楊勝遠(yuǎn) 林 謙 張曉寧 甄嘉儀

(1.嶺南師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，廣東 湛江 524048；2.玉林師范學(xué)院生物與制藥學(xué)院，廣西 玉林 537000)

谷氨酸脫羧酶(glutamate decarboxylase，GAD，EC4.1.1.15)可專一地催化L-谷氨酸(L-glutamic acid,L-Glu)α-羧基發(fā)生脫羧作用，在γ-氨基丁酸 (γ-aminobutyric acid,GABA)生物合成和手性物質(zhì)DL-谷氨酸(DL-glutamic acid，DL-Glu)的拆分方面具有重要作用[1-3]。由于乳酸菌具有較好的安全性，在發(fā)酵食品中已廣泛應(yīng)用，乳酸菌GAD受到了極大關(guān)注，已發(fā)現(xiàn)Lactobacillusrhamnosus[4]、Lactobacillusparacasei[5]、Lactobacillussakei[6]、Lactobacillusbrevis[7]、Streptococcussalivariusssp.thermophilus[8]、Pediococcuspentosaceus[9]、Enterococcusfaecium[10]和Lactobacillusplantarum[11]等微生物均具有GAD。然而，GAD通過催化L-Glu發(fā)生脫羧而消耗質(zhì)子，改善微生物細(xì)胞微環(huán)境pH，從而消除酸對細(xì)胞的不利影響，即GAD的主要生理功能是提高微生物的耐酸能力[12-13]。因此，野生株GAD通常表達(dá)量不高，遠(yuǎn)不能滿足工業(yè)用酶需求。同時，游離酶易受雜蛋白干擾，不能回收利用，是造成應(yīng)用成本居高不下的重要原因。固定化酶可克服游離酶的缺點，但固定化酶制備方法的實用性、酶活回收率、穩(wěn)定性和成本等問題也嚴(yán)重制約著固定化酶的應(yīng)用。因此，通過基因工程技術(shù)構(gòu)建工程菌高效表達(dá)GAD，特別是在GAD中引入對特定載體具有特異吸附的親和標(biāo)簽，實現(xiàn)低成本固定化酶生產(chǎn)，將是解決工業(yè)用酶的重要途徑。GAD基因工程菌的構(gòu)建和GAD的固定化已成為研究的焦點[14-18]。

纖維素在商業(yè)上可以以多種不同的形式存在，來源豐富，價格低廉，化學(xué)惰性，對大多數(shù)蛋白質(zhì)非特異性親和力低，是一種優(yōu)質(zhì)的載體。大多數(shù)纖維素降解酶包含3個結(jié)構(gòu)域：纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(cellulose-binding domain，CBD)、柔性連接區(qū)域和催化結(jié)構(gòu)域[19-21]，因此可利用CBD與纖維素發(fā)生特異和不可逆結(jié)合的特性，將CBD開發(fā)為親和標(biāo)簽，構(gòu)建融合蛋白，與纖維素親和吸附制備固定化酶[21-25]。如能構(gòu)建并高效表達(dá)出纖維素結(jié)合域谷氨酸脫羧酶(cellulose-binding domain-glutamate decarboxylase，CBD-GAD)融合酶，通過纖維素進(jìn)行固定化，將對GAD的應(yīng)用推廣具有很好的促進(jìn)作用。

在前期研究中，筆者[26]已經(jīng)獲得了酶學(xué)性質(zhì)良好的、GAD活性較高的屎腸球菌(Enterococcusfaecium)野生菌株，并成功構(gòu)建了可表達(dá)屎腸球菌CBD-GAD的工程菌大腸桿菌(Escherichiacoli)GDMCC60445。由于宿主菌E.coli自身存在gadB基因，可表達(dá)自身GAD，對CBD-GAD表達(dá)以及CBD-GAD活力測定均存在嚴(yán)重干擾。然而，關(guān)于如何通過針對性的測定CBD-GAD融合酶的酶活而不是GAD總酶活，探索出適宜CBD-GAD融合酶的高效表達(dá)條件，尚鮮見報道。田口試驗設(shè)計法是日本田口玄一在費(fèi)歇爾多元配制法試驗設(shè)計的基礎(chǔ)上開發(fā)的試驗技術(shù)，通過對兩批次試驗結(jié)果的均值分析和信噪比分析，能較好地預(yù)測和優(yōu)化工程條件。本試驗擬以固定化酶特異性評價CBD-GAD酶活的方法，采用田口試驗設(shè)計法對大腸桿菌高效表達(dá)屎腸球菌CBD-GAD條件進(jìn)行探討，以期為相關(guān)酶工程研究提供借鑒和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

