吳志強(qiáng)，周利君，陳 嵩，李健齊，周志勇，莊文權(quán)

（中山大學(xué)1.附屬第一醫(yī)院放射介入科；

2.疼痛研究中心，廣東廣州510080）

經(jīng)皮穿刺纖維化臭氧注射術(shù)治療腰椎間盤突出癥引起的疼痛是一種安全有效的治療方法。然而Kang等［1］在總結(jié)大量臨床實踐發(fā)現(xiàn)，該方法并不能緩解患者椎間盤退變情況，反而可能加劇其退變。動物實驗也發(fā)現(xiàn)，穿刺椎間盤的有創(chuàng)操作可加速其退變［2］。此后，一項多中心隨機(jī)對照研究證實，在椎旁肌肉注射臭氧也同樣能緩解腰椎間盤突出癥患者的疼痛［3］。這或許可以減少對椎間盤的損傷從而緩解其退變。De Oliveira Magalhaes等［4-5］在多項薈萃分析認(rèn)為椎旁注射臭氧減少了椎間盤的再次損傷，可達(dá)到鎮(zhèn)痛作用，且并發(fā)癥發(fā)生率下降，逐漸被臨床醫(yī)師接受。然而椎旁注射臭氧的鎮(zhèn)痛規(guī)律，以及其對椎間盤退變的影響尚不明確。Murphy等［6］驗證了臭氧可以減輕神經(jīng)根受壓達(dá)到鎮(zhèn)痛作用，并認(rèn)為抗炎作用是臭氧鎮(zhèn)痛的另一機(jī)制但未得到證實。同時臭氧椎旁注射是否會加重椎間盤退變尚不明確。為了更好地指導(dǎo)今后的臨床工作，本實驗首先使用行為學(xué)方法研究臭氧椎旁注射對SD大鼠盤源性疼痛模型的鎮(zhèn)痛規(guī)律，再通過磁共振掃描研究椎間盤退變的規(guī)律，最后通過western blot檢測臭氧對坐骨神經(jīng)和背根神經(jīng)節(jié)中腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）和降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin related gene peptide，CGRP）的影響，初步探討其鎮(zhèn)痛作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取鼠齡約7周的SPF級SD雄性大鼠65只，體質(zhì)量220～250 g，由中山大學(xué)實驗動物中心提供。實驗動物生產(chǎn)和使用許可證分別為：SCXK（粵）2016-0029和SYXK（粵）2017-0081。飼養(yǎng)環(huán)境為恒溫（22±2）℃，恒濕（55±5）%，每天照明12 h。大鼠入組條件：①雙后肢50%機(jī)械撤足閾值（50%mechanical withdrawal threshold，50%MWT）均高于10 g。②MR-T2WI成像各腰椎間盤Pfirrmann分級［7］均為I級，無先天性椎骨融合，無脊髓和坐骨神經(jīng)受壓表現(xiàn)。本動物實驗經(jīng)中山大學(xué)實驗動物管理與使用委員會批準(zhǔn)，并根據(jù)中山大學(xué)動物實驗中心的實驗動物操作標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

1.2 實驗試劑和儀器

VonFrey纖毛儀購自Stoelting公司，數(shù)字減影血管造影機(jī)（Allura Xper FD20）購自PHILIPS公司，磁共振掃描儀（Achieva 1.5T A-Series Nova Dual）購自PHILIPS公司，腫瘤壞死因子α一抗（ab8348）、降鈣素基因相關(guān)肽一抗（ab47027）、βactin一抗（ab8226）購自Abcam公司。

