李福智，侯陽(yáng)

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院 胸外科，遼寧 錦州 121001；2.錦州醫(yī)科大學(xué) 生命科學(xué)研究院，遼寧 錦州 121001）

近年來(lái)國(guó)內(nèi)學(xué)者確認(rèn)了人參具有改善糖尿病、保護(hù)心肌組織等作用[1-2]。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)人參莖葉總皂苷能改善小鼠實(shí)驗(yàn)性肺纖維化，對(duì)博來(lái)霉素所致的小鼠肺纖維化具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與其抑制氧化損傷有關(guān)[3]。本課題探討人參莖葉總皂苷對(duì)腎上腺素（Adrenaline, AD）致家兔肺水腫的作用及 機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

普通級(jí)家兔，體重2～3 kg，雌雄各半，由錦州醫(yī)科大學(xué)提供[SCXK（遼）2017-0002]。人參莖葉總皂苷（純度82%，遼寧新賓制藥有限公司），AD（上海禾豐制藥有限公司），氨基甲酸乙酯（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）及丙二醛（Malondialdehyde, MDA）試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，C/EBPα、mTOR及S6K1抗體均購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司，SirT1、NLRP3抗體購(gòu)自沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技有限公司，兔二步法檢測(cè)試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。BL-420生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)、張力換能器購(gòu)自成都泰盟軟件有限公司，石蠟切片機(jī)（德國(guó)萊卡公司），F(xiàn)ACS Calibur流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD 公司）。

1.2 藥物干預(yù)及取材

將18只家兔隨機(jī)分成對(duì)照組、模型組和治療組，每組6只。家兔稱重后，常規(guī)麻醉（質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%氨基甲酸乙酯4 ml/kg耳緣靜脈注射）、固定，行氣管插管，并與BL-420生物信號(hào)采集系統(tǒng)連接，記錄呼吸變化。對(duì)照組：灌胃等體積生理鹽水。模型組：灌胃等體積生理鹽水，30 min后耳緣靜脈注射AD 1 mg/只，復(fù)制AD肺水腫模型，觀察30 min。治療組：以50 mg/kg灌胃人參莖葉總皂苷，連續(xù)7 d，末次給藥30 min后耳緣靜脈注射AD 1 mg/只，并觀察30 min。觀察完畢，處死家兔，取肺臟觀察并稱量其濕重，計(jì)算肺系數(shù)=肺濕重（g）/體重（kg）×100%。取肺組織，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)SOD、MDA。

1.3 病理學(xué)觀察

常規(guī)石蠟切片和蘇木精-伊紅染色。參照王寶娟 等[4]的方法對(duì)肺組織進(jìn)行病理?yè)p傷評(píng)分。采用免疫組織化學(xué)SP檢測(cè)C/EBPα蛋白在石蠟包埋標(biāo)本的表達(dá)情況。按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，以磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline, PBS）代替一抗作為陰性 對(duì)照。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)

取肺組織，用眼科剪將組織剪碎、勻漿，使用移液槍反復(fù)吹散，直至無(wú)明顯的組織塊，經(jīng)100目篩網(wǎng)過(guò)濾后，1 500 r/min離心3 min，除去上清，連續(xù)3次后棄上清。按1∶100稀釋mTOR和S6K1一抗，每管加入75μl，室溫孵育30～60 min。加入500μl PBS洗滌2次，所有管內(nèi)加入l∶100稀釋的75μl Cy3標(biāo)記的熒光二抗，室溫孵育20～30 min。加入500μl PBS洗滌2次待測(cè)。流式細(xì)胞儀激光管預(yù)熱30 min，用熒光微球調(diào)整儀器。以對(duì)照管為空白定標(biāo)，計(jì)算1×104個(gè)細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀配套軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)讀取和分析，記錄標(biāo)本mTOR和S6K1蛋白的 表達(dá)。

1.5 Western blotting

取肺組織放入液氮研磨，加入500μl裂解液與磷酸酶抑制劑混合液（100∶1）充分裂解。用聚氰基丙烯酸正丁酯試劑盒檢測(cè)樣品蛋白濃度。轉(zhuǎn)膜后 Western blotting封閉液封閉30 min。一抗4℃孵育過(guò)夜，二抗孵育2 h，曝光顯影檢測(cè)蛋白質(zhì)。依據(jù)劉梅梅等[5]的方法計(jì)算條帶與β-actin的平均光密度比值

