人肝癌SMMC-7721 細(xì)胞增殖并降低mTOR 蛋白磷酸化水平［15］。本研究中，LoVo 細(xì)胞受到白藜蘆醇的干預(yù)作用后，mTOR 總蛋白的表達(dá)量不變，而其磷酸化水平發(fā)生顯著下調(diào)，抑制作用與mTOR 抑制劑一致，與之前研究結(jié)果一致，表明白藜蘆醇對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的抑制劑作用可能是通過(guò)mTOR 信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)。而HOU 等［16］能過(guò)大鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可以上調(diào)mTOR 的表達(dá)而影響神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，吳印華等也發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇通過(guò)激活mTOR/自噬抑制缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞損傷及凋亡作用［17］，與本研究結(jié)果不一致。白藜蘆醇在不同種類(lèi)的細(xì)胞中對(duì)mTOR 信號(hào)通路的調(diào)控作用不同，可能與腫瘤細(xì)胞特殊生長(zhǎng)發(fā)育有一定關(guān)系，但具體調(diào)控機(jī)制，還有待進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)。

如今結(jié)直腸癌的治療仍然以手術(shù)以術(shù)后的放化療等傳統(tǒng)手段為主，術(shù)后放化療產(chǎn)生的毒副作用以及耐藥甚至是多重耐藥的產(chǎn)生，均會(huì)導(dǎo)致患者生存和生活質(zhì)量的下降。白藜蘆醇作為一種低毒高效的植物提取物，其抗腫瘤的作用備受關(guān)注，明確其對(duì)結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的影響及對(duì)腫瘤細(xì)胞的分子調(diào)控機(jī)制，將對(duì)結(jié)直腸癌的診斷和治療具有重要意義。本研究為白藜蘆醇抑制結(jié)直腸癌的機(jī)制提供了新的思路，也為白藜蘆醇作為潛在的結(jié)直腸癌治療手段提供了依據(jù)。