陶文玉 陳郊麗 李曉進(jìn) 熊煜欣 洪超 王曉苓

1 云南省第二人民醫(yī)院（昆明650021）；2中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院和北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所（昆明650031）

糖尿病是一種內(nèi)分泌代謝性疾病，顯著的特點(diǎn)之一是體內(nèi)胰島素的降低，血糖的升高，影響糖尿病治療最主要的因素是安全有效藥物的缺乏［1］。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病與肝癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌和胃癌等腫瘤的發(fā)生存在密切關(guān)系。大量的研究表明，糖尿病患者罹患肝癌的風(fēng)險(xiǎn)顯著高于非糖尿病患者，而糖尿病一線治療藥物二甲雙胍和噻唑烷二酮類化合物（胰島素增敏劑）的使用能夠降低肝癌高風(fēng)險(xiǎn)人群罹患肝癌的幾率［2-4］。但在2 型糖尿病的二甲雙胍臨床治療中，部分患者出現(xiàn)諸如腹痛等胃腸道不良反應(yīng)，其中以乳酸酸中毒最為危險(xiǎn)［5-6］。而胰島素作為糖尿病治療的最有效藥物，同樣也存在一定的不足，胰島素可以直接通過影響胰島素樣生長因子受體（IGFs）參與腫瘤的發(fā)生［7］。因此尋找新穎的糖尿病治療靶點(diǎn)，并鑒定其分子機(jī)理，對于開發(fā)新的糖尿病治療藥物具有非常重要的意義，同時(shí)對于深入了解并干預(yù)糖尿病慢性并發(fā)癥，如肝損傷、腎臟損傷等，也具有廣闊的前景。本研究從糖尿病性肝病中的肝臟炎癥入手，通過分析多個(gè)糖尿病肝病動(dòng)物模型發(fā)現(xiàn)在糖尿病模型組中肝臟STC2 的表達(dá)顯著增加，而炎癥信號通路在糖尿病性肝病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的功能，那么STC2 是否通過調(diào)控炎癥信號通路參與糖尿病性肝病的發(fā)展？這對于深入分析并開發(fā)針對糖尿病性肝臟炎癥的干預(yù)方法具有非常重要的意義。

1 材料與方法

1.1 主要試劑RPMI1640 培養(yǎng)基，青霉素-鏈霉素（10 000 U/mL），脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine 2000，購自賽默飛世爾科技公司；胎牛血清（FBS）來自于Gibco；MTT（3-（4，5-Dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide）、G418 硫酸鹽和Dglucose 購買于Sigma 公司；RNA 提取試劑盒Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒來源于上海源葉生物技術(shù)公司；qPCR SYBR?定量試劑盒購自Takara 公司；引物序列根據(jù)NCBI 設(shè)計(jì)工具Primer-BLAST 設(shè)計(jì)，并由華大基因合成，經(jīng)PAGE 純化，引物序列如下，STC2（human）：上游引物5′-TCTTGTGAGATTCGGGGC TT-3′，下游引物5′-ACAGGTCGTGCTTGAGGTAG-3′；IL-6（human）：上游引物5′-ACAGCCACTCACCTCTTCAG-3′，下游引物5′-CCATCTTTTTCAGCCATCTTT-3′；TNFα（human）：上游引物5′-CCCGAGTGACAAGCCTGTAG-3′，下游引物5′- GATGGCAGAGAGGAGGTTGAC-3′；GAPDH（human）：上游引物5′-AGGTCGGAGTCAACGGATTT-3′，下游引物5′-ATCTCGCTCCTGGAAGATGG-3′；STC2（mouse）：上游引物5′-CTGGGCCAGTTTGTGACCC-3′，下游引物5′-ACGTCATGCAAATCCCATGTAAA-3′。STC2 抗體、β-actin 抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的鼠/兔二抗購買自Santa Cruz 公司；磷酸化p65（p-p65）抗體、p65 抗體、磷酸化STAT3（p-STAT3）抗體、STAT3 抗體來源于CST 公司。

