周曉娜 殷稅香 陳佳 方華 張偉晶 林潔如 章放香

1貴州省人民醫(yī)院麻醉科（貴陽550002）；2安順市西秀區(qū)人民醫(yī)院麻醉科（貴州安順561000）

圍術(shù)期神經(jīng)認(rèn)知障礙（PND）是一種在麻醉與手術(shù)后通過神經(jīng)心理學(xué)測試認(rèn)知功能的疾病，其很難區(qū)別是因?yàn)槁樽砗笫中g(shù)引起還是單純麻醉引起的，主要表現(xiàn)為思維輕度的紊亂，如言語的記憶、視覺的記憶、語言理解、注意力、集中力等［1］。隨著醫(yī)療科技的發(fā)展，手術(shù)適應(yīng)癥的不斷拓寬，越來越多的老年人需要采取手術(shù)治療，但隨之而來的PND 高發(fā)病率成為一個(gè)亟待解決的問題。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是長度大于200 個(gè)核苷酸的非編碼RNA，其在表觀遺傳調(diào)控和細(xì)胞周期調(diào)控等眾多生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用［2］。BACE1的反義鏈轉(zhuǎn)錄形成lncBACE1-AS，其可與BACE1 mRNA形成雙鏈結(jié)構(gòu)復(fù)合物，避免了BACE1 mRNA 被核酸酶降解，增加BACE1 mRNA 穩(wěn)定性。有研究顯示lncRNA BACE1-AS 通過NF-KB 調(diào)節(jié)使β 淀粉樣蛋白（Aβ）在腦組織內(nèi)沉積［3］。右美托咪定是一種高選擇性α2-腎上腺素能受體的激動(dòng)劑，可通過抑制兒茶酚胺的分泌和釋放，抑制外科手術(shù)的應(yīng)激反應(yīng)［4］。研究表明，右美托咪定可通過下調(diào)炎性因子的表達(dá)及Aβ 的水平從而降低老年患者PND 的發(fā)生率［5］。但右美托咪定是否通過改變lncRNA BACE1-AS 從而改善老年患者術(shù)期神經(jīng)認(rèn)知障礙國內(nèi)外尚無相關(guān)研究，因此，本實(shí)驗(yàn)旨在探討右美托咪定能否通過調(diào)控海馬lncBACE1-AS 改善老齡大鼠PND，為臨床患者PND 治療提供新的治療措施。

1 材料與方法

1.1 材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的應(yīng)用及實(shí)驗(yàn)程序得到貴州省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)用管理委員會(huì)同意，由重慶第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供研究動(dòng)物［許可證號(hào)：SCXK（渝）2012-0005］，健康清潔級(jí)雄性SD 大鼠180 只，18月齡，體質(zhì)量400～540 g，采用隨機(jī)數(shù)字表法將研究動(dòng)物分為5 組（n = 36）：對照組（C 組）、假手術(shù)組（D 組）、手術(shù)組（O 組）、生理鹽水組（S 組）、右美托咪定組（Y組）。C 組不給予任何處理，D 組腹腔麻醉后切皮但不實(shí)施手術(shù)，O 組給予同樣的麻醉后行脾切除術(shù)，Y 組給予同樣的麻醉后，于切除脾臟前5 min腹腔注射50 μg/kg 右美托咪定；S 組腹腔注射等量生理鹽水。于術(shù)后1、3、7 d 水迷宮測試結(jié)束后處死各組大鼠。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備參照文獻(xiàn)［6］實(shí)施腹部手術(shù)制備大鼠PND 模型，大鼠腹腔麻醉后，待翻正反射消失將大鼠仰臥位固定，在大鼠肋緣下腹中線左旁開1 cm 消毒后切開1.5～2.0 cm 切口，進(jìn)入腹腔游離脾臟，在脾蒂遠(yuǎn)端根部用3 號(hào)絲線結(jié)扎脾動(dòng)脈、靜脈，完全摘除脾臟并確定無殘余脾組織。徹底止血后用碘伏消毒傷口，用0 號(hào)線逐層關(guān)腹。術(shù)畢腹腔內(nèi)給予青霉素預(yù)防傷口感染，縫合切口，依次縫合腹膜、肌肉和皮膚，用無菌敷料貼覆蓋，膠布固定，大鼠蘇醒后放回鼠籠各自飼養(yǎng)，待用。

