林玫，甄海寧，何芳，丁敏，陳亞雋，袁竹青，薛欣欣，鮑敏

[武漢大學(xué)附屬同仁醫(yī)院（武漢市第三醫(yī)院） 呼吸內(nèi)科，湖北 武漢 430060]

目前抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor, NFκB）的活性已成為治療哮喘氣道炎癥的新靶點(diǎn)。醛糖還原酶（aldose reductase, AR）受到環(huán)境中的炎癥刺激后，表達(dá)明顯升高，繼而轉(zhuǎn)錄因子NF-κB被激活，其下游炎癥介質(zhì)釋放，促進(jìn)炎癥的病理過(guò)程[1]。醛糖還原酶抑制劑（aldose reductase inhibitors, ARI）可以阻斷依賴NF-κB的炎癥信號(hào)，提示ARI對(duì)炎癥反應(yīng)有調(diào)控作用[2]。但屋塵螨誘導(dǎo)氣道炎癥的影響研究甚少。為此，筆者擬探討ARI對(duì)屋塵螨誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞炎癥因子的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器Hettich UNIVERSAL 32R臺(tái)式離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司），微量加樣器、微量加樣管均購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司，垂直流超凈工作臺(tái)（上海智城分析儀器制造有限公司），恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱（上海姚氏儀器設(shè)備廠），熱循環(huán)儀（德國(guó)Eppendorf公司），酶標(biāo)儀（德國(guó)Satorius公司），Nandrop分光光度計(jì)（德國(guó)Eppendorf公司），恒溫?fù)u床（美國(guó)New Brunswich Scientific公司），蛋白電泳儀（北京六一生物科技有限公司）。

1.1.2 主要試劑健康人支氣管上皮細(xì)胞16-HBE（武漢大風(fēng)生物科技有限公司），RPMI 1640培養(yǎng)液（美國(guó)Invitrogen公司）、胎牛血清（美國(guó)Invitrogen公司），屋塵螨抗原（Horsholm，Denmark，丹麥ALK公司），焦碳酸二乙酯（diethy pyrocarbonate，DEPC）（廣州索沃生物技術(shù)公司），RNA提取試劑盒（日本TaKaRa公司），逆轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV-RT）、引物均購(gòu)自上海英駿生物工程有限公司，PCR試劑盒（日本TaKaRa公司），ELISA試劑盒（武漢谷歌生物科技有限公司），核蛋白提取試劑盒（南京凱基生物科技有限公司），醛糖還原酶抑制劑唑泊司他（Zopolrestat）（美國(guó)Pfizer 公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)將復(fù)蘇后的16-HBE細(xì)胞置于25 cm2培養(yǎng)瓶中，用含12%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，置培養(yǎng)瓶于37℃、5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱中，每日更換培養(yǎng)液。倒置顯微鏡下可見細(xì)胞呈不規(guī)則多邊形，待90%培養(yǎng)瓶底被細(xì)胞呈鵝卵石樣鋪滿后，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。換液1次/d，約2 d后傳代。按l∶2～1∶4的比例將其分瓶傳代培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合至90%～95%后，將細(xì)胞消化，并用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，傳至6孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入密度為2×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液2 ml，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，建立細(xì)胞模型及相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞分組培養(yǎng)板中的細(xì)胞分為空白對(duì)照組、屋塵螨組、屋塵螨+Zopol組和Zopol組，每組分別置于12個(gè)培養(yǎng)孔中培養(yǎng)。選擇既不影響細(xì)胞活性，也有顯著抑制效應(yīng)的濃度，屋塵螨+Zopol組以50μmol/L 的濃度加入Zopol，并加入屋塵螨共同培養(yǎng)24 h；Zopol組以50μmol/L的濃度加入Zopol，但不加入屋塵螨；空白對(duì)照組不加入刺激物，培養(yǎng)24 h。屋塵螨組加入屋塵螨刺激，培養(yǎng)24 h。