1.3 動物分組

采用隨機(jī)數(shù)表法分組，隨機(jī)入選15只SD大鼠為對照組（50%MWT＞10 g）。另將成功建立的SD大鼠盤源性疼痛模型（50%MWT＜2 g）50只隨機(jī)分為模型組（n=25）和臭氧組（n=25）。對照組不做任何處理，模型組經(jīng)皮穿刺L5-6纖維環(huán)建立盤源性疼痛模型，臭氧組在造模成功后第22天椎旁注射25 mg/L臭氧1 mL。三組大鼠均在造模前1天，造模后第1、3、7、14和21天，臭氧干預(yù)后第1、3、5、7、14、21、28和35天分別測量雙后足50%MWT。臭氧干預(yù)后第8天取左側(cè)坐骨神經(jīng)和背根神經(jīng)節(jié)，檢測相關(guān)組織中TNF-α、CGRP的相對表達(dá)濃度。模型組在造模前1 d，造模后第14、21、28、35天行磁共振T2WI掃描。臭氧組在造模前1 d，造模后第14、21、35天及臭氧干預(yù)后第7、14天行磁共振T2WI掃描。

1.4 SD大鼠椎間盤源性疼痛模型的建立及臭氧干預(yù)處理

SD大鼠椎間盤源性疼痛模型的建立詳細(xì)步驟見文獻(xiàn)［2］。臭氧組的處理：在模型成功建立后22 d，將臭氧組SD大鼠用100 g/L水合氯醛（3.5 mL/100 g）腹腔注射麻醉，術(shù)野皮膚備皮后俯臥在硬紙板上并固定其四肢、消毒術(shù)野皮膚。在數(shù)字減影血管造影機(jī)透視引導(dǎo)下定位L5-6椎間盤，用27G注射針頭從脊柱左側(cè)旁處入路穿刺至L5-6椎間盤的椎旁近坐骨神經(jīng)出口處，針與水平面夾角約45°。穿刺過程中注意大鼠左下肢是否顫動（若穿刺針刺激到坐骨神經(jīng)，大鼠則會出現(xiàn)左下肢不自主顫動）。正側(cè)位觀察穿刺針位置和方向，針尖位置準(zhǔn)確后，緩慢注射25 mg/L臭氧1 mL（圖1）。注射完針頭停留30 s后拔針。模型組造模成功后不做干預(yù)，對照組為正常SD大鼠。

圖1 臭氧椎旁注射X線片正側(cè)位及操作示意圖Fig.1 X-ray and illustration of paravertebral ozone injection

1.5 SD大鼠行為學(xué)觀察

造模前1 d，造模后第1、3、7、14、21天以及臭氧干預(yù)后第1、3、5、7、14、21、28和35天將各組大鼠放置于有機(jī)玻璃箱內(nèi)，觀察大鼠有無易激惹、撕咬肢體、運動功能障礙以及有無大小便失禁等情況。

1.6 SD大鼠50%MWT的測定

造模前1 d，造模后第1、3、7、14、21天以及臭氧干預(yù)后第1、3、5、7、14、21、28和35天將各組大鼠放置于有機(jī)玻璃箱內(nèi)，參考Garraway的“Up-Down”方法［8］測定50%MWT。

1.7 磁共振T2WI序列檢查

磁共振檢查建模前后及臭氧干預(yù)前后椎間盤退變情況：模型組大鼠隨機(jī)取20只在建模前1 d，建模后第14、21、28、35天分別行腰椎間盤磁共振T2WI序列檢查。臭氧組大鼠隨機(jī)取20只在建模前1 d，建模后第14、21天，臭氧干預(yù)后第7、14天分別行腰椎間盤磁共振T2WI序列檢查。觀察大鼠L4-5，L5-6，L6-7椎間盤退變情況。由磁共振室2名教授采用Pfirrmann分級法進(jìn)行盲法分級［7］。

1.8 腫瘤壞死因子α、降鈣素基因相關(guān)肽的檢測

臭氧干預(yù)后第7天，對照組、模型組和臭氧組各取5只大鼠，麻醉，在冰面上取材，取左側(cè)坐骨神經(jīng)（出髂骨段至分出腓總神經(jīng)以上部分）、左側(cè)L4-6背根神經(jīng)節(jié)，標(biāo)本取出后立即放液氮中極速冷凍。按照Wu等［2］的Western blot方法測定組織中的腫瘤壞死因子α和降鈣素基因相關(guān)肽。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。50%MWT結(jié)果采用重復(fù)測量方差分析，方差不齊時，使用Greenhouse-Geisser方法進(jìn)行校正。若存在交互效應(yīng)，進(jìn)一步采用多元方差分析方法檢驗組別和時間的單獨效應(yīng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義時均采用Bonferroni法進(jìn)行兩兩比較。L5-6椎間盤Pfirrmann分級采用卡方檢驗分析。Western blot結(jié)果采用單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義時均采用Bonferroni法進(jìn)行兩兩比較。雙側(cè)檢驗，以α=0.05為檢驗標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 SD大鼠一般行為學(xué)檢測結(jié)果