1.2.2 Morris 水迷宮測試該實(shí)驗(yàn)用于測量大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力。訓(xùn)練大鼠使用游泳池外的一組固定線索找到一個(gè)水下合并平臺(tái)。大鼠連續(xù)5 d 每天接受4 次訓(xùn)練試驗(yàn)。在每次實(shí)驗(yàn)中，老鼠被溫和地放置在面對迷宮墻壁的水中，位置是四等距的起始位置之一（北、南、東或西）。定位航行實(shí)驗(yàn)于建模前一周進(jìn)行，在安靜暗室內(nèi)，大鼠在平臺(tái)上適應(yīng)30 s，然后從4 個(gè)不同象限將大鼠面向池壁放入池內(nèi)，游泳時(shí)限設(shè)置為60 s，大鼠入水后至找到平臺(tái)所用的時(shí)間，即為逃避潛伏期（電腦自動(dòng)記錄）。同時(shí)測定大鼠2 min在水迷宮中游泳路徑。測試完成后各組大鼠進(jìn)行相應(yīng)處理。

1.2.3 HE 染色觀察腦組織病理學(xué)變化于術(shù)后1 d 水迷宮測試結(jié)束后，每組隨機(jī)選取3 只大鼠，麻醉后迅速置于冰上斷頭，腦組織浸泡于4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中固定過夜。常規(guī)酒精脫水、石蠟包埋。在大鼠海馬齒狀回平面連續(xù)冠狀切片，片厚5 μm，貼片后常規(guī)脫蠟水化，蘇木精-伊紅染色，光鏡下觀察各組大鼠海馬CA3 區(qū)腦組織病理學(xué)變化。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法測定lncRNA BACE1-AS 和BACE1mRNA 的表達(dá)于術(shù)后1、3、7 d 水迷宮測試結(jié)束后隨機(jī)取11 只大鼠，分離海馬組織，-80 ℃冰箱保存。海馬置于玻璃勻漿器中，加入1 mL Trizol 進(jìn)行研磨，充分研磨后倒入1.5 mL EP 管，向其中加入200 μL 三氯甲烷，劇烈震蕩15 s后室溫靜置2～3 min，12 000 轉(zhuǎn)/min，離心半徑為8 cm，離心15 min，取上清，加入等量異丙醇上下顛倒混勻，12 000 轉(zhuǎn)/min，離心半徑為8 cm，離心10 min，棄上清，加入1 mL 無水乙醇，12 000 轉(zhuǎn)/min，離心半徑為8 cm，離心5 min，棄上清，加入40 μL DEPC 水充分混勻后即為總RNA，進(jìn)行RNA樣品的純度、濃度和完整性鑒定；應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo 公司，美國）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，以總RNA 為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，引物設(shè)計(jì)：lncRNA BACE1-AS 上游引物：5′-CCTCCACCGTCCCGAGTT-3′，下游引物：5′-AGATGAAGGAACTGAGGC-3′；BACE1 mRNA 上游引物：5′-TGTTGGTCAGGCTGGTCT-3′，下游引物：5′-CGCGTACAACTATGACAAGAGC- 3′；β-actin 為內(nèi)參照物。RT-PCR 采用RT-PCR 試劑盒（北京天根公司），反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性20 s，56 ℃退火20 s，75 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)，75 ℃延伸7 min，結(jié)束反應(yīng)。取10 μL PCR產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠電泳，通過Image-pro plus 6.0軟件（Media Cybernetics 公司，美國）分析積分光度密度值反映lncRNA BACE1-AS 和BACE1mRNA 的相對表達(dá)水平。