1.2.3 提取核蛋白收集細(xì)胞，棄掉培養(yǎng)液，以預(yù)冷的磷酸鹽緩沖溶液洗滌2遍；用移液槍吸去上清液；每毫升Buffer A中加入5μl 100 mmol/L PMSF、1μl蛋白酶抑制劑、1μl二硫蘇糖醇，根據(jù)細(xì)胞壓積，按體積比行細(xì)胞壓積∶Buffer A為1.0∶1.5，加入上述準(zhǔn)備好的預(yù)冷的150μl Buffer A，以最大轉(zhuǎn)速進(jìn)行渦旋劇烈振蕩15 s，并置于冰上10 min；加入12.5μl Buffer B，快速震蕩混勻，放置冰上1 min后，于4℃、16 000 r/min離心30 s。收集上清至新的離心管。于每毫升Buffer C中加入1μl蛋白酶抑制劑、5μl 100 mmol/L PMSF、1μl二硫蘇糖醇，在離心沉淀物中加入上述準(zhǔn)備好的預(yù)冷的100μl Buffer C，以最大轉(zhuǎn)速進(jìn)行渦旋劇烈振蕩15 s，并置于冰上30 min，每間隔10 min進(jìn)行渦旋劇烈振蕩15 s；4℃、16 000 r/min離心10 min，把上清轉(zhuǎn)入預(yù)冷的離心管；以考馬斯亮藍(lán)G-250染料，進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定，并保存于-80℃，應(yīng)避免反復(fù)凍融。

1.2.4 Western blotting取出聚丙烯酰胺凝膠電泳，裝入電泳槽，再加入電泳緩沖液；將蛋白樣品與5×十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠加樣緩沖液相混合，再按照上樣順序進(jìn)行點(diǎn)樣，使樣本濃度及體積保持一致；對(duì)應(yīng)正負(fù)極蓋上蓋子，紅對(duì)紅，黑對(duì)黑，將電壓調(diào)整至80 V，進(jìn)行電泳；氣泡出現(xiàn)指示電泳開始，待蛋白樣品電泳至下層分離膠時(shí)暫停電泳，將電壓調(diào)至120 V繼續(xù)電泳；等溴酚藍(lán)電泳到分離膠底部時(shí)，停止電泳。將裁剪掉右上角的聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride, PVDF）泡入甲醇中待用；在容器中倒入預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液，將轉(zhuǎn)膜夾和海綿完全浸入轉(zhuǎn)膜緩沖液中，并將濾紙和用甲醇活化的PVDF膜一起放入轉(zhuǎn)膜液中10 min；取出電泳完的凝膠玻璃板，切割目的蛋白所在區(qū)域凝膠；將目的蛋白凝膠置于濾紙上，并用轉(zhuǎn)膜液潤(rùn)濕，將PVDF膜置于凝膠之上，趕出氣泡，蓋上濾紙，防止引入氣泡；合上轉(zhuǎn)膜夾，將轉(zhuǎn)膜夾對(duì)應(yīng)正負(fù)極放入轉(zhuǎn)膜槽，電極方向?yàn)槟ふz負(fù)，使夾的黑面對(duì)著槽的黑面，且夾的白面對(duì)著槽的紅面；放入冰盒，灌滿轉(zhuǎn)膜液，對(duì)應(yīng)正負(fù)極蓋上蓋子，于200 mA進(jìn)行轉(zhuǎn)膜60 min。在室溫下將PVDF膜正面朝上放入含5%脫脂奶粉的TBST封閉液，搖床上封閉孵育1 h；把一抗（兔抗小鼠NF-κB/p65多克隆抗體，兔抗小鼠Histone H3抗體）以含0.5%脫脂奶粉的TBST抗體稀釋液按1∶1 000稀釋；取出膜并放于已經(jīng)加好一抗的小塑料袋中；室溫下把膜置于搖床上一抗孵育1 h；取出膜，TBST溶液中洗滌，每次10 min，重復(fù)漂洗3次。用抗體稀釋液以1∶6 000稀釋二抗（辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔免疫球蛋白G）， 把膜移到已經(jīng)加好二抗溶液的小塑料袋中，于室溫、搖床上二抗孵育1 h；取出膜并用TBST溶液洗滌 3次，每次10 min。經(jīng)過(guò)顯影、定影，將圖像輸入電腦，應(yīng)用圖像分析軟件對(duì)Western blotting檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，以Histone H3蛋白作為對(duì)照，各組中NF-κB/p65蛋白的面積灰度值與Histone H3蛋白的比值即表達(dá) 強(qiáng)度。

1.2.5 提取細(xì)胞總RNA吸去各6孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)液，然后在每孔中加入1 ml Trizol，室溫放置5 min，使其充分裂解，收集至去RNA酶的1.5 ml EP管中；12 000 r/min離心5 min，棄去沉淀；加入氯仿0.2 ml，震蕩15 s，靜置于室溫15 min；4℃、12 000 r/min離心15 min；將上層水相轉(zhuǎn)至另一EP管中，加入異丙醇0.5 ml，顛倒混勻，室溫下靜置10 min；于4℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清，RNA沉淀沉于管底；加入75%乙醇lml（用0.1% DEPC水配置），震蕩混勻；4℃、8 000r/min離心5 min，棄上清，于室溫下自然風(fēng)干RNA沉淀5～10 min，不要讓RNA過(guò)度干燥；加DEPC水40μl，置60℃水浴箱5 min，使RNA溶解。在Nandrop分光光度計(jì)上測(cè)定RNA濃度和 純度。