1.2 細(xì)胞株正常肝細(xì)胞株LO2，來源于美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心（ATCC），傳代次數(shù)不高于5 次，保存于液氮中。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LO2 正常肝細(xì)胞培養(yǎng)在添加10% FBS 和100 U/mL 青霉素-鏈霉素試劑的RMPI 1640 培養(yǎng)基中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為5%CO2，溫度為37 ℃。在LO2 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（+）-STC2 質(zhì)粒采用lipofectamine 2000 脂質(zhì)體試劑，細(xì)胞密度約60%，更換低濃度血清的培養(yǎng)基（reduced serum opti-medium）。轉(zhuǎn)染操作方法按照說明書所述，轉(zhuǎn)染6 h 后吸去孔內(nèi)培養(yǎng)基，更換含10%FBS 的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.2 構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)STC2 的肝細(xì)胞株STC2全長cDNA 序列克隆到含有新霉素抗性基因的pcDNA3.1（+）載體中，使用lipofectamine 2000 脂質(zhì)體試劑轉(zhuǎn)染到LO2 細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染培養(yǎng)48 h 后，加入100 μg/mL 的G418 篩選濃度篩選陽性細(xì)胞，挑取3個(gè)單克隆細(xì)胞并進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。qRT-PCR 和Western Blot 分析細(xì)胞中STC2 表達(dá)水平，進(jìn)行鑒定。鑒定成功后，后續(xù)培養(yǎng)繼續(xù)維持25 μg/mL 的G418，防止抗性丟失。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測細(xì)胞經(jīng)過RNA提取試劑Trizol 裂解5 min，加入氯仿，充分混勻，室溫靜置分離。高速離心后，吸取上層溶液，經(jīng)異丙醇沉淀后，再用75%的乙醇溶液洗滌兩次，加入DEPC 水溶解，得到總RNA。得到的總RNA 經(jīng)過基因組DNA 去除劑處理，按照反轉(zhuǎn)錄試劑說明書進(jìn)行反應(yīng)。獲得的cDNA 產(chǎn)物測定濃度后，調(diào)整到100 ng/mL，用于熒光定量PCR 檢測。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 采用SYBR?Green 試劑盒，反應(yīng)體系配制比例參照說明書。熒光定量PCR 數(shù)據(jù)的顯示采用Ct 值，數(shù)據(jù)的分析采用2-ΔΔCt法。

1.3.4 Western Blot 檢測在不同時(shí)間梯度下，高糖處理LO2 細(xì)胞，冰PBS 溶液輕輕洗滌細(xì)胞一次，刮取細(xì)胞，加入RIPA 裂解液冰上裂解細(xì)胞20 min，15 000 g 離心10 min，吸取上清溶液到新的離心管中。加入loading buffer 后99 ℃處理10 min，立即置于冰上，即可進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳電轉(zhuǎn)。采用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，經(jīng)過TBST 溶液洗滌3 次后，4 ℃孵育一抗過夜。再次TBST 溶液搖床上洗滌3 次，每次10 min，室溫孵育二抗1 h，TBST 溶液充分洗滌3 次后，每次10 min，進(jìn)行ECL 化學(xué)發(fā)光檢測。蛋白表達(dá)水平的相對定量使用Image J 軟件進(jìn)行灰度密度值分析。

1.3.5 MTT 法檢測細(xì)胞增殖調(diào)整細(xì)胞懸浮液的細(xì)胞密度至5×104cells/mL，于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入100 μL 細(xì)胞懸浮液。培養(yǎng)過夜后，加入Dglucose 30 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，加入MTT 溶液，每孔加入50 μg 的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)3 h，小心移去孔內(nèi)培養(yǎng)基。每孔中加入100 μL 的DMSO 溶液，室溫振蕩5 min，充分溶解紫色結(jié)晶后，于酶標(biāo)儀490 nm 波長下測定吸光值。

1.3.6 差異基因GEO篩選高脂飲食喂養(yǎng)C57BL/6 小鼠21 周，誘導(dǎo)糖尿病相關(guān)模型，分析肝臟中基因表達(dá)變化，GEO 參考號為GSE24031，測序芯片平臺為GPL1261，分析了10 只正常飲食小鼠和8只高脂飲食誘導(dǎo)組，通過GEO 自帶的數(shù)據(jù)分析工具分析STC2 的相對表達(dá)變化。

