梁莉瑩，路 靜，劉培慶

（中山大學(xué)藥學(xué)院藥理毒理實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510006）

阿霉素（Doxorubicin，Dox）是一種有效的蒽環(huán)類抗腫瘤藥物，具有作用強(qiáng)、抗瘤譜廣的特點(diǎn)，但其對(duì)心臟的慢性、劑量依賴性的毒副作用限制了其在臨床上的應(yīng)用［1］。阿霉素心肌病是一類由多種因素引起的疾病，其中心肌細(xì)胞凋亡和線粒體損傷被認(rèn)為是阿霉素誘導(dǎo)心肌病變進(jìn)程中的主要因素，但是其確切的病理機(jī)制尚不明確［2-4］。目前針對(duì)這種疾病的藥物主要在于減輕活性氧的積累，但是這些抗氧化劑并不能很好地逆轉(zhuǎn)阿霉素的心臟毒性［5］，這說明進(jìn)一步研究其具體的病理機(jī)理仍然是十分必要的。低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白 6（low density lipoprotein receptor related protein 6，LRP6）是一類細(xì)胞表面的跨膜蛋白，作為經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路中關(guān)鍵的共受體，它負(fù)責(zé)輔助Frizzled受體與配體Wnt蛋白結(jié)合，使胞內(nèi)β-catenin穩(wěn)定轉(zhuǎn)位入核，從而激活Wnt信號(hào)通路［6］。研究表明LRP6與心臟發(fā)育密切相關(guān)，并且在許多心血管疾病中發(fā)揮重要作用，如冠狀動(dòng)脈疾病［7］、擴(kuò)張性心肌炎［8］和心肌梗死［9］等，但是LRP6在阿霉素誘導(dǎo)的心肌損傷中的作用尚未有研究。經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、凋亡、遷移等生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用，其調(diào)控異常與許多心血管疾病息息相關(guān)［10］。β-catenin作為Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)控因子，對(duì)心臟發(fā)育完善［11］、心肌缺血性損傷［12］和梗死后修復(fù)［13］等過程至關(guān)重要。本研究旨在探究在阿霉素心肌病模型下LRP6與Wnt/β-catenin信號(hào)通路的關(guān)系及其作用，為闡明阿霉素心肌病機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞與動(dòng)物 本實(shí)驗(yàn)所用大鼠胚胎心室成肌細(xì)胞H9C2購(gòu)自于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。Sprague-Dawley（SD）大鼠，雄性SPF級(jí)，7～8周齡，體質(zhì)量180～220 g，動(dòng)物質(zhì)量合格編號(hào)為No.44008 500015654，用于構(gòu)建阿霉素誘導(dǎo)的心肌病模型，購(gòu)自于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 試劑 阿霉素（Target Molecule Corp.，美國(guó)）；胰酶（Sigma，美國(guó)）；胎牛血清（Gibco，美國(guó)）；OPTI-MEM培養(yǎng)基（Invitrogen，美國(guó)）；Lipofectamine 2000（Invitrogen，美國(guó)）；LRP6抗體（兔，Cell Signaling Technology，美國(guó)）；Caspase3抗體（兔，Proteintech Group，美國(guó)）；切割型Caspase3抗體（兔，Cell Signaling Technology，美國(guó)）；β-catenin抗體（兔，Cell Signaling Technology，美國(guó)）；α-Tubulin抗體（鼠，Sigma-Aldrich，美國(guó)）；羅丹明123（Invitrogen，美國(guó)）；Hoechst（Sigma-Aldrich，美國(guó)）；Mitotracker（Invitrogen，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 免疫印跡檢測(cè)（Western blot） 用適量RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，定量后變性制成樣品。然后用適宜濃度的SDS-PAGE凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，在5%的脫脂牛奶中室溫封閉1 h，用1×TBST洗膜后在4℃孵育一抗過夜，1×TBST洗膜后室溫孵育相應(yīng)的二抗1 h，洗滌后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影檢測(cè)。