E.coliGDMCC60445：本試驗自行構(gòu)建的可表達(dá)屎腸球菌CBD-GAD融合酶的工程菌株，作為專利菌種保藏于廣東省微生物菌種保藏中心；

γ-氨基丁酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%)、異硫氰酸苯酯(phenylisothiocyanate，PITC)和5′-磷酸吡哆醛(pyridoxal 5′-phosphate,PLP)：美國Sigma公司；

乙腈、乙酸、三乙胺：色譜純，美國TEDIA公司；

氨芐青霉素(Ampicillin，Amp)：鈉鹽，美國藥典級，生工生物工程(上海)有限公司；

其他試劑：生化試劑或分析純試劑，市售；

再生無定形纖維素(regenerated amorphous cellulose，RAC)：參照文獻(xiàn)[27]制備；

LB培養(yǎng)基(Luria-Bertani)：參照文獻(xiàn)[28]配制，略有改變，配方為胰蛋白胨10 g/L、酵母膏 5 g/L、NaCl 10 g/L、L-谷氨酸一鈉(monosodium glutamate，MSG)10 g/L、Amp 0.1 g/L，pH 7.0；

NB(nutrient broth，營養(yǎng)肉湯)培養(yǎng)基：參照文獻(xiàn)[28]配制，略有改變，配方為牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L、MSG 10 g/L、Amp 0.1 g/L，pH 7.0；

TYG(Tryptone-Yeast extract-Glucose)培養(yǎng)基：參照文獻(xiàn)[29]配制，略有改變，配方為胰蛋白胨5 g/L、酵母膏5 g/L、葡萄糖10 g/L、MSG 10 g/L、Amp 0.1 g/L，pH 7.0；

PSB(peptone-sucrose-beef extract)培養(yǎng)基：參照文獻(xiàn)[10]配制，略有改變，配方為蛋白胨15 g/L、牛肉膏10 g/L、蔗糖 12.5 g/L、乙酸鈉6 g/L、MSG 10 g/L、吐溫80 1.0 g/L、Amp 0.1 g/L，pH 7.0；

上述培養(yǎng)基按照配方配制，分裝于規(guī)格250 mL三角瓶，每瓶120 mL，121 ℃滅菌20 min，冷卻并于臨用前加入Amp。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀：1200 Series型，配置G1354A四元梯度泵、G1316A 柱溫箱、G1314B可變波長紫外檢測器、Chemstation工作站，美國安捷倫公司；

恒溫震蕩培養(yǎng)箱：HZQ-F100型，金壇市精達(dá)儀器制造有限公司；

臺式高速冷凍離心機(jī)：TGL16M型，鹽城市凱特實驗儀器有限公司；

冷凍水浴恒溫振蕩器：SHA-2型，江蘇省金壇市三和儀器有限公司；

電子分析天平：AUW120型，日本Shimadzu公司。

1.3 方法

1.3.1 粗酶液提取與RAC-CBD-GAD制備 將E.coliGDMCC60445發(fā)酵液120 mL于4 ℃、8 500 r/min 離心15 min，收集菌體，加入30 mL生理鹽水，攪拌分散洗滌菌體，再次離心收集菌體，然后加入pH 8.0、50 mmol/L Tris-HCl 緩沖液10 mL，冰水浴中400 W超聲波破碎細(xì)胞(工作5 s，冷卻5 s，全程50 min)。將細(xì)胞破碎液于8 500 r/min、4 ℃離心15 min，上清液即為粗酶提取液。取8 mL粗酶提取液與0.6 g濕RAC混合，30 ℃、50 r/min 振蕩15 min，濾出液體，即可獲得RAC固定化CBD-GAD(表示為RAC-CBD-GAD)，然后采用pH 8.0、50 mmol/L Tris-HCl緩沖液40 mL分5次洗滌RAC-CBD-GAD，再采用生理鹽水40 mL分5次洗滌RAC-CBD-GAD，抽濾去除洗滌液，即為純RAC-CBD-GAD。