1.2.5 蛋白印跡法（Western-blot）檢測Aβ、APP及BACE-1的表達(dá)測定蛋白濃度，加入5×上樣緩沖液100 ℃變性5 min。-20 ℃凍存電泳完畢將膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜（Millipore 公司，美國）上，然后用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，取出膜，于搖床上用TBST 洗膜5 min × 3 次。孵育袋中加入封閉液稀釋的兔多克隆抗體（稀釋度1∶1 000，Biorbyt公司，英國）、兔HO-1 多克隆抗體（稀釋度1∶800，Santa Cruz 公司，美國）、兔NQO1 多克隆抗體（稀釋度1∶1 000，Biorbyt 公司，英國）、β-actin（稀釋度1∶2 000，Santa Cruz 公司，美國），4℃孵育過夜。TBST 洗膜5 min×3 次，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（稀釋度1∶2 000，Jackson 公司，美國）室溫孵育2 h。TBST 洗膜15 min × 5 次。膜于化學(xué)發(fā)光檢測試劑（試劑A∶試劑B=1∶1）反應(yīng)2 min，取出膜，甩去多余的液體，用保鮮膜包好PVDF 膜。暗室中用X 膠片感光、顯影、定影。蛋白條帶灰度的定量分析運(yùn)用凝膠圖像Image J 軟件（NIH 公司，美國）分析目的蛋白條帶灰度值，以其與內(nèi)參β-actin 條帶灰度值的比值反映Aβ、APP 及BACE-1 的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，所有符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，多樣本均數(shù)間的兩兩比較的計(jì)量資料采用單因素方差分析，所有重復(fù)測量設(shè)計(jì)的計(jì)量資料采用重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，所得計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，P ＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Morris 水迷宮測試逃避潛伏期和游泳路徑與對照組、假手術(shù)組比較，模型組、生理鹽水組大鼠術(shù)后1、3、7 d 逃避潛伏期和游泳路徑延長，經(jīng)右美托咪定治療后大鼠術(shù)后1、3、7 d 逃避潛伏期和游泳路徑縮短，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。與術(shù)前比較，模型組、生理鹽水組和右美托咪定組術(shù)后逃避潛伏期和游泳路徑延長；術(shù)前各組、對照組與假手術(shù)組，模型組與生理鹽水組大鼠逃避潛伏期和游泳路徑比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 五組大鼠術(shù)后各時(shí)點(diǎn)逃避潛伏期和游泳路徑的比較Tab.1 Comparison of the escape latency and swimming distance at different points among five groups ±s

表1 五組大鼠術(shù)后各時(shí)點(diǎn)逃避潛伏期和游泳路徑的比較Tab.1 Comparison of the escape latency and swimming distance at different points among five groups ±s

注：與C 組、D 組相比，aP ＜0.05，與O、S 組相比，bP ＜0.05

組別C 組D 組0 組S 組Y 組逃避潛伏期（s）術(shù)前（n=36）18±6 18±8 18±6 18±9 18±7術(shù)后1 d（n=11）18±7 18±9 79±8a 77±9a 37±6ab術(shù)后3 d（n=11）18±7 18±5 82±9a 78±7a 35±7ab術(shù)后7 d（n=11）18±6 18±7 81±8a 79±8a 34±5ab游泳路徑（cm）術(shù)前（n=36）158±12 156±9 155±8 154±8 155±7術(shù)后1 d（n=11）155±11 154±10 769±29a 778±27a 367±22ab術(shù)后3（n=11）156±10 157±11 758±27a 767±26a 347±21ab術(shù)后7 d（n=11）1 567±9 158±9 728±26a 756±24a 317±20ab

