張 丹，王增艷，麥慶云，蔡 炳，曾艷紅，周燦權(quán)

（中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院生殖中心//廣東省生殖醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510080）

建立達(dá)到藥品質(zhì)量管理規(guī)范GMP標(biāo)準(zhǔn)的人胚干細(xì)胞（human embryonic stem cells，hESC）系要求hESC的原代分離、培養(yǎng)傳代和凍存的每一步都要避免動(dòng)物源性成分的污染［1］。目前在成分確定的培養(yǎng)基（chemical defined medium，CDM）中的建系大多是將在含動(dòng)物成分培養(yǎng)體系中建立的原代克隆，經(jīng)數(shù)次傳代后再轉(zhuǎn)移至CDM培養(yǎng)體系中，但并不清楚在這樣一個(gè)轉(zhuǎn)換過(guò)程中hESC通過(guò)適應(yīng)會(huì)改變多少hESC的特性［2-4］。因此，在完全無(wú)動(dòng)物源性的培養(yǎng)體系中原代建立新的hESC系就顯得尤為必要。我們之前的研究［5］已經(jīng)證實(shí)了新構(gòu)建的無(wú)外源性（xeno-free，XF）培養(yǎng)體系支持hESC生長(zhǎng)的能力優(yōu)于feeder-free培養(yǎng)體系，但是研究中培養(yǎng)的兩株hESC系也不是在XF體系中原代建立的。利用胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)（preimplantation genetic testing，PGT）患者的廢棄胚胎建立的干細(xì)胞系為單基因疾病的研究提供了最佳的細(xì)胞模型。在本研究中，我們利用在本中心行PGT的染色體平衡易位患者的廢棄胚胎，使用機(jī)械切割法獲得內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（inner cell mass，ICM）并且傳代，以期建立完全沒(méi)有接觸動(dòng)物成分的hESC系，為hESC向臨床的應(yīng)用和單基因疾病細(xì)胞模型的建立提供了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 無(wú)動(dòng)物源性的hESC培養(yǎng)體系

此體系為我們之前新構(gòu)建的培養(yǎng)體系［5］。收集2016年8月至12月因一方染色體相互易位在我中心接受PGT治療的夫婦的廢棄胚胎共12枚，在患者簽署知情同意書后用于本實(shí)驗(yàn)的干細(xì)胞建系。以上材料均得到患者知情同意并得到中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 無(wú)動(dòng)物源性人包皮飼養(yǎng)層的制備及培養(yǎng)

無(wú)菌條件下取包皮環(huán)切術(shù)后的小兒包皮，用含雙抗的PBS沖洗3～5遍，然后在TrypLE Select（Invitrogen，美國(guó)）中4℃浸泡過(guò)夜。分離去除表皮后，用眼科剪將真皮剪碎，加入TrypLE Select于37℃消化30 min。然后加入含體積分?jǐn)?shù)10%HS（Sigema，美國(guó)）、90%DMEM（Invitrogen，美國(guó)）和體積分?jǐn)?shù)0.5%雙抗（HyClone，美國(guó)）的AF-HFF培養(yǎng)基中終止消化，用吸管反復(fù)吹打后1 200×g離心5 min，將上清液丟棄，用AF-HFF培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，以（5～10）×104/mL的密度接種于培養(yǎng)皿中。待生長(zhǎng)1周左右，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到90%面積以上融合時(shí)，使用TrypLE Select消化，按1∶5的比例傳代。包皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)至8代左右，開始用絲裂霉素滅活2 h，制備成包皮飼養(yǎng)層細(xì)胞，用于hESC的培養(yǎng)。以上材料均得到患者知情同意并得到中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.3 機(jī)械切割法分離ICM及其原代培養(yǎng)

12枚行PGT患者培養(yǎng)至D3的廢棄胚胎，用機(jī)械切割法去除透明帶，或者活檢后因染色體異常的廢棄胚胎發(fā)育至囊胚階段后，等待囊胚自然孵出。將去除透明帶的囊胚移入CDM（HEScGRO medium，Chemicon，美國(guó)）中，充分洗滌3次，有明顯ICM的囊胚，用1 mL的注射器針頭去除滋養(yǎng)層細(xì)胞后，將ICM種植在使用AF培養(yǎng)體系的培養(yǎng)皿中；無(wú)明顯ICM形成或ICM細(xì)胞數(shù)極少的囊胚，則將整個(gè)囊胚種植于新的培養(yǎng)皿中。每天觀察ICM的生長(zhǎng)情況，每隔2～3 d換液。原代培養(yǎng)培養(yǎng)7～14 d后，挑出克隆中央細(xì)胞致密、未分化的團(tuán)塊，用1mL的注射器針頭在解剖顯微鏡下將克隆機(jī)械地分成3～4塊，然后將小細(xì)胞團(tuán)種植于新的培養(yǎng)皿中。每隔5～7 d克隆顯著增殖或者發(fā)現(xiàn)有細(xì)胞分化跡象時(shí)，使用機(jī)械切割法按照1∶3～1∶6的比例進(jìn)行傳代。