1.3.2 GAD活力測定 為了減少CBD-GAD制備過程的損失和宿主菌E.coli自身基因組表達(dá)的GAD的影響所造成的誤差，本試驗通過測定RAC-CBD-GAD活力評價CBD-GAD融合酶的表達(dá)情況。

將RAC-CBD-GAD 0.2 g與pH 4.8、0.25 mol/LL-Glu溶液(溶于0.2 mol/L乙酸鹽緩沖液，含0.2 mmol/L PLP)10 mL混合，40 ℃、80 r/min水浴振蕩反應(yīng)30 min，立即吸取反應(yīng)液0.5 mL與無水乙醇0.5 mL混合終止反應(yīng)，8 500 r/min離心15 min，取上清液采用HPLC測定GABA。

GAD活力單位定義為：在上述測定條件下1 min生成1 μmol GABA所需要的酶量為1個酶活單位(U)。以單位質(zhì)量RAC-CBD-GAD所具有的GAD酶活(U/g)或以GAD酶活最高的試驗組RAC-CBD-GAD平均酶活為100%計算相對酶活(%)表示。

1.3.3 HPLC測定GABA 參照文獻(xiàn)[29]進(jìn)行測定。HPLC色譜條件為：ZORBAX Eclipse XDB C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱；檢測波長254 nm；進(jìn)樣量20 μL，柱溫25 ℃。

1.3.4 種子液的制備 吸取-25 ℃甘油保藏E.coliGDMCC60445菌種1 mL，接入LB培養(yǎng)基，37 ℃、120 r/min 振蕩培養(yǎng)12 h。

1.3.5 RAC添加量對CBD-GAD固定化的影響 將粗酶提取液8 mL分別與0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 g RAC進(jìn)行固定化制備RAC-CBD-GAD，并測定其活力。根據(jù)RAC-CBD-GAD最大總酶活對應(yīng)的RAC用量乘以安全系數(shù)3確定試驗所需RAC用量，以保證吸附載體充裕，最大限度吸附回收CBD-GAD。

1.3.6 不同培養(yǎng)基對CBD-GAD表達(dá)的影響 分別取E.coliGDMCC60445種子液2 mL接入120 mL LB培養(yǎng)基、NB培養(yǎng)基、TYG培養(yǎng)基、PSB培養(yǎng)基，37 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞，制備RAC-CBD-GAD并測定其活力。

1.3.7 MSG添加量對CBD-GAD表達(dá)的影響 分別取E.coliGDMCC60445種子液2 mL接入MSG添加量分別為0.0，2.5，5.0，7.5，10.0，12.5 g/L的120 mL、pH 5.5的LB培養(yǎng)基，37 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞，制備RAC-CBD-GAD并測定其活力。

1.3.8 Amp對CBD-GAD表達(dá)的影響 按種子液制備方法，將E.coliGDMCC60445在不含Amp的LB培養(yǎng)基中連續(xù)轉(zhuǎn)接5批次作為種子液，然后吸取2 mL接入120 mL 不含Amp的LB培養(yǎng)基，37 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞，制備RAC-CBD-GAD并測定其活力。以含0.1 g/L Amp的LB培養(yǎng)基按照同樣操作作為對照。

1.3.9 培養(yǎng)基初始pH值對CBD-GAD表達(dá)的影響 分別取E.coliGDMCC60445種子液2 mL接入120 mL 初始pH 分別為5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0的LB培養(yǎng)基，37 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞，制備RAC-CBD-GAD并測定其活力。