2.2 觀察大鼠術(shù)后1 d 海馬組織CA3 區(qū)病理學(xué)變化HE 染色高倍鏡下觀察C 組、D 組大鼠海馬CA3 區(qū)錐體細(xì)胞線清晰，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞排列整齊又密集，胞核和胞質(zhì)清晰，細(xì)胞核又大又圓，呈均勻淡藍(lán)色或藍(lán)色，細(xì)胞核仁清晰，細(xì)胞質(zhì)豐富。O 組大鼠海馬CA3 區(qū)錐體細(xì)胞線不完整、細(xì)胞周圍出現(xiàn)間隙，且許多細(xì)胞胞體縮小、細(xì)胞胞漿呈淡紅色、細(xì)胞胞核固縮、深染，僅呈很淡的藍(lán)色甚至藍(lán)色消失。Y 組海馬CA3 區(qū)錐體細(xì)胞介于正常C 組和O 組之間，海馬內(nèi)核固縮現(xiàn)象明顯減輕，錐體細(xì)胞排列較O 組整齊，形態(tài)較O 組正常。O 組與S 組類似，見圖1。

圖1 各組大鼠海馬CA3 區(qū)HE 染色結(jié)果Fig.1 HE staining in the hippocampal CA3 region of rats in each group（×400）

2.3 RT-PCR 法測定大鼠術(shù)后各時(shí)點(diǎn)海馬lncRNA BACE1-AS 和BACE1 mRNA 的表達(dá)與C組、D 組比較比較，O 組、S 組和Y 組大鼠術(shù)后各時(shí)點(diǎn)海馬lncRNA BACE1-AS 和BACE1 mRNA的表達(dá)上調(diào)，與O 組，S 組比較，Y 組大鼠術(shù)后各時(shí)點(diǎn)海馬lncRNA BACE1-AS 和BACE1 mRNA的表達(dá)下調(diào)，P ＜0.05。C 組與D 組和O 組與S組大鼠術(shù)后各時(shí)點(diǎn)海馬lncRNA BACE1-AS 和BACE1 mRNA 的表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2 五組大鼠術(shù)后各時(shí)點(diǎn)海馬lncRNA BACE1-AS 和BACE1mRNA 的表達(dá)水平比較Tab.2 Comparison of the expression levels of lncRNA BACE1-AS and BACE1 mRNA at each point between the five groups ±s

表2 五組大鼠術(shù)后各時(shí)點(diǎn)海馬lncRNA BACE1-AS 和BACE1mRNA 的表達(dá)水平比較Tab.2 Comparison of the expression levels of lncRNA BACE1-AS and BACE1 mRNA at each point between the five groups ±s

注：與C 組、D 組比較，*P ＜0.05；與O 組、S 組比較，#P ＜0.05

組別C 組D 組0 組*S 組*Y 組*#lncRNA BACE1-AS術(shù)后1 d 0.56±0.04 0.57±0.03 1.95±0.13 1.87±0.12 1.15±0.08術(shù)后3 d 0.55±0.05 0.53±0.04 1.82±0.12 1.89±0.13 1.17±0.09術(shù)后7 d 0.54±0.04 0.55±0.05 1.85±0.14 1.83±0.12 1.12±0.07 BACE1 mRNA術(shù)后1 d 0.35±0.04 0.36±0.05 0.89±0.08 0.66±0.06 0.87±0.07術(shù)后3 d 0.36±0.05 0.35±0.04 0.91±0.09 0.64±0.07 0.86±0.08術(shù)后7 d 0.35±0.04 0.37±0.05 0.87±0.08 0.62±0.05 0.89±0.07

2.4 Western-blot 法測定大鼠術(shù)后各時(shí)點(diǎn)海馬Aβ、APP、BACE1 的表達(dá)與C 組、D 組比較比較，O 組、S 組和Y 組大鼠術(shù)后各時(shí)點(diǎn)海馬Aβ、APP、BACE1 的表達(dá)上調(diào)（P ＜0.05），與O 組，S 組比較，Y 組大鼠術(shù)后各時(shí)點(diǎn)海馬Aβ、APP、BACE1的表達(dá)下調(diào)（P ＜0.05）。C 組與D 組和O 組與S 組大鼠術(shù)后各時(shí)點(diǎn)海馬Aβ、APP、BACE1 的表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3，圖2。