1.2.2 總RNA提取-逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR） 用Trizol試劑提取總RNA并檢測(cè)濃度和純度，并根據(jù)美國(guó)Thermo逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。qPCR所用的引物由上海生工生物公司合成，以β-actin作為內(nèi)參基因，相關(guān)引物序列如下：LRP6上游5′-TACGTGTTTCACTGGGGACA-3′和 下 游 5′-GGAACTGAGACTCCGAGCAC-3′；β-actin 上游 5′-ACAACCTTCTTGCAGCTCCTC-3′和下游 5′-CTGACCCATACCCACCATCAC-3′。根據(jù)美國(guó)Bio-Rad公司的SYBRGreenqPCR試劑盒配制反應(yīng)體系，PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件設(shè)置為95℃ 15 min，95℃ 30 s，循環(huán)40次，55℃ 1 min，72℃ 30 s。

1.2.3 細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 根據(jù)Lipofectamine 2000的操作說明書，將適宜濃度的siRNA-LRP6或siRNA-negative control轉(zhuǎn)染到心肌細(xì)胞中，6 h后換液繼續(xù)培養(yǎng)72 h。siRNA-LRP6的序列：sense 5′-GGUUGUUUCCCAUUUGUGUUTT-3′和 antisense 5′-AACACAAAUGGGAACAACCTT-3′；siRNA-negative control的序列：sense5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′和 antisense5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。

1.2.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 經(jīng)過檢疫期后的SD大鼠隨機(jī)分為生理鹽水組和阿霉素組（每組6只）。在14 d的周期中，每隔4天對(duì)模型組的SD大鼠進(jìn)行腹腔注射相同劑量的阿霉素，每次5 mg/kg，最終累積劑量為15 mg/kg。與此同時(shí)，對(duì)照組的SD大鼠平行腹腔注射同等體積的生理鹽水。

1.2.5 羅丹明123法檢測(cè)線粒體膜電位 細(xì)胞棄去上清后用PBS緩沖液洗滌。用無酚紅培養(yǎng)基稀釋羅丹明123染料并加入培養(yǎng)板中，置于37℃孵育10 min。PBS洗滌后于細(xì)胞成像系統(tǒng)（EVOS FL Auto，Life Technologies，美國(guó)）觀察拍攝。

1.2.6 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 根據(jù)Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書，收集細(xì)胞并用預(yù)冷PBS緩沖液洗滌，低速離心后用1×BindingBuffer輕柔重懸細(xì)胞，分別避光加入Annexin V和Propidium Iodide混勻，室溫靜置后用流式細(xì)胞儀（Ex488 nm，Em530 nm，EPICS XL，Beckman Coulter，美國(guó)）檢測(cè)處理后心肌細(xì)胞凋亡率的變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，所有數(shù)據(jù)均表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD），兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），并結(jié)合Bonferroni法進(jìn)行多組間兩兩比較，P＜0.05則認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 在阿霉素心肌病細(xì)胞模型下，LRP6的轉(zhuǎn)錄和蛋白水平下調(diào)

圖1 阿霉素心肌病細(xì)胞模型中LRP6的轉(zhuǎn)錄和蛋白水平下降Fig.1 LRP6 was downregulated in doxorubicin treatment in vitro