成模及臭氧干預(yù)后，所有SD大鼠均未出現(xiàn)易激惹、撕咬肢體、運動功能障礙以及尿便失禁等情況。

2.2 SD大鼠50%MWT檢測結(jié)果及療效分析

造模前3組50%MWT差異無統(tǒng)計學(xué)意義（左n=50，F(xiàn)=0.037，P=0.964；右n=50，F(xiàn)=1.11，P=0.338）。造模后第1天，模型組和臭氧組50%MWT均有下降，模型組或臭氧組與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.001）；而模型組與臭氧組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（左P=0.258，右P=0.832）；造模后第3～21天，對照組與模型組或臭氧組之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.001）。而模型組與臭氧組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（左P=0.583，右P=0.343）。造模后第22天給予25 mg/L臭氧干預(yù)。造模后第22天，3組50%MWT兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.001）。在臭氧干預(yù)前后各時間點，模型組組內(nèi)50%MWT無統(tǒng)計學(xué)差異（左P=0.985，右P=0.973）。臭氧組50%MWT從造模后第22天開始上升（左后足7.6±6.8，右后足3.6±1.0），至造模后第24天達(dá)到最高峰（左后足10.6±8.2，右后足7.9±6.7），以后維持這一水平至造模后第56天（圖2）。

圖2 三組SD大鼠的雙后足50%MWT的變化曲線Fig.2 Curve of 50%mechanical withdrawal threshold of both hind paws in three groups

模型組和臭氧組SD大鼠在造模后雙后足50%MWT均低于2.0 g。臭氧組SD大鼠共20只，50%（10/20）大鼠左后足疼痛在造模后第22天開始緩解（50%MWT＞4.0 g）；大鼠左后足疼痛在造模后第28天的緩解率為90%（50%MWT＞ 4.0 g），其中40%大鼠疼痛基本緩解（50%MWT＞10.0 g）。40%大鼠右后足疼痛在造模后第22天開始緩解（50%MWT＞4.0 g），大鼠右后足疼痛在造模后第28天的緩解率為70%（50%MWT＞4.0 g），其中20%的大鼠右后足疼痛基本緩解（50%MWT＞10.0 g）。模型組的SD大鼠在隨訪期間雙后足50%MWT沒有改善。

2.3 模型組和臭氧組大鼠腰椎間盤磁共振T2WI序列掃描結(jié)果

模型組大鼠建模后各時間點L5-6椎間盤Pfirrmann分級有統(tǒng)計學(xué)差異，隨時間延長而Pfirrmann分級更高（n=40，H=13.88，P ＜ 0.001）。臭氧組大鼠在臭氧干預(yù)后Pfirrmann分級高于模型組大鼠（n=40，H=9.38，P ＜ 0.001；圖3，表1）。

圖3 模型組和臭氧組大鼠腰椎間盤磁共振T2WI成像信號變化Fig.3 Sagittal MR T2weighted images of rat intervertebral disk before and after modeling and ozone injection

表1 模型組和臭氧組大鼠腰椎間盤磁共振Pffirmann分級Table 1 Pffirmann grade of L5-6 intervertebral disk in model group and ozone group

2.4 腫瘤壞死因子α和降鈣素相關(guān)基因肽表達(dá)結(jié)果

3組SD大鼠，左側(cè)坐骨神經(jīng)中腫瘤壞死因子α（n=15，F(xiàn)=13.28，P ＜ 0.001）和降鈣素基因相關(guān)肽（n=15，F(xiàn)=9.32，P ＜ 0.001）在3組表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義。兩兩比較發(fā)現(xiàn)模型組的表達(dá)均高于臭氧組，臭氧組又高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.001；圖4）。