3 討論

Morris 水迷宮是一種強(qiáng)迫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物尋找隱藏在水中平臺(tái)的一種實(shí)驗(yàn)，主要用于測試實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對空間位置感和方向感（空間定位）的學(xué)習(xí)記憶能力［7］。海馬是大腦中研究最透徹的結(jié)構(gòu)之一，其一直處于研究記憶神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)的前沿。隨著嚙齒類動(dòng)物海馬結(jié)構(gòu)中位置細(xì)胞、頭部方向細(xì)胞和網(wǎng)格細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)，為海馬體在記憶形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用的觀點(diǎn)奠定了基礎(chǔ)。研究表明，海馬CA3區(qū)形態(tài)學(xué)變化可引起學(xué)習(xí)記憶障礙［8］。本研究結(jié)果表明，大鼠脾切除術(shù)后逃避潛伏期和游泳路徑延長，大鼠海馬CA3 區(qū)錐體細(xì)胞層不完整、排列紊亂、松散，細(xì)胞周圍出現(xiàn)間隙，其中許多細(xì)胞胞體縮小、胞漿呈淡紅色、胞核固縮、深染，僅呈很淡的藍(lán)色甚至藍(lán)色消失，提示手術(shù)操作后老齡大鼠發(fā)生了認(rèn)知功能障礙，表明老齡大鼠PND 模型制備成功。右美托咪定為選擇性α2-腎上腺素能受體激動(dòng)劑，具有抑制交感神經(jīng)活性的作用，同時(shí)也是治療疼痛和躁動(dòng)的一種方法。參照文獻(xiàn)［9］及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，給予50 μg/kg 腹腔注射右美托咪定。

表3 五組大鼠術(shù)后各時(shí)點(diǎn)海馬Aβ、APP、BACE1 表達(dá)水平比較Tab.3 Comparison of the expression levels of Aβ、APP、BACE1 at each point between the five groups ±s

表3 五組大鼠術(shù)后各時(shí)點(diǎn)海馬Aβ、APP、BACE1 表達(dá)水平比較Tab.3 Comparison of the expression levels of Aβ、APP、BACE1 at each point between the five groups ±s

注：與C 組、D 組比較，*P ＜0.05；與O 組、S 組比較，#P ＜0.05

組別C 組D 組O 組*S 組*Y 組*#Aβ術(shù)后1 d 1.01±0.11 1.02±0.09 3.34±0.38 3.41±0.39 2.36±0.22術(shù)后3 d 1.01±0.11 1.01±0.09 3.64±0.37 3.32±0.37 2.47±0.23術(shù)后7 d 1.01±0.12 1.01±0.09 3.76±0.37 3.29±0.34 2.62±0.24 APP術(shù)后1 d 0.93±0.03 0.94±0.04 2.74±0.13 2.67±0.14 1.74±0.09術(shù)后3 d 0.94±0.04 0.95±0.03 2.73±0.12 2.76±0.11 1.73±0.08術(shù)后7 d 0.95±0.03 0.96±0.04 2.75±0.14 2.76±0.12 1.63±0.07 BACE1術(shù)后1 d 0.95±0.09 0.96±0.09 2.96±0.26 2.95±0.27 1.68±0.16術(shù)后3 d 0.95±0.09 0.96±0.09 2.98±0.24 2.98±0.29 1.65±0.15術(shù)后7 d 0.95±0.09 0.96±0.09 2.91±0.22 2.92±0.27 1.66±0.17

圖2 五組大鼠術(shù)后各時(shí)點(diǎn)海馬Aβ、APP、BACE1 的表達(dá)水平Fig.2 The expression of Aβ、APP、BACE1 in rat hippocampus at each point between the five groups