如圖1A、B所示，與對(duì)照組相比，H9C2細(xì)胞在1 μmol/L的Dox刺激12 h時(shí)，在顯微鏡下可以觀察到細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)明顯的損傷和凋亡，而流式細(xì)胞技術(shù)同樣檢測(cè)到心肌細(xì)胞在Dox處理12 h后凋亡比率明顯增加［相當(dāng)于對(duì)照組（6.38±2.03）倍，t=5.28，P=0.0019，P ＜ 0.01］。Western blot的結(jié)果顯示，隨著Dox刺激時(shí)間的增加，c-caspase3/tcaspase3的蛋白水平顯著上調(diào)（圖1C）。經(jīng)羅丹明123、Hoechst和mitotracker染色，在熒光顯微鏡下觀察到，H9C2細(xì)胞在Dox刺激12 h下會(huì)出現(xiàn)線粒體膜電位下降、細(xì)胞核固縮以及線粒體基質(zhì)腫脹/瓦解（圖1D）。以上結(jié)果確定Dox誘導(dǎo)心肌病的細(xì)胞模型建立成功。qPCR和Westernblot的結(jié)果顯示，LRP6的mRNA［6 h、12 h組分別相當(dāng)于對(duì)照組（0.67±0.14）、（0.53±0.13）倍，F(xiàn)=15.39，P＜0.0001，圖1E］和蛋白［12 h組相當(dāng)于對(duì)照組（0.21±0.20）倍，F(xiàn)=6.64，P=0.0096，P ＜ 0.01，圖1F］水平均隨著Dox刺激時(shí)長(zhǎng)的增加而顯著下調(diào)。

2.2 在阿霉素心肌病動(dòng)物模型下，LRP6的轉(zhuǎn)錄和蛋白水平下調(diào)

為了進(jìn)一步檢測(cè)LRP6在阿霉素心肌病中的變化，采用分次腹腔注射Dox（累積劑量15 mg/kg）的方法建立體內(nèi)阿霉素心肌病的動(dòng)物模型。如圖2A所示，與生理鹽水（NS）對(duì)照組相比，Dox心肌病組大鼠的心臟明顯縮小，同時(shí)由圖2B的Masson染色病理切片可以看到，Dox引起大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂以及心肌纖維化增加。TUNEL染色法檢測(cè)到Dox組心肌細(xì)胞核DNA斷裂明顯增加［相當(dāng)于NS組（4.77±1.73）倍，t=4.29，P=0.0051，P＜0.01，圖2C］，在電鏡下可以觀察到Dox使大鼠心臟組織的線粒體排列紊亂、腫脹并形成空泡（圖2D）。然后我們檢測(cè)心臟組織的LRP6的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平在阿霉素刺激下是否發(fā)生變化，與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致，Dox可以明顯下調(diào)LRP6的mRNA［相當(dāng)于NS組（0.53±0.25）倍，t=2.67，P=0.0441，P ＜ 0.05，圖2E］和蛋白表達(dá)（圖2F）。

圖2 動(dòng)物模型中Dox下調(diào)LRP6的表達(dá)水平Fig.2 The downregulation of LRP6 in doxorubicin-induced cardiomyopathy in vivo

2.3 敲低LRP6加重阿霉素引起的心肌細(xì)胞凋亡和線粒體損傷

為了探討LRP6是否在阿霉素心肌病中發(fā)揮重要作用，我們通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染靶向LRP6的siRNA進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn)。圖3A、B的結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染siRNA 72 h成功敲低了LRP6的mRNA［相當(dāng)于NC組（0.31±0.08）倍，t=16.03，P=0.0039，P ＜ 0.01］和蛋白表達(dá)。LRP6基因沉默可以導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡和線粒體損傷，并且可以進(jìn)一步加重Dox誘導(dǎo)的心肌損傷，包括增加凋亡相關(guān)蛋白c-caspase3/t-caspase3的表達(dá)（圖3C），促進(jìn)線粒體膜去極化、核固縮以及線粒體腫脹（圖3D）。

圖3 LRP6在Dox誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和線粒體損傷中發(fā)揮重要作用.Fig.3 The involvement of LRP6 in doxorubicin-induced cardiomyocyte apoptosis and mitochondria dysfunction

