馬 蘭 ，劉川川 ，楊全余 ，馬 燕

（1.青海大學醫(yī)學院高原醫(yī)學研究中心，

2.青海省高原醫(yī)學應用基礎重點實驗室，青海西寧810001）

低氧性肺動脈高壓（hypoxic pulmonary artery hypertension，HPH）是由于長期低氧引起肺血管收縮和肺血管重建從而導致肺動脈壓力持續(xù)升高的一種常見的慢性高原?。?］。在缺氧早期，HPH主要以肺血管收縮為主，隨著缺氧時間的延長，肺血管重建參與其中［2］。在低氧引起的肺血管重建中血管平滑肌細胞的增殖發(fā)揮著重要的作用。但是目前引起肺動脈壓升高和血管重建的分子機制尚不清楚。缺氧環(huán)境下miRNA表達的改變可以調(diào)節(jié)肺動脈平滑肌細胞（pulmonary artery smooth muscle cell，PASMC）的增殖、凋亡、遷移等功能，并參與HPH的形成［3］。miR-34a是一類對細胞增殖具有正調(diào)或負調(diào)作用的miRNAs，通過調(diào)控許多靶蛋白，參與細胞周期，細胞凋亡及分化［4］。Notch1是與細胞增殖密切相關的基因，已被證實為是miR-34a的靶基因之一，miR-34a通過與Notch1基因3′-UTRs區(qū)的結合位點相結合來發(fā)揮負性調(diào)控作用［5］。然而，miR-34a是否也參與調(diào)節(jié)缺氧誘導的PASMC的增殖報道較少。本課題通過細胞轉(zhuǎn)染過表達和抑制miR-34a及沉默Notch1的表達后觀察低氧誘導的PASMC的增殖情況，旨在探討miR-34a在低氧誘導的大鼠低氧性PASMC增殖中的作用及其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司（動物合格證號：11400700292756），體質(zhì)量為140～160 g。本動物實驗經(jīng)青海大學實驗動物倫理委員會批準，并根據(jù)青海大學動物實驗中心的實驗動物操作標準進行。

1.2 實驗試劑

DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清均購自Gibco公司，增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）引物由生工生物工程有限公司合成；Trizol RNA提取試劑盒和lipofectimin RNAiMax細胞轉(zhuǎn)染試劑盒均購自Thermo Fisher公司；miR-34a mimics（MSY0000815）、miR-34a inhibitor（MIN0000815）、si-Notch1（SI01920744）、All star negative control（SI03650318）、Rn-miR-34a primer（MS00000224）、Rn-U6 primer（MS00033740）、Notch1 primer（QT004 00036）、18srRNA primer（QT00199374）、miScript?II RT kit、miScript SYBR Green PCR kit及 Quanti-Fast SYBR Green PCR kit均購自Qiagen公司；Fast Quant cDNA第一鏈合成試劑盒購自TIANGEN公司；Anti-PCNA antibody、Anti-α-tubulin及二抗均購自Abcam公司。EDU細胞增殖檢測試劑盒購自廣州銳博生物科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒和ECL發(fā)光試劑盒均購自Pierce公司。7500熒光定量PCR儀（美國ABI公司），AI 600成像儀（美國GE公司）。

1.3 大鼠PASMC的原代培養(yǎng)

健康SPF級雄性SD大鼠腹腔注射0.6 mL/100 g的烏拉坦麻醉后斷頸處死、體積分數(shù)75%酒精消毒胸腹部，無菌條件下打開胸腔并迅速取出心肺組織，并置于預冷滅菌的PBS中將血液洗凈。在體視顯微鏡下小心分離出左右肺中小動脈后用眼科剪沿著動脈管縱行方向剪開，再用小刀片在內(nèi)壁輕輕刮幾次以除去內(nèi)皮細胞，然后將血管壁剪成1×1 mm2的組織小片，培養(yǎng)瓶內(nèi)加入含體積分數(shù)20%FBS的DMEM培養(yǎng)基，采用組織貼塊法原代培養(yǎng)大鼠PASMC。待細胞生長融合達80%左右后，用2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)，用免疫組化法檢測α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）對培養(yǎng)的PASMC進行細胞純度的鑒定，并取第3～5代的細胞作為實驗用細胞。

1.4 大鼠PASMC低氧處理及分組

取已培養(yǎng)的3～5代大鼠PASMC，用2.5 g/L胰蛋白酶消化細胞并計數(shù)后，按1×105細胞密度將細胞接種在6孔培養(yǎng)板中，并加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，常氧組置于常氧培養(yǎng)箱中（37℃，體積分數(shù) 5%CO2、21%O2和 74%N2），低氧組置于低氧培養(yǎng)箱中（37℃，體積分數(shù)5%CO2、3%O2和92%N2）培養(yǎng)24、48 h。