長鏈非編碼RNA（lncRNA）最初曾被認(rèn)為是基因組轉(zhuǎn)錄的“噪音”，因其參與了轉(zhuǎn)錄激活，轉(zhuǎn)錄干擾，核內(nèi)運(yùn)輸?shù)仍S多重要的調(diào)控過程，近年來引起眾多醫(yī)學(xué)研究者的關(guān)注［10-11］。BACE1-AS 是一種保守的長約2 kb 的lnc RNA。該基因編碼是從另一條鏈轉(zhuǎn)錄到BACE1 的未剪接的長鏈非編碼RNA。編碼的轉(zhuǎn)錄本被認(rèn)為與BACE1 mRNA 形成RNA 雙工，從而調(diào)控其表達(dá)，這可能導(dǎo)致Aβ 水平升高和老年斑沉積增加，因此可能在阿爾茨海默病的病理生理學(xué)中發(fā)揮作用［12］。有研究發(fā)現(xiàn)，使用針對lncRNA BACE1-AS 的特異性si RNA 可以降低lncRNA BACE1-AS 的表達(dá)水平［13］，這說明lncRNA BACE1-AS 參與了中樞神經(jīng)退行性病變的發(fā)生與發(fā)展。因此，本研究選擇觀察海馬lncRNA BACE1-AS 的變化。

本研究結(jié)果表明，老齡大鼠術(shù)后1、3、5 d 逃避潛伏期和游泳路徑延長，海馬lncRNA BACE1-AS、BACE1 mRNA、Aβ、APP 及BACE-1 的表達(dá)上調(diào)，提示手術(shù)操作可造成老齡大鼠PND；而給予右美托咪定處理后，老齡大鼠術(shù)后1、3、5 d 逃避潛伏期和游泳路徑縮短，海馬lncRNA BACE1-AS、BACE1mRNA、Aβ、APP 及BACE-1 的表達(dá)下調(diào)，表明右美托咪定減輕老齡大鼠PND 的機(jī)制與抑制lncRNA BACE1-AS 有關(guān)。其機(jī)制可能是：手術(shù)創(chuàng)傷使神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞激活，可引起AMPK 的活性升高，從而升高細(xì)胞的NAD+合成酶的活性來激活下游SIRT1［14］。一般情況下，細(xì)胞漿中的IκB 與NF-κB 復(fù)合體結(jié)合并抑制NF-κB 的活性，阻止其進(jìn)入細(xì)胞核，但當(dāng)IκB 磷酸化后，會(huì)與NF-κB 分離，這時(shí)NF-κB 激活進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)［15］。活化的NF-κB可使細(xì)胞內(nèi)lncRNA BACE1-AS 活性增加［16］，從而造成lncRNA BACE1-AS 與BACE1mRNA 形成雙鏈結(jié)構(gòu)復(fù)合物，避免了BACE1mRNA 被核酸酶降解，增加其穩(wěn)定性，使得BACE1 蛋白的表達(dá)增高。淀粉樣前體蛋白集中分布于神經(jīng)元的突觸，BACE1作用生成可溶性的β-APP8 及C99，而C99 又經(jīng)BACE1 水解產(chǎn)生不溶性的Aβ［17］，從而導(dǎo)致PND。有研究發(fā)現(xiàn)，右美托咪定可通過與α2-A 受體結(jié)合，阻斷AMPK 信號(hào)通路［18］。由此推斷右美托咪定可通過下調(diào)AMPK 活性抑制NF-κB 的活性，使細(xì)胞內(nèi)lncRNA BACE1-AS 活性降低，BACE1mRNA 被核酸酶降解，從而使得APP 和Aβ 表達(dá)下降，改善老齡大鼠PND。但右美托咪定是否通過其他機(jī)制引起lncRNA BACE1-AS 表達(dá)下降還有待進(jìn)一步研究。