1.3.10 培養(yǎng)溫度對CBD-GAD表達(dá)的影響 分別取E.coliGDMCC60445種子液2 mL接入120 mL LB培養(yǎng)基，分別于31，34，37，40，43 ℃，120 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞，制備RAC-CBD-GAD并測定其活力。

1.3.11 轉(zhuǎn)速對CBD-GAD表達(dá)的影響 分別取E.coliGDMCC60445種子液2 mL接入120 mL LB培養(yǎng)基，在37 ℃分別于0，80，100，120，140 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞，制備RAC-CBD-GAD并測定其活力。

1.3.12 發(fā)酵時間對CBD-GAD表達(dá)的影響 分別取E.coliGDMCC60445種子液2 mL接入120 mL LB培養(yǎng)基，37 ℃、120 r/min分別振蕩培養(yǎng)12，24，36，48，60 h。收集細(xì)胞，制備RAC-CBD-GAD并測定其活力。

1.3.13 田口試驗設(shè)計 結(jié)合單因素試驗結(jié)果選擇LB培養(yǎng)基，以pH、胰蛋白胨和酵母膏為考察因素，采用Minitab 15軟件選擇田口試驗設(shè)計法進(jìn)行優(yōu)化。以兩批次重復(fù)試驗的結(jié)果作為響應(yīng)值，采用田口試驗分析的望大法分析均值和信噪比，從而確定各因素的最優(yōu)水平。根據(jù)單因素試驗結(jié)果，各組試驗培養(yǎng)基中均未添加MSG和Amp，NaCl添加量均為10 g/L。規(guī)格為250 mL三角瓶裝液量120 mL，121 ℃滅菌20 min。

1.3.14 數(shù)據(jù)處理與分析 利用IBM SPSS Statistics 19.0軟件采用單因素方差分析(ANOVA)的最小顯著差數(shù)法(LSD)進(jìn)行統(tǒng)計分析。圖表中英文字母相同表示兩組間差異不顯著(P>0.05)，英文字母不同表示兩組間差異顯著(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 RAC添加量對CBD-GAD固定化的影響

當(dāng)大腸桿菌存在外源酶的同工酶時，由于酶活測定無法區(qū)分同工酶的各自活力，對外源酶的高效表達(dá)條件研究造成非常大的困擾，無從確定優(yōu)化的結(jié)果是有利于自身的天然酶表達(dá)還是有利于外源酶的表達(dá)。雖然在理論上，可采用宿主菌作為對照，以工程菌表達(dá)的同工酶的總酶活扣除宿主菌表達(dá)的天然酶的酶活，作為工程菌表達(dá)的外源酶的酶活，但是轉(zhuǎn)化了外源酶的重組質(zhì)粒后，質(zhì)粒對宿主菌天然酶基因的表達(dá)是否具有影響尚未知，因此以宿主菌作為對照，研究外源酶的表達(dá)條件并不可取。由于RAC對含有CBD的融合酶具有很強(qiáng)的特異性吸附性能，因此本試驗先采用RAC將CBD-GAD與大腸桿菌自身的GAD天然酶和其他雜蛋白分離，再通過測定固定化酶RAC-CBD-GAD活性，可解決E.coli的GAD天然酶對酶活力測定的干擾。但是，由于表達(dá)條件優(yōu)化中不同條件下CBD-GAD的量存在差異，因此必須具有充足的RAC以保證能最大限度地將不同批次的粗酶液CBD-GAD完全吸附。

從圖1可見，當(dāng)0.2 g RAC與8 mL CBD-GAD粗酶液混合，RAC-CBD-GAD總酶活已達(dá)最大值，繼續(xù)增加RAC，RAC-CBD-GAD總酶活基本恒定，與0.1 g RAC試驗組差異顯著(P<0.05)，而與其他各組差異不顯著(P>0.05)。結(jié)果說明0.2 g RAC已能將8 mL CBD-GAD粗酶液的CBD-GAD完全吸附。為了能保證RAC充足，試驗預(yù)設(shè)安全系數(shù)為3，即選擇0.6 g RAC用于8 mL 粗酶液CBD-GAD的固定化。