圖4 三組SD大鼠左側(cè)坐骨神經(jīng)中腫瘤壞死因子-α和降鈣素基因相關(guān)肽的表達(dá)情況Fig.4 Expression of calcitonin gene-related peptide and tumor necrosis factor-α in sciatic nerve in three groups

2.5 三組SD大鼠左側(cè)背根神經(jīng)節(jié)中腫瘤壞死因子和降鈣素相關(guān)基因肽的表達(dá)結(jié)果

左側(cè)背根神經(jīng)節(jié)中腫瘤壞死因子α（n=15，F(xiàn)=11.98，P＜0.001）和降鈣素基因相關(guān)肽（n=15，F(xiàn)=12.86，P＜0.001）在3組表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義。兩兩比較發(fā)現(xiàn)模型組的表達(dá)均高于臭氧組，臭氧組又高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.001；圖5）。

圖5 三組SD大鼠左側(cè)背根神經(jīng)節(jié)中腫瘤壞死因子-α和降鈣素基因相關(guān)肽的表達(dá)Fig.5 Expression of calcitonin gene-related peptide and tumor necrosis factor-α in dorsal root ganglion in three groups

3 討論

背根神經(jīng)節(jié)不僅參與了痛覺的傳導(dǎo)和調(diào)節(jié)的外周機(jī)制，同時作為感覺傳入的初級神經(jīng)中樞，具有合成和分泌功能［9］。Krames等［10］發(fā)現(xiàn)，纖維環(huán)損壞時所釋放的物質(zhì)可刺激背根神經(jīng)節(jié)開發(fā)離子通道，通過坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)，引起下肢痛覺敏感。背根神經(jīng)損傷所致的痛覺過敏、痛覺異常和自發(fā)的持續(xù)性疼痛都是由初級傳入神經(jīng)元的變化所引起。這些癥狀至少部分反映了初級傳入神經(jīng)元電活性和/或表型的變化。尤其是初級傳入神經(jīng)元異位電活動，不僅是持續(xù)的臨床神經(jīng)病理性疼痛癥狀的點火者，同時還參加了痛覺過敏和痛覺異常密切相關(guān)的中樞敏化［11］。

Niu等［12］研究發(fā)現(xiàn)，臭氧濃度的選擇與療效密切相關(guān)，過低濃度可能因氧化作用弱使療效欠佳，而過高濃度則容易引起組織損傷。臨床上治療腰椎間盤突出癥的濃度為25～50 mg/L，注射劑量在5～15 mL。本研究在前期預(yù)實驗中也發(fā)現(xiàn)25 mg/L濃度的臭氧1 mL椎旁注射對SD大鼠盤源性疼痛模型已有較好的鎮(zhèn)痛作用，而更大劑量（2 mL）容易導(dǎo)致實驗動物死亡。根據(jù)術(shù)中X線透視下所見及動物尸體解剖發(fā)現(xiàn)：部分大鼠在臭氧注射時有明顯沿椎管上行至腦部的氣流，數(shù)秒后實驗動物即出現(xiàn)呼吸驟停，解剖未發(fā)現(xiàn)大鼠脊髓損傷。實驗動物的死亡原因考慮與臭氧通過椎管擴(kuò)散至高級神經(jīng)中樞，抑制呼吸中樞有關(guān)。本實驗最后選擇濃度25 mg/L臭氧1 mL椎旁注射作為研究干預(yù)條件。

本研究通過檢測SD大鼠盤源性疼痛模型的臭氧干預(yù)前后的雙后足50%MWT的變化，初步結(jié)果顯示大鼠盤源性疼痛模型椎旁注射25 mg/L臭氧1 mL后，90%的大鼠左后足50%MWT明顯升高（由1.31±0.52提高至4.24±1.96），顯示有鎮(zhèn)痛效果，有40%的大鼠疼痛癥狀基本消失，由此可以推斷椎旁注射25 mg/L臭氧1 mL對大鼠盤源性疼痛模型有一定的鎮(zhèn)痛作用。