2.4 敲低LRP6下調(diào)β-catenin，激活β-catenin可以減輕阿霉素引起的心肌損傷

作為Wnt蛋白的共受體，LRP6的異常表達(dá)與經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活化密切相關(guān)。由圖4A的Western blot結(jié)果可以看到，在Dox的刺激下，β-catenin的蛋白表達(dá)明顯降低［相當(dāng)于對(duì)照組（0.56±0.39）倍，F(xiàn)=2.98，P=0.0415，P ＜ 0.05］。為了進(jìn)一步探究LRP6和β-catenin以及阿霉素心肌病的關(guān)系，我們檢測(cè)了LRP6基因沉默時(shí)β-catenin的表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，敲低LRP6可以使β-catenin顯著下調(diào)（圖4B），而Dox誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡［c-cas3/t-cas3、凋亡比率相當(dāng)于對(duì)照組（28.86±2.00）、（6.38±2.03）倍］可以被特異性激活劑LiCl激活β-catenin所逆轉(zhuǎn)，包括減少切割型caspase3［相當(dāng)于對(duì)照組（16.67±2.53）倍，F(xiàn)=193.3，P ＜ 0.0001，t=8.87，P ＜ 0.001 vs.Dox組，圖4C］和下調(diào)心肌細(xì)胞凋亡比率［相當(dāng)于對(duì)照組（3.91±0.63）倍，F(xiàn)=21.04，P ＜ 0.0001，t=3.15，P ＜0.05 vs.Dox組，圖4D］，提示Dox通過下調(diào)LRP6抑制經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路，而激活Wnt信號(hào)對(duì)阿霉素心肌病起到保護(hù)作用。

圖4 敲低LRP6通過抑制經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路從而調(diào)控阿霉素心肌病Fig.4 The function of LRP6 downregulation in doxorubicin cardiotoxicity by inhibiting canonical Wnt/β-catenin signaling

3 討論

阿霉素在臨床上抗腫瘤的應(yīng)用受嚴(yán)重的心臟毒副作用所限制［1］，其復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制仍是研究的熱點(diǎn)［14-15］。目前尚未有很好的治療手段，因此明確其心臟毒副作用機(jī)制以及尋找新的潛在靶點(diǎn)仍然非常重要。在本研究中，我們分別建立阿霉素心肌病的細(xì)胞和動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)Dox刺激下LRP6的mRNA和蛋白水平都出現(xiàn)了明顯的下調(diào)。這些都提示LRP6可能影響阿霉素心肌病的病理進(jìn)程。

LRP6作為經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路的重要調(diào)控因子，其異常表達(dá)影響許多心血管疾病的病理進(jìn)程［16］。有研究報(bào)道，LRP6突變會(huì)抑制Wnt信號(hào)的傳遞，損傷內(nèi)皮細(xì)胞并導(dǎo)致常脂性家族性冠狀動(dòng)脈疾?。?］。LRP6基因沉默可以激活Drp1從而在糖饑餓的情況下抑制心肌細(xì)胞生長(zhǎng)［17］。我們的研究發(fā)現(xiàn)，敲低LRP6會(huì)引起心肌細(xì)胞凋亡和線粒體損傷，并且可以進(jìn)一步激活Dox誘導(dǎo)的線粒體凋亡信號(hào)通路的活化，從而加重心肌損傷。此外，已有研究表明激活β-catenin可以對(duì)抗阿霉素引起的心肌衰老作用［18］，本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)Dox和沉默LRP6均會(huì)引起β-catenin的蛋白表達(dá)下降，特異性激活β-catenin可以抑制阿霉素引起的心肌細(xì)胞凋亡。這提示在Dox心肌病中，LRP6表達(dá)水平下調(diào)，抑制下游經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活化，導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡和線粒體損傷。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)LRP6-Wnt/β-catenin信號(hào)軸在阿霉素引起的心臟毒性中發(fā)揮著重要的作用。我們推測(cè)，阿霉素的刺激使經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵輔助受體LRP6表達(dá)下調(diào)，抑制了Wnt蛋白與Frizzled受體的正常結(jié)合以及胞內(nèi)β-catenin的積累和轉(zhuǎn)位入核，導(dǎo)致經(jīng)典Wnt信號(hào)通路失調(diào)從而引起心肌損傷。這不僅有利于我們進(jìn)一步深入了解阿霉素心肌病的發(fā)病機(jī)制，也為預(yù)防和治療臨床上應(yīng)用阿霉素引起的心臟毒副作用提供新策略。