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用單因素或重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，進(jìn)一步的兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組肺系數(shù)、MDA和SOD含量比較

各組肺系數(shù)、MDA和SOD含量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；進(jìn)一步兩兩比較，模型組肺系數(shù)、MDA較對(duì)照組升高（P ＜0.05），SOD較對(duì)照組降低（P ＜0.05）；治療組肺系數(shù)、MDA較模型組降低（P ＜0.05），SOD較模型組升高（P ＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 各組靜脈注射AD后呼吸頻率比較

各組靜脈注射AD后呼吸頻率比較，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)的呼吸頻率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F =423.976，P =0.000）；②各組呼吸頻率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F =1229.138，P =0.000），模型組家兔靜脈注射AD后10、20及30 min的呼吸頻率高于對(duì)照組和治療組，呼吸急促表淺；③各組呼吸頻率變化趨勢(shì)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F =213.900，P =0.000）。見(jiàn)表2和 圖1。

表1 各組肺系數(shù)、MDA和SOD含量比較 （n =6，±s）

表1 各組肺系數(shù)、MDA和SOD含量比較 （n =6，±s）

組別肺系數(shù)MDA/（nmol/mg）SOD/（u/ml）對(duì)照組4.9±0.90.9±0.18.6±1.3模型組11.5±1.43.1±0.34.5±0.6治療組8.8±1.21.5±0.17.8±1.1 F值7.26635.2194.166 P值0.0060.0000.036

表2 各組靜脈注射AD后不同時(shí)間呼吸頻率比較 （n =6，次/min，±s）

表2 各組靜脈注射AD后不同時(shí)間呼吸頻率比較 （n =6，次/min，±s）

組別10 min20 min30 min對(duì)照組40.0±4.739.2±4.339.7±5.1模型組99.6±5.5133.9±6.2159.3±6.1治療組82.0±3.3119.0±4.2112.6±4.9

2.3 人參莖葉總皂苷對(duì)各組AD所致肺水腫病理學(xué)變化的影響

對(duì)照組肺組織肺泡無(wú)萎陷，無(wú)毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血及白細(xì)胞附壁，肺泡和肺間質(zhì)無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡壁無(wú)增厚現(xiàn)象；模型組見(jiàn)肺泡壁斷裂，肺泡隔明顯增寬，有塵細(xì)胞。治療組肺組織上述改變明顯減輕。C/EBPα在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均表達(dá)，陽(yáng)性染色呈現(xiàn)粗大棕黃色顆粒。對(duì)照組陽(yáng)性細(xì)胞少。模型組與對(duì)照組比較，陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)增加。治療組較模型組陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)減少。見(jiàn)圖2、3。

圖1 各組靜脈注射AD 30 min后呼吸曲線變化

2.4 各組肺組織損傷評(píng)分比較

對(duì)照組、模型組和治療組肺組織損傷評(píng)分分別為（0.7±0.1）、（4.3±0.9）和（2.6±0.6）分，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F =5.123，P =0.020）；模型組較對(duì)照組升高（P ＜0.05），治療組較模型組降低（P ＜0.05）。

2.5 各組mTOR和S6K1蛋白表達(dá)率比較

對(duì)照組、模型組和治療組mTOR蛋白表達(dá) 率分別為（3.05±0.98）%、（8.02±0.98）%和（4.36± 1.00）%，對(duì)照組、模型組和治療組S6K1蛋白表達(dá)率分別為（3.03±0.96）%、（12.44±1.08）%和（5.05±0.99）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F =6.904和25.708，P =0.007和0.000），模型組較對(duì)照組升高（P ＜0.05），治療組較模型組降低（P ＜0.05）。見(jiàn) 圖4。

圖2 肺組織切片光鏡圖 （HE×100）

圖3 肺組織CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α的切片光鏡圖 （×200）

圖4 各組mTOR和S6K1蛋白的表達(dá)