1.5 細胞轉(zhuǎn)染

在6孔細胞培養(yǎng)板中按照1×105密度接種細胞，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，觀察細胞待融合到80%左右，換為0.5%FBS的DMEM培養(yǎng)基細胞同步化12 h后開始細胞轉(zhuǎn)染，將 miR-34a mimic（20 nmol/L）、miR-34a inhibitor（20 nmol/L）、Si-Notch1（40 nmol/L）及All star negative control（20 nmol/L）分別和lipofectimin RNAiMax（9 μL/孔）嚴格按照Thermo Fisher公司的lipofectimin RNAiMax轉(zhuǎn)染試劑盒說明書配制混勻后室溫孵育5 min，加入細胞中并置于低氧培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后換成含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h。

1.6 EDU檢測細胞增殖

按照EDU細胞增殖檢測試劑盒，對各組細胞按照說明逐步進行EDU標記、固定、Apollo染色，用Hoechst 33342進行DNA染色后，在激光共聚焦顯微鏡下進行觀察和拍照，隨機選取10個視野計數(shù)并統(tǒng)計。

1.7 細胞總RNA提取

按照Trizol試劑盒說明書一步法提取各組細胞總RNA，用NanoDrop 2000超微量分光光度計測定A260和A280純度及濃度、甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳分析檢測完整性。

1.8 RT-QPCR檢測miR-34a及PCNA的表達

microRNA的反轉(zhuǎn)錄按照miScript?II RT kit試劑盒說明書合成cDNA第一鏈。并以此cDNA鏈為模板，按照miScript SYBR Green PCR kit試劑盒說明書，建立miR-34a和內(nèi)參U6的反應體系，在ABI7500熒光定量PCR上進行PCR反應，條件為95℃，5 min；95 ℃，10 s，55 ℃，15 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)；普通基因的反轉(zhuǎn)錄按照FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒說明書進行cDNA第一鏈的合成。并以此cDNA第一鏈為模板，嚴格按照QuantiFast SYBR Green PCR kit試劑盒說明書，建立PCNA及內(nèi)參18 s rRNA的反應體系，然后在ABI 7500熒光定量PCR上進行PCR反應，條件為95℃，5 min；95℃，10 s，60 ℃，30 s，40個循環(huán)；以上每個樣本均設3個復孔。熔解曲線的采集在以上PCR反應結束后，以每10 s上升0.5℃的速度從60℃到95℃來記錄線。

1.9 Western-blot法檢測蛋白表達

收集各組處理細胞，嚴格按照碧云天公司的RIPA總蛋白提取試劑盒提取各組細胞總蛋白，然后用pierce公司的BCA蛋白定量試劑盒對所提取的總蛋白定量后，加入含β巰基乙醇的上樣緩沖液煮沸蛋白變性，取15 μg樣品上樣，用5%濃縮膠和10%聚丙烯酰胺分離膠進行電泳，待電泳結束后用Bio-Rad半干電轉(zhuǎn)儀（恒壓10 V，20～30 min）轉(zhuǎn)到PVDF膜上。室溫下用5%的脫脂奶粉封閉2 h后，在含相應蛋白大小的PVDF膜中分別加入PCNA的兔多克隆抗體（1∶2 000）和內(nèi)參α-tubulin多克隆抗體（1∶2 000）4℃過夜。用TBST洗膜后加入羊抗兔HRP標記的二抗，在室溫下孵育1 h后用TBST再次洗膜后ECL發(fā)光液發(fā)光，并用AI 600成像儀進行熒光成像并拍照。用PCNA目的蛋白的條帶與內(nèi)參α-tubulin蛋白條帶的灰度值之比作為PCNA蛋白的相對表達量，并用Quantity one分析軟件進行灰度值分析。

1.10 統(tǒng)計學方法

用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差（±s）表示，數(shù)據(jù)處理兩樣本間比較，數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布且方差齊時采用t檢驗；多組間比較先進行正態(tài)分布和方差齊性檢驗，數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布且方差齊時采用單因素方差分析（one way ANOVA），多組間比較有差異時，組間兩兩比較用Tukey檢驗，檢驗水準為α=0.05。

2 結果

2.1 大鼠PASMC培養(yǎng)和鑒定

如圖所示，我們采用組織貼塊法成功分離并原代培養(yǎng)了大鼠PASMC，在貼塊培養(yǎng)的第3～5天，可以觀察到平滑肌細胞從組織塊周圍爬出，并貼壁生長，細胞形態(tài)多呈長梭形，胞質(zhì)豐富，細胞生長致密時呈束狀平行排列（圖1A），7～10 d后呈典型的“峰-谷”狀（圖1B）。用免疫組化法檢測α-SMA對培養(yǎng)的PASMC進行細胞純度鑒定，可見在視野下大多數(shù)細胞均呈陽性染色（圖1C、D）。