1.4 免疫熒光檢測(cè)hESC表面未分化抗原

吸去培養(yǎng)液，用0.01 mol/L PBS洗3次，40 g/L多聚甲醛固定20 min。用0.01 mol/L PBS洗3次，再用體積分?jǐn)?shù)0.1%Triton X100（Sigma，美國(guó)）打孔10 min，0.01 mol/L PBS洗3次。接下來(lái)用體積分?jǐn)?shù)10%山羊血清（HyClone，美國(guó)）室溫下封閉30 min，然后分別加入4種一抗（SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81，1∶50；Chemicon，美國(guó)）。4℃孵育過(guò)夜后，再用0.01 mol/L PBS洗3次，加入熒光標(biāo)記的羊抗人的對(duì)應(yīng)二抗（Invitrogen，美國(guó)），室溫下孵育 1 h，加入DAPI（Sigma，美國(guó)）染核5 min，0.01 mol/L PBS洗3次。最后封片膠封片，待膠干后，在熒光顯微鏡下觀查結(jié)果。

1.5 RT-PCR檢測(cè)hESC的多能性

收集1×106的細(xì)胞量行RT-PCT，測(cè)定hESC多能性因子Octamer-binding transcription factor 3/4（OCT3/4）、anoghomeobox（Nanog）、POU class homeobox（POU5F1；表1）。參照總RNA提取試劑盒（Qiagen，美國(guó)）說(shuō)明用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA。RT-PCR依據(jù)試劑盒（Invitrogen，美國(guó)）說(shuō)明進(jìn)行操作。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為20 μL，其中總 RNA 2 μL、5×RT buffer 4 μL、10 mmol/L dNTP mix 1 μL、0.5 μg/μL oligo（Dt）20 1 μL、20 U/μL RNA 酶抑制劑1 μL、200 U/μL M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL，剩余體積由 DEPC H2O補(bǔ)充，反應(yīng)在42℃作用1 h，進(jìn)行cDNA的延伸。95℃10 min，使酶失活，然后保存在-80℃冰箱備用。PCR反應(yīng)體系 25 μL，其中模板2 μL、上下游引物各1 μL、PCR Master Mix 12.5 μL，dd H2O補(bǔ)充至25 μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃作用5 min；94℃ 30 s、60℃ 40 s、72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃作用7 min。PCR產(chǎn)物行2%瓊脂糖電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)下觀察照相。

1.6 體外分化實(shí)驗(yàn)

用Ⅳ型膠原酶將hESC從人成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層（human fibroblast cell feeder，HFF）上消化下來(lái)，轉(zhuǎn)移至低粘附性的6孔板中培養(yǎng)。分化培養(yǎng)試劑由體積分?jǐn)?shù)80%DMEM、體積分?jǐn)?shù)20%FBS、1 mmol/L L-glutamine、0.1 mmol/L β-mercaptoethanol和1 mmol/L MEM nonessential amino acids組成。經(jīng)過(guò)7～10 d的懸浮培養(yǎng)后，在顯微鏡下觀察類胚體的形成。收集到類胚體后，提取RNA檢測(cè)分化相關(guān)基因 Reduced Expression 1（REX-1）、sex determining region Y-box2（SOX-2）、Lin-28 homolog A（LIN 28）、Nucleophosmin-1（NPM1）和 Growth Differentiation Factor 3（GDF3）的表達(dá)（表1）。

表1 檢測(cè)干細(xì)胞多能性和分化相關(guān)基因的RT-PCR引物序列Table 1 the primer sequence used for polymerase chain reaction and determination ofpluripotency and differentiation genes

