劉星驗(yàn)，張斌，馬竟，陳健

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 口腔頜面外科，遼寧 錦州 121000；2.葫蘆島市第二 人民醫(yī)院，遼寧 葫蘆島 125000）

舌癌是最常見的口腔癌[1]，有較強(qiáng)的局部浸潤(rùn)性和轉(zhuǎn)移率高等特點(diǎn)，可導(dǎo)致咀嚼、言語(yǔ)和吞咽等功能失常，甚至有死亡的風(fēng)險(xiǎn)。舌癌對(duì)放射的敏感性不高，臨床上主要是手術(shù)治療，積極探討放療增敏的新方法成為研究熱點(diǎn)之一[2]。吉西他濱（Gemcitabine, GEM）是脫氧胞苷的水溶性類似物[3]，具有放射增敏作用強(qiáng)，毒副作用較小的特點(diǎn)[4]。本研究以GEM聯(lián)合放療作用于舌鱗癌Tca8113細(xì)胞，研究其對(duì)Tca8113細(xì)胞放射敏感性的影響及可能的作用機(jī)制，為舌癌的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞舌鱗癌Tca8113細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所。

1.1.2 試劑GEM購(gòu)于美國(guó)ApexBio公司，DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購(gòu)于美國(guó)HyClone公司，二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide, DMSO）購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司，鏈霉素/青霉素（雙抗）、四甲基偶氮唑藍(lán)（ttihiazoly blue, MTT）購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司，胎牛血清購(gòu)于杭州四季青公司，流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)Tca8113細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37.0℃、5%二氧化碳CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中，定期傳代、換液，取對(duì)數(shù)期Tca8113細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT法測(cè)定取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Tca8113細(xì)胞，消化、重懸、計(jì)數(shù)后置于96孔板內(nèi)，5×103個(gè)/孔細(xì)胞，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，測(cè)量重復(fù)3次。細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度GEM（0.000、0.001、0.010、0.020、0.030、0.100及1.000μmol/L）完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后終止培養(yǎng)，每孔加入質(zhì)量濃度為5 mg/ml的MTT 20μl，37℃條件下孵育4 h。棄上清液，每孔加入150μl DMSO。搖床上震蕩10 min，使用多功能酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度（optical density, OD）值。以O(shè)D值顯示實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以濃度為橫坐標(biāo)，細(xì)胞存活率為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。據(jù)此計(jì)算出GEM對(duì)Tca8113細(xì)胞增殖的影響，選定最佳濃度進(jìn)行后續(xù) 實(shí)驗(yàn)。

取Tca8113細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，每孔細(xì)胞數(shù)為5×103個(gè)，將其分為空白對(duì)照組、GEM組（0.02μmol/L）、單純放療組（4 Gy）、GEM（0.02μmol/L）聯(lián)合放療組（4 Gy）。處理24 h，用MTT法明確最佳照射劑量。

1.2.3 平板克隆實(shí)驗(yàn)將1×103個(gè)Tca8113細(xì)胞接種在6孔板中，待細(xì)胞貼壁后棄培養(yǎng)液分為空白對(duì)照組、GEM組、單純放療組、GEM聯(lián)合放療組。加入GEM處理細(xì)胞24 h，暴露于4 Gy照射，繼續(xù)在孵箱中孵育10～14 d，棄培養(yǎng)液，洗滌、固定及染色后，計(jì)數(shù)各孔集落數(shù)（≥50個(gè)細(xì)胞為1個(gè)集落）。計(jì)算各組細(xì)胞克隆率。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)將Tca8113細(xì)胞用0.02μmol/L GEM處理24 h后，4 Gy照射或不予處理，與空白對(duì)照組比較。5 min離心1 500 r/min收集懸浮細(xì)胞。貼壁細(xì)胞用胰蛋白酶消化，磷酸鹽緩沖液漂洗細(xì)胞2次，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)、離心，收集1×105～3×105個(gè)細(xì)胞，將收集的細(xì)胞重懸于150μl染色溶液中，加入5μl Annexin V-FITC混勻后，加入10μl Propidium Iodide混勻，室溫避光反應(yīng)5～15 min。應(yīng)用流式細(xì)胞儀測(cè)量細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 Western blotting0.02μmol/L GEM處理Tca8113細(xì)胞24 h后，吸出培養(yǎng)液，放療繼續(xù)作用細(xì)胞24 h，Western blotting檢測(cè)各組Tca8113細(xì)胞中Bax、Bcl-2、 Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9蛋白的表達(dá)水平。收集空白對(duì)照組、GEM組、單純放療組和GEM聯(lián)合放療組的細(xì)胞，胰酶消化后將收集的細(xì)胞離心并重懸于裂解緩沖液中。冰上孵育30 min后，提取澄清勻漿4℃、12 000 r/min離心20 min。BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)各組蛋白濃度。10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，300 mA濕轉(zhuǎn)90 min，室溫下使用5%脫脂牛奶封閉2 h，加入相應(yīng)稀釋比例的一抗孵育過(guò)夜，洗膜后室溫下孵育二抗1 h，化學(xué)發(fā)光法顯影、定影后掃描分析。采用Image J圖像分析軟件分析灰度值，計(jì)算出樣本蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT測(cè)定結(jié)果