圖1 RAC添加量對CBD-GAD固定化的影響Figure 1 Effect of amount of RAC on the immobilization of CBD-GAD

2.2 培養(yǎng)基對CBD-GAD融合酶表達(dá)的影響

從圖2可知，以LB、NB、TYG、PSB培養(yǎng)基發(fā)酵的E.coliGDMCC60445均可表達(dá)CBD-GAD融合酶，其中以LB培養(yǎng)基發(fā)酵表達(dá)CBD-GAD最高，與其他試驗組差異極顯著(P<0.01)；與LB培養(yǎng)基相比，NB、TYG、PSB培養(yǎng)基獲得的RAC-CBD-GAD相對酶活僅分別為(74.14±2.46)%，(0.95±0.22)%，(78.04±6.74)%。結(jié)果表明，LB培養(yǎng)基更適宜E.coliGDMCC60445表達(dá)CBD-GAD。

2.3 MSG添加量對CBD-GAD表達(dá)的影響

由圖3可見，MSG添加量為0.0～12.5 g/L時RAC-CBD-GAD活力基本一致，無顯著性差異(P>0.05)，說明MSG對E.coliGDMCC60445表達(dá)CBD-GAD融合酶無影響。因此，選擇不添加MSG。

圖2 不同培養(yǎng)基對CBD-GAD融合酶表達(dá)的影響Figure 2 Effect of different medium on the expression of fusion CBD-GAD

圖3 L-谷氨酸鈉對CBD-GAD融合酶表達(dá)的影響Figure 3 Effect of addition amount of MSG on the expression of fusion CBD-GAD

MSG是GAD催化反應(yīng)底物，可以在GAD催化下發(fā)生脫羧作用而減輕質(zhì)子對細(xì)胞的危害，因此為了通過MSG的誘導(dǎo)或抗酸作用而提高GAD的表達(dá)，常在培養(yǎng)基中添加MSG[10,30-31]。本試驗表明MSG對E.coliGDMCC60445工程菌產(chǎn)CBD-GAD無影響，其原因可能是本試驗構(gòu)建的E.coliGDMCC60445工程菌采用脅迫誘導(dǎo)型啟動子PrpoS，MSG對其無誘導(dǎo)作用，同時培養(yǎng)條件為弱酸環(huán)境，對E.coli細(xì)胞影響不大，通過MSG脫羧抗酸的生理效應(yīng)不顯著。

2.4 Amp對CBD-GAD表達(dá)的影響

基因工程菌容易丟失質(zhì)粒，通常需要在培養(yǎng)基中添加與工程菌抗性標(biāo)記相對應(yīng)的抗生素以防止質(zhì)粒丟失[25,31-33]。然而抗生素價格昂貴，應(yīng)用成本高，風(fēng)險大，不利于工業(yè)應(yīng)用。E.coliGDMCC60445工程菌攜帶AmpR抗性標(biāo)記，圖4對E.coliGDMCC60445工程菌是否需要在培養(yǎng)基中添加Amp以確保CBD-GAD正常表達(dá)進(jìn)行了考察。結(jié)果顯示E.coliGDMCC60445工程菌連續(xù)在無Amp的種子培養(yǎng)基中連續(xù)轉(zhuǎn)接5批次，并在無Amp的培養(yǎng)基中發(fā)酵，其表達(dá)CBD-GAD的能力與添加Amp的對照組一致，無顯著性差異(P>0.05)。結(jié)果表明，E.coliDH5α-LNSF02工程菌性能穩(wěn)定，培養(yǎng)基不需添加氨芐青霉素。

圖4 氨芐青霉素對CBD-GAD融合酶表達(dá)的影響Figure 4 Effect of ampicillin on the expression of fusion CBD-GAD