1.7 體內(nèi)分化實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞用膠原酶消化，離心，沉淀，以PBS懸浮，濃度約1×106/mL，用1 mL注射器將細(xì)胞懸液注入嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷（severe combined immunodeficiency，SCID）小鼠（中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心）后腿肌肉內(nèi)，每側(cè)0.1 mL（約1×106個(gè)細(xì)胞）。8～10周后可見(jiàn)小鼠腿部有腫塊長(zhǎng)出，10周后處死小鼠，將畸胎瘤組織用40 g/L多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，HE染色后顯微鏡下觀察是否存在內(nèi)、中、外3個(gè)胚層的組織。

1.8 hESC核型的檢測(cè)

將準(zhǔn)備用于核型檢測(cè)的hESC傳代至無(wú)飼養(yǎng)層的Matrigel包被的培養(yǎng)皿上，隔天換液。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)3～4 d，增殖迅速時(shí)，加入秋水仙素處理3 h，經(jīng)2.5 g/L的TrypLE Select消化成單個(gè)細(xì)胞后，常規(guī)空氣干燥法制片，Giemsa染色。

2 結(jié)果

2.1 AF-hESC系的生長(zhǎng)情況

我們前期嘗試使用Tyrode′s solution法去除透明帶和滋養(yǎng)外細(xì)胞，獲得的ICM轉(zhuǎn)移至無(wú)動(dòng)物源性人包皮飼養(yǎng)層（xeno-free human foreskin fibroblast feeder layers，XF-HFF）XF-HFF/CDM條件下培養(yǎng)3～7 d，ICM逐漸分化，最終未能形成干細(xì)胞克隆團(tuán)（圖1A）。而12枚PGT來(lái)源的廢棄胚胎使用機(jī)械切割法去除透明帶和滋養(yǎng)外細(xì)胞后，有1枚胚胎獲得的ICM在最初的幾次傳代中觀察到有來(lái)源于ICM的hESC樣的外生物生長(zhǎng)，伴隨滋養(yǎng)細(xì)胞來(lái)源的分化細(xì)胞（圖1B）。隨后進(jìn)一步機(jī)械傳代hESC樣細(xì)胞，分化的細(xì)胞逐漸消失，新的hESC系形成清晰的克隆邊界，細(xì)胞表現(xiàn)出典型的hESC形態(tài)學(xué)特征，即細(xì)胞間緊密連接形成鳥巢狀克隆，并有高的核質(zhì)比例（圖1C）。目前建立的這一株hESC系已傳代超過(guò)40代次，仍保持正常的hESC克隆形態(tài)。

圖1 在無(wú)動(dòng)物源性培養(yǎng)體系中建立的人胚胎干細(xì)胞克隆形態(tài)Fig.1 The morphology of hESC colonies cultured in xeno-free hESC culture conditions

2.2 免疫熒光檢測(cè)

對(duì)新建立的hESC系在傳代培養(yǎng)中以及解凍后進(jìn)行免疫熒光染色，克隆均表達(dá)hESC未分化表面標(biāo)記物SSEA-3、SSEA-4、Tra-1-60和Tra-1-81（圖2）。

圖2 XF/HFF-CDM培養(yǎng)體系中hESC的干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)Fig.2 Expression of stem cell markers in hESC grown in XF-HFF/CDM

2.3 RT-PCR檢測(cè)

hESC多能性因子和類胚體的3個(gè)胚層的表達(dá)AF-hESC系傳代至32代時(shí)，收集一定量的細(xì)胞量行RT-PCR，結(jié)果表明新建立的hESC系表達(dá)干細(xì)胞多能性因子Octamer-binding transcription factor 3/4（OCT3/4）、Nanoghomeobox（Nanog）、POU class 5 homeobox 1（POU5F1）（圖3）。為進(jìn)一步檢測(cè)干細(xì)胞系的分化能力，我們將hESC在無(wú)飼養(yǎng)層的低粘附皿中用20%FBS-DMEM培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)7～10 d的懸浮培養(yǎng)，觀察到有類胚體的形成。收集類胚體，加Trizol處理后用于RT-PCR檢測(cè)到分化相關(guān)基因REX-1、SOX-2、LIN28、NPM1和GDF3基因的表達(dá)（圖3），證實(shí)新建立的hESC系在體外具有分化的能力。

圖3 hESC多能性因子的表達(dá)Fig.3 Expression of stem cell markers

2.4 形態(tài)學(xué)結(jié)果提示分化潛能

將AF-hESC注入嚴(yán)重免疫缺陷（SCID）小鼠體內(nèi)能形成畸胎瘤，包括了來(lái)源于外、中、內(nèi)3個(gè)胚層的組織：皮脂腺、肌纖維和腸上皮等（圖4）。這表明AF-hESC具有多向分化潛能。