1.3.7 鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)糖尿病肝病模型小鼠分析肝臟中STC2 的表達(dá)變化，STZ 的溶媒為1%的吐溫80 溶解于生理鹽水中，將含有0.02 mol/L的STZ 的誘導(dǎo)劑以100 mg/kg 的劑量尾靜脈注射C57BL/6 小鼠，小鼠全部選用10 周齡雄鼠，對照組注射相應(yīng)體積的溶媒溶液，對照組和誘導(dǎo)組小鼠數(shù)量均為8 只。誘導(dǎo)72 h 后，開始禁食過夜，測定空腹血糖，超過12 mmol/L 定義為糖尿病小鼠。而臨床治療中發(fā)現(xiàn)部分糖尿病患者表現(xiàn)出肝損傷等肝病表征，因此把糖尿病并發(fā)的肝損傷也稱之為糖尿病肝病，本研究通過檢測小鼠天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）等肝臟生化功能指標(biāo)，確定糖尿病肝病模型的成功構(gòu)建［8］。處死小鼠，解剖取肝臟，經(jīng)過冰冷PBS 溶液清洗后，加入液氮進(jìn)行研磨，加入RNA 提取試劑，進(jìn)行熒光定量PCR 操作。對比正常組小鼠，分析糖尿病誘導(dǎo)模型組小鼠肝臟中STC2 的表達(dá)水平變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法本文數(shù)據(jù)的處理均采用Graph-Pad Prism7 軟件進(jìn)行作圖和統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的表示以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的方式。兩組間比較采用Student′s t 檢驗(yàn)，P ＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 在糖尿病性肝病模型小鼠中STC2 的表達(dá)顯著增加通過分析高脂飲食（HFD）誘導(dǎo)的糖尿病模型小鼠中的肝組織基因水平變化，發(fā)現(xiàn)與正常飲食組（NFD）小鼠STC2 基因在糖尿病性肝病模型小鼠肝臟中顯著增加約10%（圖1A）。為了進(jìn)一步證實(shí)在糖尿病性肝病發(fā)病過程中STC2 基因的表達(dá)變化，通過STZ 尾靜脈注射誘導(dǎo)糖尿病肝病模型小鼠，通過分析小鼠肝臟生化指標(biāo)ALT、AST 確認(rèn)糖尿病肝病模型的成功建立（圖1C-D）。同時(shí)通過qRT-PCR 分析肝臟中STC2 的表達(dá)，同樣發(fā)現(xiàn)在糖尿病肝病模型小鼠肝臟中STC2 的表達(dá)水平顯著增加（P ＜0.01，圖1B）。

圖1 在高脂飲食和STZ 誘導(dǎo)糖尿病小鼠肝臟中STC2 表達(dá)顯著增加Fig.1 The expression of STC2 in the liver was elevated in HFD and STZ-induced diabetic disease model

2.2 高糖誘導(dǎo)肝細(xì)胞中STC2 表達(dá)，并促進(jìn)炎癥因子TNF-α 和IL-6 的表達(dá)通過體外高糖誘導(dǎo)處理正常肝細(xì)胞LO2，發(fā)現(xiàn)高糖能夠誘導(dǎo)STC2 蛋白表達(dá)增加，并且呈時(shí)間依賴性的關(guān)系（圖2AB），熒光定量PCR 結(jié)果也發(fā)現(xiàn)高糖能夠促進(jìn)STC2 的mRNA 表達(dá)上調(diào)（圖2C）。同時(shí)分析了高糖誘導(dǎo)下，炎癥因子TNF-α 和IL-6 的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)高糖在誘導(dǎo)STC2 表達(dá)的同時(shí)，也大量誘導(dǎo)促炎性因子TNF-α 和IL-6 的表達(dá)。這一結(jié)果說明，在高糖的刺激下，肝細(xì)胞存在炎性響應(yīng)反應(yīng)，并且STC2 的蛋白和mRNA 表達(dá)也被大量誘導(dǎo)表達(dá)。

圖2 高糖誘導(dǎo)肝細(xì)胞STC2 表達(dá)上調(diào)，并促進(jìn)促炎性因子TNF-α 和IL-6 的表達(dá)Fig.2 High glucose could induce upregulation of STC2 and enhanced the expression of pro-inflammatory factors TNF-α and IL-6

2.3 在高糖條件下，STC2 的表達(dá)與促炎性因子TNF-α 和IL-6 的表達(dá)存在正相關(guān)的關(guān)系通過皮爾森系數(shù)（Pearson ratio）分析STC2 與TNFα 的表達(dá)相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)在高糖刺激下，STC2 的表達(dá)與IL-6 的相關(guān)系數(shù)為0.748 8，95%置信區(qū)間為0.168 5 至0.943 7，由此可見，STC2 與IL-6 的表達(dá)存在較強(qiáng)的相關(guān)性（圖3A）。而STC2 與TNFα 的相關(guān)系數(shù)為0.968 4，95%置信區(qū)間為0.852 6 至0.993 5，這說明STC2 與TNFα 的表達(dá)存在非常強(qiáng)的表達(dá)相關(guān)性（圖3B）。