本研究對比了模型組大鼠與臭氧組大鼠椎間盤T2WI表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)臭氧椎旁注射雖能緩解椎間盤退變引起的疼痛，但卻加速了椎間盤的退變，是一種破壞性的治療方式，故在臨床實踐中，對于盤源性疼痛的早期患者，可以通過一些非干預(yù)性的治療緩解癥狀，而臭氧椎旁注射并不是一種首選方法。

正常情況下腫瘤壞死因子α在中樞神經(jīng)系統(tǒng)與外周神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)很低，分布亦較局限。脊髓損傷時，腫瘤壞死因子α的表達(dá)上調(diào)，主要分布于神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞［13］。Shubayev等［14］將示蹤的腫瘤壞死因子α注射到大鼠的坐骨神經(jīng)損傷部位后，發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子α可以由軸突逆行轉(zhuǎn)運至脊神經(jīng)節(jié)；又在大鼠的L5神經(jīng)節(jié)注射生物素化的腫瘤壞死因子α，應(yīng)用抗生物素化的方法測定其移動的位置，發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子α可以傳導(dǎo)至正常和受傷的大鼠外周神經(jīng)，也可以傳至損傷側(cè)的脊髓后角。他們認(rèn)為外周神經(jīng)損傷后腫瘤壞死因子α逆行傳至中樞，可能參與了中樞部位的細(xì)胞因子的激活，是神經(jīng)源性疼痛發(fā)病機(jī)制原因之一。在本實驗研究中我們發(fā)現(xiàn)，臭氧干預(yù)后SD大鼠坐骨神經(jīng)和背根神經(jīng)節(jié)的腫瘤壞死因子α有明顯下降，但并未降至造模前水平，而大鼠左后足50%MWT也同時表現(xiàn)為較治療前明顯升高而未完全達(dá)到造模前水平。臭氧組50%MWT顯著高于模型組。這與Murphy等［6］研究結(jié)果類似?？赡茉蚴浅粞踔委熆梢跃徑獾荒芡耆柚勾笫蟊P源性疼痛的炎癥性反應(yīng)。當(dāng)再次出現(xiàn)外界刺激時，炎癥細(xì)胞可能再次被激活，并釋放炎癥因子引起疼痛復(fù)發(fā)。在臨床上我們也發(fā)現(xiàn)，部分患者在臭氧治療一段時間后可出現(xiàn)疼痛癥狀復(fù)發(fā)，再次接受臭氧治療后疼痛癥狀仍可緩解或消失。

越來越多的證據(jù)表明，降鈣素基因相關(guān)肽在外周致敏和相關(guān)的增強(qiáng)疼痛的發(fā)展中起關(guān)鍵作用。降鈣素基因相關(guān)肽參與神經(jīng)源性炎癥的發(fā)展，并且在炎癥和神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生時上調(diào)［15］。降鈣素基因相關(guān)肽主要介導(dǎo)傷害性感受傳遞，并在外周敏化和中樞敏化中均起到重要作用［16］。De Logu等［17］發(fā)現(xiàn)：大量的興奮性離子通道和受體可以誘導(dǎo)降鈣素基因相關(guān)肽的釋放，從而誘發(fā)疼痛。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，降鈣素基因相關(guān)肽抑制劑可有效緩解盤源性疼痛動物模型的疼痛［18］。在本實驗研究中，我們發(fā)現(xiàn)臭氧干預(yù)后，臭氧干預(yù)組的大鼠坐骨神經(jīng)和背根神經(jīng)節(jié)的降鈣素基因相關(guān)肽表達(dá)較模型組的明顯下降。推測臭氧可能通過某種途徑抑制降鈣素基因相關(guān)肽的表達(dá)，降低疼痛敏感度，起到鎮(zhèn)痛作用。

綜上所述，臭氧椎旁注射可以緩解盤源性疼痛模型大鼠的疼痛，但卻加重了其腰椎間盤的退變。臭氧椎旁注射可降低模型大鼠坐骨神經(jīng)及背根神經(jīng)節(jié)中腫瘤壞死因子-α和降鈣素基因相關(guān)肽的表達(dá)，可能通過抗炎作用、減少疼痛信號傳導(dǎo)達(dá)到鎮(zhèn)痛的效果。