圖4 在XF-HFF/CDM培養(yǎng)體系中新建立的hESC系的體內(nèi)分化實(shí)驗(yàn)Fig.4 In vivo analysis of the pluripotency of hESC cultured in XF-HFF/CDM

2.5 染色體核型結(jié)果

對(duì)建立的干細(xì)胞系進(jìn)行核型鑒定為46，XY，t（1；20）（p13.3；q13.1；圖 5）。分別對(duì)第 15、20、25、30代次和解凍后第36代的hESC進(jìn)行了5次核型鑒定，均為同一異常核型。

圖5 在XF-HFF/CDM培養(yǎng)體系中新建立的hESC系的染色體核型鑒定Fig.5 G-banding chromosome analysis of the new hESC-line cultured in XF-HFF/CDM

3 討論

hESC建系及培養(yǎng)過(guò)程中，外源性成分主要來(lái)源于這幾個(gè)方面：①飼養(yǎng)層細(xì)胞或無(wú)飼養(yǎng)層基質(zhì)的動(dòng)物性成分，或者暴露于含動(dòng)物蛋白的培養(yǎng)基中；②hESC培養(yǎng)基中添加的動(dòng)物蛋白血清，如FBS和SR；③常用于去除滋養(yǎng)層細(xì)胞獲得ICM的免疫外科法也會(huì)使胚胎接觸動(dòng)物蛋白。一直以來(lái)，研究者們就致力于優(yōu)化hESC的培養(yǎng)體系，消除培養(yǎng)體系中的動(dòng)物源性成分，以期獲得完全無(wú)動(dòng)物源性的hESC培養(yǎng)體系和hESC系。

飼養(yǎng)層為hESC的生長(zhǎng)所不可或缺。已有證據(jù)表明與飼養(yǎng)層有關(guān)的多種信號(hào)通路參與了hESC多能性的維持。例如飼養(yǎng)層細(xì)胞分泌多種生長(zhǎng)因子，包括生長(zhǎng)因子家族（FGFs）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、激活素A、Wnt family member 3（Wnt3）、骨形態(tài)生成蛋白（BMP）拮抗信號(hào)等。這些因子通過(guò)相互協(xié)同作用，可以維持hESC在feeder-free培養(yǎng)體系中的未分化狀態(tài)生長(zhǎng)［2，3，6-11］。與昂貴的成分確定的基質(zhì)膠相比，人包皮成纖維細(xì)胞來(lái)源及制備方便，并可長(zhǎng)期傳代反復(fù)利用，已被證實(shí)是支持hESC未分化生長(zhǎng)的最佳飼養(yǎng)層以及制備條件培養(yǎng)基的飼養(yǎng)層細(xì)胞之一［12-14］。我們建立的AF-HFF在飼養(yǎng)層來(lái)源和培養(yǎng)基方面都去除了動(dòng)物成分的影響，并且使用時(shí)間長(zhǎng)，在體外培養(yǎng)可長(zhǎng)達(dá)一個(gè)月，仍具有支持hESC生長(zhǎng)的能力，大大減低了飼養(yǎng)層制備的繁瑣。

建立新的臨床級(jí)hESC系，分離ICM非常重要。免疫外科法是較為常用的獲取ICM的經(jīng)典方法，成功率高［15］。但是該法是將胚泡與動(dòng)物血清（兔抗小鼠的血清）共同孵育，直接接觸了動(dòng)物成分。機(jī)械法是待囊胚自然孵出或機(jī)械切除透明帶后種植于培養(yǎng)皿，培養(yǎng)5 d后分離出擴(kuò)大增殖的ICM細(xì)胞進(jìn)一步傳代。此方法避免了接觸動(dòng)物成分，但操作困難，不容易完全去除滋養(yǎng)細(xì)胞，而且內(nèi)胚層樣細(xì)胞形成使得hESC增殖能力低且極易分化，因而成功率低。對(duì)于ICM不明顯、細(xì)胞數(shù)極少的ICM，可在去除透明帶后行全囊胚培養(yǎng)。本研究中采用機(jī)械切割法或全囊胚法來(lái)獲得ICM來(lái)建立hESC系，以避免ICM分離過(guò)程中動(dòng)物蛋白的污染。血清是培養(yǎng)體系中的關(guān)鍵物質(zhì)，hESC首先是建立在添加了血清的培養(yǎng)基以及飼養(yǎng)層上的［15-17］，這與當(dāng)初鼠胚胎干細(xì)胞（mESC）系建立的培養(yǎng)條件及其相似。盡管如此，能維持hESC和mESC自我更新的因子之間存在很大的差異。例如，白血病抑制因子（LIF）通過(guò)結(jié)合LIF受體和gp130來(lái)激活JKA/Stat3信號(hào)通路［18-20］，而激活的Stat3信號(hào)足以維持mESC在含有血清的培養(yǎng)基中增殖和未分化生長(zhǎng)。還有研究認(rèn)為在去除血清的培養(yǎng)基中，BMPs可以協(xié)同LIF誘導(dǎo)表達(dá)Id基因來(lái)維持mESC的自我更新［21-23］。但是添加LIF與或激活Stat3信號(hào)通路卻不足以維持hESC自我更新［6，24］。