圖3 在高糖刺激下，肝細(xì)胞中STC2 的表達(dá)與IL-6 和TNF-α 存在正相關(guān)的關(guān)系Fig.3 Under the condition of high glucose，the expression of STC2 was positively correlated with IL-6 and TNF-α expression in the liver cells

2.4 成功構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)STC2 的肝細(xì)胞株在正常LO2 肝細(xì)胞中構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)STC2 的細(xì)胞株，通過G418 篩選，選取3 個(gè)細(xì)胞繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)，進(jìn)行Western Blot 檢測蛋白表達(dá)水平，并通過qRTPCR 檢測細(xì)胞中mRNA 的表達(dá)水平，從圖4 中可以看出過表達(dá)的三株細(xì)胞在蛋白水平和mRNA 水平都顯著高于對照組細(xì)胞，成功構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)STC2 的正常肝細(xì)胞。

2.5 高糖刺激下，STC2 促進(jìn)炎癥因子TNF-α 和IL-6 的表達(dá)通過過表達(dá)STC2 發(fā)現(xiàn)，在過表達(dá)STC2的LO2肝細(xì)胞中，高糖誘導(dǎo)的促炎性因子IL-6和TNF-α表達(dá)水平進(jìn)一步提高，并且在沒有高糖刺激下，在肝細(xì)胞中過表達(dá)STC2 也能夠一定程度上增強(qiáng)促炎性因子IL-6和TNF-α的表達(dá)（圖5）。

2.6 在肝細(xì)胞中過表達(dá)STC2，促進(jìn)STAT3 和NFκB 通路的激活通過在LO2 肝細(xì)胞中過表達(dá)STC2，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)STC2 能夠顯著激活NF-κB 和STAT3 信號通路（圖6），這些證據(jù)表明STC2 能夠通過激活NF-κB 和STAT3 信號通路，促進(jìn)促炎性因子IL-6 和TNF-α的表達(dá)。

圖4 構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)STC2 的LO2 肝細(xì)胞Fig.4 The construction of stable overexpressing STC2 in LO2 liver cells

圖5 在肝細(xì)胞中過表達(dá)STC2，能夠促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的TNF-α 和IL-6 表達(dá)Fig.5 Overexpression of STC2 enhanced high glucoseinduced the expression of TNF-α and IL-6 in LO2

圖6 在LO2細(xì)胞中過表達(dá)STC2，激活STAT3和NF-κB通路Fig.6 Overexpression of STC2 could activate the STAT3 and NF-κB pathway

2.7 高糖抑制正常肝細(xì)胞增殖，過表達(dá)STC2 進(jìn)一步增強(qiáng)高糖的抑制增殖作用通過MTT 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高糖刺激下，肝細(xì)胞的增殖能力顯著下降，而過表達(dá)STC2 能夠進(jìn)一步增強(qiáng)高糖所誘導(dǎo)的肝細(xì)胞增殖抑制能力。同樣值得注意的是，在無高糖應(yīng)激的情況下，過表達(dá)STC2 也能夠抑制肝細(xì)胞LO2 的增殖（圖7）。

圖7 高糖抑制肝細(xì)胞增殖，過表達(dá)STC2 能夠增強(qiáng)高糖抑制增殖作用Fig.7 High glucose inhibit the proliferation of liver cells，and overexpression of STC2 could enhance the inhibition of proliferation

3 討論

糖尿病性肝病是糖尿病的一種并發(fā)癥，糖尿病與肝病之間存在密切的聯(lián)系［10-11］。非酒精性脂肪肝就是糖尿病性肝病最顯著的病變［12］。而目前針對糖尿病的治療藥物種類很少，也存在多種副作用。因此開發(fā)新的糖尿病治療靶點(diǎn)，特別是針對糖尿病性肝病、糖尿病性腎病等并發(fā)癥，具有非常顯著的研究意義。