2.1.1 GEM對(duì)Tca8113細(xì)胞活力的抑制作用不同濃度GEM（0.000、0.001、0.010、0.020、0.030、0.100及1.000μmol/L）作用時(shí)細(xì)胞存活率分別為（100.00±0.00）%、（98.59±0.20）%、（95.46±0.08）%、（94.79±0.08）%、（93.95±0.24）%、（91.77±0.54）%及（73.90±2.98）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F =171.025，P =0.000）；與0.000μmol/L組比較，GEM濃度為0.010、0.020、0.030、0.100、1.000μmol/L時(shí)細(xì)胞存活率降低（P ＜0.05）。見圖1。

圖1 Tca8113細(xì)胞在不同濃度時(shí)的細(xì)胞存活率曲線

2.1.2 GEM對(duì)放療的增敏作用空白對(duì)照組、GEM組、單純放療組和GEM聯(lián)合放療組細(xì)胞存活率分別為（100.00±0.00）%、（84.83±1.78）%、（80.64±1.44）%和（73.95±1.24）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F =214.368，P =0.000）；與空白對(duì)照組比較，其他各組細(xì)胞存活率降低（P ＜0.05）；與單純放療組比較，GEM聯(lián)合放療組細(xì)胞存活率降低（P ＜0.05）。見 圖2。

圖2 各組Tca8113細(xì)胞存活率比較 （±s）

2.2 GEM聯(lián)合放療對(duì)Tca8113細(xì)胞集落形成的影響

放射劑量選定4 Gy，空白對(duì)照組、GEM組、單純放療組和GEM聯(lián)合放療組克隆形成率分別為（33.83±1.15）%、（28.46±1.42）%、（15.50±1.10）%和（0.00±.00）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F =593.548，P =0.000）；與單純放療組比較，GEM聯(lián)合放療組克隆形成率降低（P ＜0.05），幾乎處于靜止期。見圖3。

2.3 GEM增強(qiáng)射線誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照組、GEM組、單純放療組和GEM聯(lián)合放療組細(xì)胞凋亡率分別為（0.03±0.01）%、（5.68±0.18）%、（6.54±0.23）%和（28.63±0.38）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F =7959.927，P =0.000）。與空白對(duì)照組比較，GEM組和單純放療組的Tca8113細(xì)胞發(fā)生凋亡（P ＜0.05）；兩者聯(lián)用后較單純放療組凋亡率升高（P ＜0.05），說(shuō)明GEM能增強(qiáng)放療對(duì)Tca8113細(xì)胞的敏感性。見圖4。

2.4 Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-9及Cleaved Caspase-3蛋白的表達(dá)水平

圖3 各組Tca8113細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)細(xì)胞集落形成圖

圖4 GEM聯(lián)合放療對(duì)Tca8113細(xì)胞凋亡的影響

各組細(xì)胞中Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；與空白對(duì)照組比較，GEM組、單純放療組和GEM聯(lián)合放療組中Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量降低（P ＜0.05），Bax、Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9蛋白相對(duì)表達(dá)量升高（P ＜0.05）；GEM聯(lián)合放療組中Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量較單純放療組和GEM組降低（P ＜0.05）；GEM聯(lián)合放療組中Bax、Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9蛋白相對(duì)表達(dá)量較單純放療組和GEM組升高（P ＜0.05）。線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)增強(qiáng)或減弱可能是GEM提高放療誘導(dǎo)舌鱗癌Tca8113細(xì)胞凋亡作用的機(jī)制之一。見表1和圖5。

表1 各組細(xì)胞中Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9蛋白的表達(dá)水平比較 （±s）

表1 各組細(xì)胞中Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9蛋白的表達(dá)水平比較 （±s）