在飼養(yǎng)層體系中，以往對(duì)免疫外科法和機(jī)械法建系率的報(bào)道分別為1.8%～37.5%和9.1%～26%。對(duì)在添加不同血清的培養(yǎng)基中的建系率也不盡相同（FCS：5.6%；SR：1.8%～20%；HS：9.1%）。本研究采用機(jī)械切割法分離ICM以及不含血清的CDM來(lái)培養(yǎng)原代hESC克隆，最終囊胚建系率均較低（1/12）。分析其原因除了上面提到的機(jī)械法的缺點(diǎn)所導(dǎo)致外，在本實(shí)驗(yàn)中影響建系效率的因素還可能有：①用于建系的廢棄胚胎本身來(lái)源于染色體異常的患者，胚胎存在染色體異?？赡苄源?；②廢胚質(zhì)量較差，主要為D3小于6細(xì)胞的廢棄胚胎，或者是行活檢后因染色體異常廢棄的胚胎，胚胎質(zhì)量和活檢對(duì)胚胎的損傷以及囊胚孵出率都有可能影響建系效率；③既往的建系大多是在有血清的培養(yǎng)體系中進(jìn)行，而本研究中從原代克隆開始就在無(wú)血清條件下培養(yǎng)。無(wú)血清條件對(duì)原代克隆生長(zhǎng)的影響可能導(dǎo)致了低的建系率。雖然本研究的建系率低，但不失為一種全新的嘗試，建立的hESC系從原代開始就未接觸過(guò)血清及動(dòng)物源性物質(zhì)。在以后的研究中，我們需要借鑒前人的經(jīng)驗(yàn)，并對(duì)培養(yǎng)體系的因子組成進(jìn)行進(jìn)一步調(diào)整優(yōu)化，以進(jìn)一步提高建系效率，有望為批量化建立臨床級(jí)的hESC系提供可行方案。

使用無(wú)血清的CDM來(lái)建立hESC系，就需要了解和滿足原代克隆生長(zhǎng)所需的條件和機(jī)制。許多研究中使用CDM的成分不一，但共用的因子有白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素和bFGF，說(shuō)明這些因子是維持hESC的自我更新中的關(guān)鍵性因子。本研究中使用的CDM培養(yǎng)基就是主要由DMEM/F12、人胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、人血清白蛋白和bFGF（20 ng/mL）等組成。胰島素一種是胎兒期所需的重要生長(zhǎng)因子，過(guò)高或過(guò)低的胰島素都會(huì)影響新生兒的生長(zhǎng)發(fā)育：胰島素受體的變異可引起嚴(yán)重的新生兒生長(zhǎng)受限，而暴露于高濃度的胰島素可導(dǎo)致巨大胎兒。bFGF和Wnt家族成員對(duì)哺乳動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育和ESC的信號(hào)傳達(dá)起著重要作用。白蛋白是血清中主要的蛋白，作為一種載體蛋白，其主要作用是調(diào)節(jié)類固醇、甲狀腺素和其它親脂類激素。另外，它還有抗氧化作用，可以結(jié)合脂肪酸、離子、藥物以及代謝產(chǎn)物。而且膽固醇還是甾體激素的前體。Meng等［25］在2008年嘗試構(gòu)建同樣一個(gè)hESC培養(yǎng)體系，但研究者的目的在于驗(yàn)證他們建立的AF-HFF系是否具有支持hESC生長(zhǎng)的能力，并未對(duì)該培養(yǎng)體系進(jìn)行深入的分析，也沒(méi)有進(jìn)一步建立完全無(wú)動(dòng)物源性的hESC系。而我們?cè)谧C實(shí)了這個(gè)培養(yǎng)體系能維持hESC長(zhǎng)期未分化增殖能力后，進(jìn)一步證實(shí)了這個(gè)培養(yǎng)體系具有支持原代克隆生長(zhǎng)的能力，成功地獲得了新的hESC系，為臨床級(jí)的hESC的獲得提供了更優(yōu)化的培養(yǎng)體系和更大的可能。但是，我們的結(jié)果顯示，該培養(yǎng)體系的建系率要遠(yuǎn)低于其他含血清的培養(yǎng)體系，提示該培養(yǎng)體系仍存在某些缺陷，在將來(lái)的研究中還需要努力去完善。