2.5 培養(yǎng)基初始pH值對CBD-GAD融合酶表達(dá)的影響

圖5顯示，培養(yǎng)基的初始pH對CBD-GAD的表達(dá)影響較大。培養(yǎng)基初始pH為5.5和6.0時，RAC-CBD-GAD相對酶活較大，隨著培養(yǎng)基初始pH降低或增高，RAC-CBD-GAD相對酶活均逐漸下降。雖然統(tǒng)計分析結(jié)果表明，pH 5.5試驗組與pH 6.0試驗組之間無顯著性差異(P>0.05)，但RAC-CBD-GAD相對酶活的平均值最高，因此選擇培養(yǎng)基的初始pH為5.5。

圖5 初始pH對CBD-GAD融合酶表達(dá)的影響Figure 5 Effect of initial pH value on the expression of fusion CBD-GAD

E.coli通常在中性環(huán)境生長較好，但本試驗表明培養(yǎng)基的初始pH為5.5時更有利于CBD-GAD的表達(dá)，說明CBD-GAD的表達(dá)與宿主菌的生長并不協(xié)同，在偏酸性條件下更利于脅迫誘導(dǎo)型啟動子PrpoS發(fā)揮作用，啟動CBD-GAD的表達(dá)。

2.6 培養(yǎng)溫度對CBD-GAD融合酶表達(dá)的影響

由圖6可見，培養(yǎng)溫度低于37 ℃時，RAC-CBD-GAD的相對酶活隨著溫度的升高而增大，當(dāng)超過37 ℃，活力迅速下降，各試驗組間差異極顯著(P<0.01)。結(jié)果表明，E.coliGDMCC60445表達(dá)CBD-GAD融合酶的最適培養(yǎng)溫度為37 ℃，與E.coli適宜生長溫度一致。因此，選擇培養(yǎng)溫度為37 ℃。

2.7 搖床轉(zhuǎn)速對CBD-GAD融合酶表達(dá)的影響

從圖7可見，隨著搖床轉(zhuǎn)速的增加，RAC-CBD-GAD相對酶活逐漸增加，當(dāng)超過120 r/min時，繼續(xù)提高轉(zhuǎn)速，RAC-CBD-GAD活力趨于平穩(wěn)，120 r/min試驗組與140 r/min 試驗組差異不顯著(P>0.05)。因此，選擇搖床轉(zhuǎn)速為120 r/min。

圖6 培養(yǎng)溫度對CBD-GAD融合酶表達(dá)的影響Figure 6 Effect of culture temperature on the expression of fusion CBD-GAD

圖7 搖床轉(zhuǎn)速對CBD-GAD融合酶表達(dá)的影響Figure 7 Effect of rotation speed on the expression of fusion CBD-GAD

2.8 發(fā)酵時間對CBD-GAD表達(dá)的影響

圖8顯示，發(fā)酵24 h，RAC-CBD-GAD活力最大，繼續(xù)延長發(fā)酵時間，RAC-CBD-GAD活力略有下降；36～60 h 內(nèi)趨于平穩(wěn)，各試驗組差異不顯著(P>0.05)。由于發(fā)酵培養(yǎng)不是同步培養(yǎng)，部分菌體因進(jìn)入衰亡期而自溶，而CBD-GAD融合酶為胞內(nèi)酶，試驗中只收集細(xì)胞進(jìn)行提取酶，從而造成細(xì)胞自溶釋放到發(fā)酵液中的CBD-GAD未被收集，可能是發(fā)酵24 h后檢測的RAC-CBD-GAD活力略有下降的原因。選擇發(fā)酵時間為24 h。

圖8 發(fā)酵時間對CBD-GAD融合酶表達(dá)的影響Figure 8 Effect of fermentation time on the expression of fusion CBD-GAD

2.9 田口試驗結(jié)果

因素和水平選擇詳見表1，試驗設(shè)計和試驗結(jié)果詳見表2。因素水平的均值和信噪比分析結(jié)果詳見圖9～12和表4～6。

表1 試驗因素與水平Table 1 Factors and levels table

表2田口試驗設(shè)計及結(jié)果
Table 2Taguchi design matrix with the experimental values of RAC-CBD-GAD activity

試驗號ABC平均酶活/(U·g-1)試驗1試驗21111271.43282.232122287.17291.113133298.42303.634212428.19436.265223402.46417.516231394.67416.187313378.38386.158321362.44377.199332347.61361.73