組別Bcl-2BaxCleaved Caspase-3Cleaved Caspase-9空白對(duì)照組0.949±0.0020.347±0.0370.597±0.0150.040±0.007 GEM組0.904±0.0000.591±0.0111.113±0.0740.125±0.005單純放療組0.883±0.0030.802±0.0071.519±0.0300.147±0.006 GEM聯(lián)合放療組0.787±0.0040.892±0.0042.060±0.0530.523±0.014 F值1 549.012437.764479.0141 651.308 P值0.0000.0000.0000.000

圖5 Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)的變化

3 討論

舌癌是惡性程度極高的口腔癌，放療是提高生存率的重要治療手段之一。既往研究發(fā)現(xiàn)，GEM能提高乏氧細(xì)胞對(duì)放射線的敏感性，抑制DNA合成，從而達(dá)到抗腫瘤作用[5]。本實(shí)驗(yàn)旨在研究GEM聯(lián)合放療時(shí)，提高對(duì)Tca8113細(xì)胞增殖的抑制、凋亡的能力，從而起到放療增敏作用的機(jī)制。

有研究表明，GEM對(duì)胰腺癌細(xì)胞的增殖有抑制作用，且呈濃度依賴性[6]。本實(shí)驗(yàn)得出相類似的結(jié)果，在此基礎(chǔ)上將放療與GEM聯(lián)合作用于Tca8113細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)GEM聯(lián)合放療組比單純放療組細(xì)胞存活率低?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果說(shuō)明，GEM對(duì)Tca8113細(xì)胞具有放射增敏作用。

線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性途徑為細(xì)胞凋亡早期的重要途徑[7-8]。本實(shí)驗(yàn)選取線粒體途徑相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9作為監(jiān)測(cè)指標(biāo)，進(jìn)一步探究GEM增強(qiáng)Tca8113細(xì)胞的放射敏感性。在線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑中[9]，Bax為線粒體上的一種跨膜因子，在凋亡信號(hào)的誘導(dǎo)下，Bax轉(zhuǎn)移到線粒體外膜處，促進(jìn)線粒體膜通透性的改變，釋放的細(xì)胞色素C能與Caspase-9形成凋亡小體，Caspase-9自我活化后再激活Caspase-3，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。LI等[10]發(fā)現(xiàn)，GEM作用于人胰腺癌CFPAC-1細(xì)胞系后，抑制Bcl-2蛋白的表達(dá)，即Bax/Bcl-2比率升高，兩者形成同二聚體，降低線粒體跨膜電位。隨著Ca2+濃度升高，激活啟動(dòng)因子Caspase-9，進(jìn)一步誘導(dǎo)“死亡蛋白酶”、Caspase-3，進(jìn)而引起細(xì)胞走向凋亡。研究表明，經(jīng)GEM聯(lián)合放療處理的胰腺癌BXPC-3細(xì)胞出現(xiàn)Bax基因表達(dá)升高，Bcl-2基因表達(dá)降低，這些細(xì)胞表現(xiàn)出更高的放射敏感性[11]。本實(shí)驗(yàn)研究GEM聯(lián)合放療作用于舌鱗癌Tca8113細(xì)胞得出類似結(jié)果，與單純放療組比較，GEM聯(lián)合放療組可通過(guò)誘導(dǎo)舌癌Tca8113細(xì)胞中Bcl-2蛋白，使Bcl-2蛋白表達(dá)水平下降，Bax蛋白表達(dá)則升高。Caspase-3是Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)中發(fā)揮凋亡作用的執(zhí)行者，Caspase-3通常以酶原的形式存在，活化后形成C1eaved Caspase-3發(fā)揮凋亡作用[12]。本實(shí)驗(yàn)中，GEM聯(lián)合放療組中C1eaved Caspase-9、C1eaved Caspase-3蛋白表達(dá)比單純放療組更顯著，與Bcl-2表達(dá)變化相反。筆者推測(cè)，GEM聯(lián)合放療可以通過(guò)線粒體介導(dǎo)內(nèi)源性途徑誘導(dǎo)Tca8113細(xì)胞的凋亡，增加放射敏感性，這與WOUTERS等[13]研究結(jié)果一致。

綜上所述，GEM具有增強(qiáng)放療誘導(dǎo)Tca8113細(xì)胞凋亡的能力，可提高舌癌的放射敏感性。其主要機(jī)制可能是促進(jìn)Bax基因的表達(dá)，抑制Bcl-2進(jìn)而激活Caspase-9，活化Caspase-3，下游底物剪切被激活，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。