hESC在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)、傳代和凍存可造成染色體突變，因此，hESC經(jīng)長(zhǎng)期體外培養(yǎng)后鑒定其核型的穩(wěn)定性非常重要。常用的hESC傳代為酶消化法傳代，它具有傳代速度快的優(yōu)點(diǎn)。但是用于細(xì)胞傳代的酶中常含有動(dòng)物成分，而且酶長(zhǎng)期消化細(xì)胞容易引起細(xì)胞基因的缺失，而機(jī)械法在去除動(dòng)物成分和維持正常的核型上避免了酶法傳代的缺陷，但缺點(diǎn)是勞動(dòng)強(qiáng)度大，耗時(shí)長(zhǎng)，不適用于擴(kuò)增臨床治療大批量hESC。Ludwing等［26］在一個(gè)成分確定的完全無(wú)動(dòng)物源成分的培養(yǎng)系統(tǒng)TesR1中建立了兩個(gè)新的hESC系，但是兩個(gè)hESC系在該系統(tǒng)傳代過(guò)程中先后發(fā)生了染色體畸變，可能為長(zhǎng)期酶法傳代或者長(zhǎng)期處于超生理濃度的生長(zhǎng)因子（如100 ng/mL bFGF）的刺激下所致，也可能與培養(yǎng)體系中存在某些促進(jìn)染色體變異或者缺少某些維持核型穩(wěn)定的因子有關(guān)。我們從細(xì)胞系建立后第15代起，每傳代5代直至45代次均對(duì)AF-hESC進(jìn)行核型鑒定，證實(shí)均為同一異常核型46，XY，t（1；20）（p13.3；q13.1），并且與該胚胎的活檢核型相符。因此我們認(rèn)為該xeno-free體系具有讓新建立的hESC系長(zhǎng)期保持核型穩(wěn)定的能力。近年來(lái)，多潛能誘導(dǎo)性的干細(xì)胞（induced pluripotent stem cell，iPS）的出現(xiàn)為干細(xì)胞系的來(lái)源提供了另一種的途徑，并且避免了倫理學(xué)爭(zhēng)議等問(wèn)題，已成為干細(xì)胞研究的熱點(diǎn)。但是，iPS細(xì)胞系仍然存在許多問(wèn)題。人胚胎干細(xì)胞中尚未解決的問(wèn)題，如干細(xì)胞自我更新和分化等行為的調(diào)控機(jī)制、體外定向分化誘導(dǎo)等，iPS同樣不能解決。而另一方面，iPS細(xì)胞又引入了諸多新的問(wèn)題，例如誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程的分子機(jī)制尚不明確、逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒的載體有誘發(fā)腫瘤的潛在風(fēng)險(xiǎn)、基因轉(zhuǎn)染也存在感染的潛在風(fēng)險(xiǎn)、iPS細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率等等。由此看來(lái)，人胚胎干細(xì)胞特別是PGT來(lái)源的攜帶遺傳性疾?。ɡ绲刂泻Ｘ氀⒓顾杓∥s、遺傳性耳聾等一系列單基因疾?。┑膆ESC系的建立，在臨床應(yīng)用及研究等方面仍具有不可替代的優(yōu)勢(shì)，臨床級(jí)的人胚胎干細(xì)胞在臨床治療和基礎(chǔ)研究領(lǐng)域仍具有廣闊的應(yīng)用前景［27］。

但是，建立符合臨床標(biāo)準(zhǔn)的hESC系只是臨床治療的第一步，并不是終極目標(biāo)。hESC在疾病治療中是扮演活性藥物成分還是原材料的角色，或者只是中間產(chǎn)物，到目前還沒(méi)有明確定位。在hESC系建立以后，大規(guī)模的生產(chǎn)繁殖以及定向分化，還存在著更大的挑戰(zhàn)。