圖1 PASMC培養(yǎng)和鑒定結果Fig.1 Cell culture and identification of PASMC

2.2 低氧誘導大鼠PASMC中miR-34a的表達

大鼠PASMC經(jīng)體積分數(shù)3%的低氧處理24和48 h后，用Real-time PCR分別檢測了各組PASMC中miR-34a的表達。結果顯示，在低氧處理24 h后，與同時間常氧對照組相比，PASMC中miR-34a的表達降低，但是差異無統(tǒng)計學意義（t=2.167，P=0.096；圖2），而在低氧處理48 h后，PASMC中miR-34a表達顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（t=9.450，P=0.001；圖2）

圖2 低氧處理后大鼠PASMC中miR-34a的表達Fig.2 Expression of miR-34a in rat PASMC after hypoxia

2.3 低氧誘導大鼠PASMC中Notch1的表達

大鼠PASMC分別給與體積分數(shù)3%的低氧處理24和48 h后，用Real-time PCR分別檢測了各組細胞中Notch1 mRNA水平的表達。分別與各時間段的常氧對照組相比，低氧處理24 h后，PASMC中Notch1 mRNA的表達水平明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義（t=-4.006，P=0.016；圖3）。低氧處理48 h后，與其常氧對照組相比，PASMC中Notch1 mRNA的表達水平也明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義（t=-4.624，P=0.01；圖3）。

圖3 低氧處理后PASMC中Notch1的mRNA表達水平Fig.3 Expression of Notch1 mRNA in rat PASMC after hypoxia

2.4 過表達和抑制miR-34a對低氧誘導的細胞增殖的影響

為了觀察miR-34a對低氧引起的PASMC增殖的影響，我們用miR-34a模擬物和抑制劑及Si-Notch1分別轉(zhuǎn)染大鼠PASMC，并給予體積分數(shù)3%的低氧刺激48 h后用EDU檢測細胞增殖情況。結果如圖4所示顯示，常氧組、低氧組及低氧各轉(zhuǎn)染組間比較差異有統(tǒng)計學意義（F=26.097，P=0.000）。與常氧對照組相比較，低氧48 h會顯著刺激PASMC細胞增殖，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.002）。而在低氧條件下與轉(zhuǎn)染陰性對照相比，過表達miR-34a或者抑制Notch1后會顯著抑制低氧引起的細胞增殖，抑制miR-34a的表達后則會促進細胞增殖，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖4 低氧下過表達和抑制miR-34a對PASMC細胞增殖的影響Fig.4 Effects of over expression and inhibition of miR-34a on proliferation of PASMC under hypoxia

2.5 過表達和抑制miR-34a對PCNA表達的影響

用miR-34a模擬物和抑制劑分別轉(zhuǎn)染大鼠PASMC，并給予低氧刺激48 h后，用RT-qPCR和Western blot進一步檢測細胞增殖核抗原PCNA的表達。RT-qPCR檢測結果如圖5所示，常氧組、低氧組及低氧各轉(zhuǎn)染組間比較差異有統(tǒng)計學意義（F=38.312，P=0.000）。與常氧對照組相比，單純低氧組PCNA mRNA水平表達明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.008）。與陰性對照組相比，過表達miR-34a或者抑制Notch1后，PASMC中的PCNA mRNA的表達水平顯著降低，而抑制miR-34a后，PASMC中的PCNA mRNA的表達水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。在蛋白水平的檢測結果如圖6所示，常氧組、低氧組及低氧各轉(zhuǎn)染組間比較差異有統(tǒng)計學意義（F=55.480，P=0.000）。與常氧對照組相比，單純低氧48 h后PASMC中PCNA蛋白表達明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000）。低氧處理后，與轉(zhuǎn)染陰性對照組（H+Si-NC）相比，過表達miR-34a后，PASMC中的PCNA蛋白的表達水平顯著降低，而抑制miR-34a的表達后，PASMC中的PCNA蛋白的表達水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），這一結果與mRNA水平相一致。

圖5 低氧下過表達和抑制miR-34a后PASMC中PCNA mRNA的表達情況Fig.5 Effect of over expression and inhibition of miR-34a on PCNA mRNA expression in PASMC under Hypoxia

圖6 低氧處理后過表達和抑制miR-34a后PASMC中PCNA蛋白的表達Fig.6 Effect of overexpression and inhibition of miR-34a on PCNA proteinexpression in PASMC under Hypoxia