2.6 各組NLRP3和SirT1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

對(duì)照組、模型組和治療組NLRP3蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為（0.41±1.01）、（0.83±1.09）和（0.70±0.98），SirT1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為（0.51±0.05）、（0.32± 0.02）和（0.55±0.06），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F =4.810和6.768，P =0.024和0.008），模型組NLRP3蛋白相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組升高（P ＜0.05），SirT1蛋白相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組降低（P ＜0.05），治療組NLRP3蛋白相對(duì)表達(dá)量較模型組降低（P ＜0.05），SirT1蛋白相對(duì)表達(dá)量較模型組升高（P ＜0.05）。見(jiàn)圖5。

圖5 各組NLRP3和SirT1蛋白的表達(dá)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)復(fù)制AD致急性肺水腫家兔模型，從肺系數(shù)變化、呼吸變化和組織學(xué)來(lái)探討人參莖葉總皂苷對(duì)肺水腫的作用。本研究結(jié)果顯示，治療組的肺系數(shù)較模型組減小，家兔在靜脈注射AD后10、20及30 min呼吸頻率低于模型組，在組織學(xué)方面也有改善作用，表明人參莖葉總皂苷對(duì)家兔AD型肺水腫有一定治療效果。同時(shí)，本研究也考察了人參莖葉總皂苷對(duì)肺臟抗氧化的作用。人參莖葉總皂苷對(duì)AD所致的肺水腫具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與其抑制氧化損傷有關(guān)。與文獻(xiàn)[6-7]顯示人參莖葉總皂苷抗氧化作用一致。

C/EBPα是CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白家族的重要成員，C/EBPα對(duì)肺上皮細(xì)胞的發(fā)育和分化有重要作用[8]。關(guān)于C/EBPα與肺相關(guān)疾病的研究更多是關(guān)于肺癌方面，最近研究顯示C/EBPα抑制肺腺癌細(xì)胞侵襲和遷移[9]。本研究顯示模型組C/EBPα表達(dá)增多，而治療組則顯示C/EBPα減少，因此筆者推測(cè)人參莖葉總皂苷是通過(guò)抑制C/EBPα的表達(dá)，而降低急性肺損傷。

mTOR可以協(xié)調(diào)許多合成代謝和分解過(guò)程，也是調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與分化及蛋白質(zhì)合成關(guān)鍵信號(hào)中 樞[10]。有報(bào)道顯示，肺上皮中mTOR的活化促進(jìn)脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷[11]。人參皂苷Rh2通過(guò)調(diào)節(jié)小鼠TLR4/PI3K/AKT/mTOR、Raf-1/MEK/Erk和Keap1/Nrf2/HO-1信號(hào)通路，改善脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷[12]。mTOR/p70S6K信號(hào)通路與很多損傷研究有關(guān)。在體外氧化應(yīng)激模型中，柚皮素能降低細(xì)胞內(nèi)氧自由基的積累，提高細(xì)胞的存活率。其機(jī)制可能與激活mTOR/p70S6K信號(hào)通路、改善胰島素有關(guān)[13]。急性肺損傷病程中mTOR信號(hào)通路活化，應(yīng)用雷帕霉素可有效抑制mTOR信號(hào)通路過(guò)度活化，并能部分緩解肺組織病理?yè)p傷程度[14]。本研究提示人參莖葉總皂苷對(duì)AD所致家兔肺損傷有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制mTOR/S6K1蛋白表達(dá)有關(guān)。

有學(xué)者報(bào)道NLRP3炎性蛋白肺損傷和肺組織炎癥有關(guān)[15-16]。SIRT1抑制NLRP3炎癥小體[17]。另外，人參皂苷對(duì)NLRP3炎性體激活有抑制作用[18]。結(jié)合文獻(xiàn)[16-18]與本研究結(jié)果提示，人參莖葉總皂苷對(duì)AD所致家兔肺損傷有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與SIRT1/NLRP3蛋白表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，本研究通過(guò)動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)探討人參莖葉總皂苷對(duì)急性肺損傷的作用及C/EBPα、mTOR信號(hào)通路機(jī)制。結(jié)果顯示，人參莖葉總皂苷對(duì)AD急性肺損傷異常病理狀態(tài)有改善作用，改善肺組織氧化指標(biāo)和凋亡，可能與C/EBPα、mTOR信號(hào)及SIRT1/NLRP3通路有關(guān)。