1.2.6 逆轉(zhuǎn)錄將RNA模板、引物、dNTPmix、RNA酶抑制劑、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RT Buffer及RNase-Free Water溶解并置于冰上備用。根據(jù)以下配比配制反應(yīng)體系：dNTPmix 4μl、Primer 2μl、RNA模板2μg、5×RT Buffer 4μl、RNA酶抑制劑2μl、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶1μl及RNase-Free Water補(bǔ)充反應(yīng)體積至20μl。渦旋震蕩混勻，短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底。42℃孵育50 min，72℃孵育5 min，反應(yīng)結(jié)束后，短暫離心，置于冰上冷卻，置于-20℃條件下保存。

1.2.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCRPCR反應(yīng)體系：2×Ultra SYBR Mixture（TaqDNA聚合酶和dNTPs）10μl，正向引物（10μmol/L）0.4μl，反向引物（10μmol/L）0.4μl，DNA模板0.8μl，RNase-Free Water 8.4μl，總體積20μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火1 min，后2步重復(fù)40個(gè)循環(huán)；熔解曲線分析程序：95℃ 15 s，61℃ 55 s，95℃ 15 s。NF-κB/p65正向引物：5’-ATGTGGAGATCATTGAGCAGC-3’，反向引物：5'-CCTGGTCCTGTGTAGCCATT-3'。反應(yīng)結(jié)束后用熔解曲線分析PCR產(chǎn)物的特異性，排除引物二聚體的存在。將目的基因Ct值用GAPDH的Ct值標(biāo)準(zhǔn)化，用2-△△Ct表示基因表達(dá)的相對(duì)量?！鳌鰿t=（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）實(shí)驗(yàn)組-（Ct目的基因一Ct內(nèi)參基因）對(duì)照組。為進(jìn)一步觀察產(chǎn)物的表達(dá)情況，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠 電泳。

1.2.8 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-1inked immunosorbent assay, ELISA）以ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液中IL-29、IL-6的濃度。配制好不同濃度IL-29/IL-6的標(biāo)準(zhǔn)品，加50μl待測(cè)的細(xì)胞上清液或標(biāo)準(zhǔn)品于酶標(biāo)板上，每孔加入50μl抗IL-29/IL-6抗體，使之震蕩混勻；酶標(biāo)板于37℃孵育2 h；洗滌4次；每孔加入100μl酶標(biāo)試劑，于室溫孵育30 min；洗滌4次；每孔加入100μl底物顯色液，于室溫下，避光孵育30 min后顯色；加入100μl終止反應(yīng)液，將反應(yīng)板置于多功能酶標(biāo)儀中，測(cè)定各孔于450 nm波長(zhǎng)處的光密度值，并計(jì)算其濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué) 意義。

2 結(jié)果

2.1 各組NF-κB/p65 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

各組NF-κB/p65 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F =160.580，P =0.000）；屋塵螨+Zopol組低于屋塵螨組（P ＜0.05），但高于空白對(duì)照組（P ＜0.05），Zopol組與空白對(duì)照組NFκB/p65 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見表1和圖1。

2.2 各組NF-κB/p65蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

各組NF-κB/p65蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F =229.181，P =0.000）；屋塵螨+Zopol組低于屋塵螨組（P ＜0.05），但高于空白對(duì)照組（P ＜0.05），Zopol組與空白對(duì)照組NF-κB/p65蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見表1和圖2。

圖1 各組細(xì)胞NF-κB/p65 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

表1 各組細(xì)胞NF-κB/p65相對(duì)表達(dá)量比較 （n =12，±s）

表1 各組細(xì)胞NF-κB/p65相對(duì)表達(dá)量比較 （n =12，±s）

組別NF-κB/p65 mRNANF-κB/p65蛋白空白對(duì)照組1.110±0.2110.271±0.043屋塵螨組3.243±0.3821.125±0.145屋塵螨+Zopol組2.016±0.258 0.658±0.098 Zopol組1.105±0.218 0.265±0.042

圖2 各組細(xì)胞NF-κB/p65核蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

2.3 各組IL-6、IL-29蛋白水平比較

各組細(xì)胞上清液的IL-6、IL-29蛋白水平的比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F =169.729和118.681，均P =0.000）；屋塵螨+Zopol組低于屋塵螨組（P ＜0.05），但高于空白對(duì)照組（P ＜0.05），Zopol組與空白對(duì)照組IL-6蛋白水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見表2和 圖3。