本研究主要針對糖尿病性肝病，篩選發(fā)現(xiàn)STC2 基因在STZ 誘導(dǎo)的糖尿病性肝病小鼠模型中表達(dá)水平顯著上升，說明STC2 基因可能參與糖尿病性肝病的發(fā)生過程，有可能在糖尿病的病理過程中發(fā)揮調(diào)控作用。為進(jìn)一步研究STC2 在糖尿病性肝病過程中潛在的分子功能，通過體外高糖刺激正常肝細(xì)胞LO2，發(fā)現(xiàn)高糖條件下，能夠呈時(shí)間依賴性的方式誘導(dǎo)STC2 的表達(dá)，而且高糖條件下，促炎性因子TNF-α 和IL-6 的表達(dá)也顯著增加，并且通過進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)STC2 與TNFα 和IL-6存在較強(qiáng)的正相關(guān)關(guān)系，這些證據(jù)表明STC2 在高糖誘導(dǎo)的肝細(xì)胞炎性反應(yīng)過程中存在某種調(diào)控關(guān)系。鑒于STC2 在高糖刺激的肝細(xì)胞炎性響應(yīng)過程中的作用，為進(jìn)一步深入研究STC2 在糖尿病性肝病中的功能，通過過表達(dá)STC2，發(fā)現(xiàn)在正常肝細(xì)胞LO2 中過表達(dá)STC2 能夠促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的促炎性反應(yīng)過程，而且在沒有高糖的應(yīng)激條件下，STC2 還能夠直接影響TNF-α 和IL-6 促炎性因子的表達(dá)。說明在高糖誘導(dǎo)的肝細(xì)胞促炎性過程中，高糖能夠引起肝細(xì)胞中TNF-α 和IL-6 的表達(dá)增加，而且高糖能夠促進(jìn)STC2 的表達(dá)，而STC2 又能夠直接通過影響促炎性因子TNF-α 和IL-6 的表達(dá)，形成這樣的促進(jìn)網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步說明STC2 在高糖刺激的肝細(xì)胞炎癥反應(yīng)過程中具有顯著的作用。

本研究通過分析炎癥信號通路，發(fā)現(xiàn)STC2 能夠激活STAT3 和NF-κB，而TNF-α 和IL-6 是STAT3和NF-κB 信號通路的重要的靶基因［13-15］，本研究表明STC2 能夠通過激活NF-κB 和STAT3 信號通路，促進(jìn)促炎性因子IL-6 和TNF-α 的表達(dá)，而介導(dǎo)高糖誘導(dǎo)的肝細(xì)胞炎癥反應(yīng)過程。目前的研究發(fā)現(xiàn)在高糖等代謝應(yīng)激條件下，炎癥免疫信號分子發(fā)揮重要的功能，這與本研究的結(jié)果是一致的，同時(shí)本研究也發(fā)現(xiàn)STC2 作為一個(gè)新穎的分子，不僅參與高糖應(yīng)激過程，還參與炎癥信號網(wǎng)絡(luò)，因此STC2 在代謝應(yīng)激和炎癥免疫交互調(diào)節(jié)網(wǎng)路中扮演重要的角色。高糖刺激的促炎性反應(yīng)過程，往往伴隨肝損傷［16］，為進(jìn)一步深入研究STC2 在高糖促炎性應(yīng)激過程中對肝細(xì)胞的功能，本研究通過肝細(xì)胞增殖功能實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)高糖誘導(dǎo)的STC2 能夠促進(jìn)高糖應(yīng)激所引起的肝細(xì)胞增殖抑制功能，這進(jìn)一步說明STC2 不僅參與高糖所誘導(dǎo)的肝細(xì)胞炎癥反應(yīng)過程，而且還參與肝細(xì)胞的增殖功能調(diào)節(jié)中。本研究顯示STC2 在糖尿病肝病模型小鼠肝臟損傷中以及高糖誘導(dǎo)肝細(xì)胞炎癥反應(yīng)過程中都發(fā)揮重要的促進(jìn)作用，因此針對STC2 的抑制劑的開發(fā)，也具有廣闊的研究前景。綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)STC2 是一個(gè)潛在治療糖尿病性肝病的新穎靶標(biāo)，在肝細(xì)胞中，STC2 能夠通過激活STAT3 和NF-κB 通路促進(jìn)促炎性因子TNF-α 和IL-6 的表達(dá)，并且STC2 還參與肝細(xì)胞的增殖生理功能中，為深入了解糖尿病性肝病的發(fā)病機(jī)理和研究干預(yù)策略提供了新的思路。