3 討論

缺氧性肺血管收縮和肺血管結構重構為HPH的主要病理學變化特點，而PASMC是在慢性缺氧過程中參與肺血管結構重建的關鍵細胞，也是缺氧造成肺血管收縮的主要效應細胞。既往研究表明，PASMC的異常增殖、凋亡和遷移是肺血管重建中最重要的病理生理特點。在本研究中，我們首先原代分離和培養(yǎng)了大鼠PASMC，并給予體積分數(shù)3%的低氧處理48 h后，用EDU染色法檢測細胞增殖后發(fā)現(xiàn)，3%低氧48 h后，大鼠PASMC的EDU陽性染色率顯著提高，提示低氧可促使PASMC的增殖活性增強，這與眾多學者的研究結果是一致的［6-7］。

miRNA是近年來發(fā)現(xiàn)的一類長度約21 bp的內(nèi)源性非編碼小RNA分子，可以通過誘導靶基因mRNA的降解、抑制等抑制靶基因的表達。在細胞分化、細胞增殖、細胞凋亡和腫瘤的發(fā)生及發(fā)育中扮演重要角色［8］。在缺氧環(huán)境下，microRNA的表達改變可以調(diào)節(jié)PASMC的增殖、凋亡、遷移等功能［9-12］，從而參與了HPH的形成。有些microRNA通過誘導PASMC增殖、遷移及抑制凋亡等參與了HPH的形成［13-16］，而另外還有一些microRNA則是通過抑制PASMC增殖、誘導凋亡及抑制平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化的作用防治了HPH的發(fā)生［17-18］。因此，近年來關于miRNA在HPH的發(fā)生發(fā)展中的作用成為研究和關注的熱點之一。

miR-34家族是一個保守的miRNA家族，為近年來備受關注的miRNA之一，包括miR-34a、miR-34b和miR-34c三個成員［19］。已有許多實驗證明miR-34a通過負調(diào)細胞周期蛋白、細胞增殖信號分子和凋亡抑制因子導致細胞周期終止、細胞凋亡和衰老［4］，尤其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。然而miR-34a在低氧性肺血管重建中的研究甚少。因此，在本研究中，我們首先在缺氧條件下觀察了大鼠PASMC中miR-34a的表達情況。結果顯示，低氧后大鼠PASMC中miR-34a的表達明顯降低，尤其低氧48 h后，降低更明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），這與Wang等［20］的研究結果是一致的。因此，我們的結果提示在低氧下PASMC中miR-34a的下調(diào)可能參與了低氧誘導的PASMC的增殖。

Notch1是與細胞增殖密切相關的基因，已被證實為是miR-34a的靶基因之一［5］，miR-34a 通過與Notch1基因3′-UTRs區(qū)的結合位點相結合來發(fā)揮負性調(diào)控作用。由此，我們推測miR-34a可能在HPH肺血管重構調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用，而且是通過對Notch1的負性調(diào)控來發(fā)揮作用的。我們在缺氧條件下觀察了大鼠PASMC中Notch1 mRNA水平的表達情況。結果顯示，將原代培養(yǎng)的大鼠PASMC給予3%的低氧處理24和48 h后，PASMC中Notch1 mRNA的表達水平明顯增高，尤其在低氧48 h后，Notch1在PASMC中的表達增高更明顯，統(tǒng)計學有顯著性差異（P＜0.05），說明Notch1參與了低氧誘導的PASMC增殖過程，可能是由miR-34a的低表達負性調(diào)控了Notch1的表達，使低氧下PASMC中Notch1的mRNA水平表達顯著增高從而引起PASMC的增殖。為了進一步明確是否通過這一調(diào)控通路發(fā)揮作用，我們又用miR-34a模擬物和抑制劑分別過表達和抑制miR-34a及用RNA干擾技術沉默靶基因Notch1后觀察低氧誘導下的PASMC的細胞增殖情況。我們的研究結果顯示，過表達miR-34a及沉默Notch1基因后，低氧誘導的PASMC的增殖明顯被抑制，而用miR-34a抑制劑后PASMC細胞則顯著增殖。我們又進一步檢測了各處理組細胞中PCNA的表達，結果發(fā)現(xiàn)對大鼠PASMC給予3%的低氧刺激并過表達miR-34a或者抑制Notch1的表達后，細胞中PCNA的表達量明顯降低，而給予miR-34a抑制劑后細胞中PCNA的表達是顯著升高。這一結果提示在低氧誘導的PASMC細胞增殖過程中miR-34a參與了PASMC的增殖過程，且可能是通過上調(diào)Notch1引起了細胞增殖，其機制有待于進一步的研究。