圖9 均值殘差正態(tài)概率圖Figure 9 Normal probability plots of mean residuals

圖10 信噪比殘差正態(tài)概率圖Figure 10 Normal probability plots of the residuals of signal-to-noise ratio

圖9、10顯示，各因素的均值殘差和信噪比殘差與模型擬合較好，為正態(tài)分布。表3、4表明各因素的均值響應(yīng)情況為A>C>B，其中A為顯著因素(P<0.05)，B和C為不顯著因素(P>0.05)。表5、6表明各因素的信噪比響應(yīng)情況也為A>C>B，其中A為顯著因素(P<0.05)，B和C為不顯著因素(P>0.05)。

根據(jù)均值和信噪比分析結(jié)果，確定顯著性因素(A)為位置因子，不顯著因素(B、C)為散度因子。由圖11選擇均值最大的水平作為位置因子水平，即A2；由圖12選擇可使散度最小化的水平作為散度因子的水平，即B1、C3。因此，各因素和水平的最優(yōu)組合為A2B1C3。

表3 因素水平的均值響應(yīng)分析Table 3 Mean value response of the selected factor levels

表4 均值方差分析Table 4 Analysis of variance of mean value

表5 因素水平的信噪比響應(yīng)分析Table 5 Response of signal-to-noise ratio of the selected factor levels

表6 信噪比方差分析Table 6 Analysis of variance of signal-to-noise ratio

結(jié)合非考察的因素NaCl，即可獲得E.coliGDMCC60445表達(dá)屎腸球菌CBD-GAD融合酶的適宜LB培養(yǎng)基(稱為改良LB培養(yǎng)基)組成為：胰蛋白胨8 g/L、酵母膏 6 g/L、NaCl 10 g/L，pH 5.5。

2.10 驗證實驗

采用軟件“預(yù)測田口結(jié)果”功能以最優(yōu)水平A2B1C3進(jìn)行預(yù)測，預(yù)測在優(yōu)化條件下獲得的RAC-CBD-GAD酶活為(428.21±7.50)U/g。經(jīng)以改良LB培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行驗證實驗，結(jié)果RAC-CBD-GAD酶活為(419.79±10.37)U/g，與預(yù)測值差異不顯著(P>0.05)，即驗證試驗結(jié)果與預(yù)測值相符。當(dāng)以初始LB培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵時，RAC-CBD-GAD酶活為(322.31±13.08)U/g，與改良LB培養(yǎng)基試驗組差異極顯著(P<0.01)。結(jié)果表明，優(yōu)化后的改良LB培養(yǎng)基較初始LB培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)CBD-GAD的能力提高了(30.28±3.22)%。

圖11 均值主效應(yīng)圖Figure 11 The main effects plot of means

圖12 信噪比主效應(yīng)圖(信噪：望大)Figure 12 The main effects plot of signal-to-noise ratio (SN:larger-the-better)

3 結(jié)論

在構(gòu)建基因工程菌表達(dá)外源酶的研究中，當(dāng)宿主菌也可表達(dá)外源酶的同工酶時，由于同工酶的催化反應(yīng)相同，很難區(qū)分各自的酶活力，對外源酶的表達(dá)條件研究帶來了極大困難。本試驗通過利用RAC特異性吸附CBD-GAD，將CBD-GAD與宿主菌E.coli自身基因表達(dá)的雜蛋白和天然GAD分離，避免了E.coli天然GAD和雜蛋白的影響，試驗結(jié)果可真實反映CBD-GAD表達(dá)情況。

E.coliGDMCC60445表達(dá)CBD-GAD的適宜培養(yǎng)基為改良LB培養(yǎng)基，其組成為胰蛋白胨8 g/L、酵母膏 6 g/L、NaCl 10 g/L、pH 5.5；適宜的培養(yǎng)條件為溫度37 ℃、搖床轉(zhuǎn)速120 r/min、培養(yǎng)時間24 h。培養(yǎng)基組成少、成本低、配制簡便，具有較好工業(yè)化應(yīng)用前景。