表2 各組IL-6、IL-29蛋白水平比較 （n =12，pg/ml，±s）

表2 各組IL-6、IL-29蛋白水平比較 （n =12，pg/ml，±s）

組別IL-6IL-29空白對(duì)照組103.916±15.85955.083±13.534屋塵螨組300.000 ±37.033158.833±20.630屋塵螨+Zopol組201.000±25.193103.475±12.409 Zopol組102.791±15.66454.166±15.278

圖3 各組細(xì)胞上清液IL-6、IL-29蛋白水平比較 （±s）

3 討論

有研究發(fā)現(xiàn)ARI可抑制細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、高血糖、LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞毒信號(hào)及炎癥標(biāo)志物的表 達(dá)[3-4]。ARI可抑制某些過(guò)敏原誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型的氣道炎癥，進(jìn)一步肯定了ARI的抗炎作用。AR基因敲除的大鼠可耐受變應(yīng)原，在很大程度上減輕了變應(yīng)原誘導(dǎo)的肺部炎癥改變[5]。丙烯醛是一種重要的內(nèi)源性脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物。有研究結(jié)果表明，ARI可以抑制丙烯醛誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞的細(xì)胞毒性[6]。

有研究發(fā)現(xiàn)，ARI可阻止心瓣膜術(shù)后再狹窄、糖尿病并發(fā)癥及動(dòng)物模型動(dòng)脈硬化的發(fā)生[7-8]。還有研究顯示，ARI通過(guò)防止DOX誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞毒性和功能障礙，避免了與蒽環(huán)類化療相關(guān)的心臟毒性[9]。AR還參與多種炎癥疾病的病理過(guò)程，因此ARI也可能作為抗炎藥物而得到發(fā)展。

過(guò)去的研究顯示，在某些動(dòng)物和細(xì)胞模型中，ARI可以調(diào)控NF-κB介導(dǎo)的炎癥信號(hào)；并觀察到AR藥物抑制劑或基因敲除，防止了小氣道上皮細(xì)胞的凋亡及活性氧的增殖、炎癥標(biāo)志物的分泌、NF-κB的激活[10]。有研究提示依賴ARI的NF-κB的失活，減少了一些炎癥基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[11]。AR可以介導(dǎo)過(guò)敏原誘導(dǎo)的氣道重塑。AR抑制劑非達(dá)司他可以通過(guò)抑制TGFβ1誘導(dǎo)的Smad非依賴性和PI3K/AKT/GSK3β依賴性途徑，而阻斷這個(gè)氣道重塑過(guò)程[12]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，屋塵螨+Zopol組經(jīng)屋塵螨及ARI唑泊司他共同作用24 h后，人支氣管上皮細(xì)胞的NF-κB/p65 mRNA水平、NF-κB/p65蛋白水平、IL-6及IL-29蛋白水平均低于屋塵螨組。ARI唑泊司他可降低人支氣管上皮細(xì)胞NF-κB/p65的表達(dá)，并可能通過(guò)抑制NF-κB介導(dǎo)的炎癥信號(hào)通路，而減少炎癥因子IL-6和IL-29的表達(dá)。

有研究顯示，ARI明顯地減輕了氣道高反應(yīng)性、免疫球蛋白E的水平，嗜酸性細(xì)胞的浸潤(rùn)，以及氣道Th2細(xì)胞因子的釋放[13-14]，另外，也有實(shí)驗(yàn)顯示，經(jīng)卵清蛋白刺激的小鼠，其氣道炎癥細(xì)胞的遷移及炎癥細(xì)胞因子、趨化因子、杯狀細(xì)胞化生、膠原沉積及氣道高反應(yīng)性可以被ARI抑制，提示ARI可能提供一個(gè)新的治療途徑應(yīng)對(duì)哮喘這類氣道炎癥疾病。ARI非達(dá)司他處理的小鼠，接觸過(guò)敏原后如鼻劃痕，肥大細(xì)胞脫顆粒，在鼻通道釋放類胰蛋白酶等的早期反應(yīng)，與對(duì)照組比較，明顯減弱，且后期反應(yīng)如炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、Th2型細(xì)胞因子的釋放、鼻上皮重塑等均明顯減弱，提示了ARI對(duì)過(guò)敏性鼻炎的療效[15]。

綜上所述，唑泊司他調(diào)控了屋塵螨誘導(dǎo)的NF-κB介導(dǎo)的炎癥信號(hào)，明顯地抑制了氣道上皮NF-κB的表達(dá)及其下游炎癥因子的表達(dá)，深入研究ARI，可能為屋塵螨引起的氣道炎癥的治療提供新的方向。