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不同pH條件下米谷蛋白的理化及結(jié)構(gòu)特性研究

2019-03-30 01:14:38劉永樂王發(fā)祥王建輝李向紅
食品與機械 2019年1期
關(guān)鍵詞:谷蛋白巰基亞基

李 雙 劉永樂 俞 健 王發(fā)祥 王建輝 李向紅

(長沙理工大學(xué)化學(xué)與食品工程學(xué)院,湖南 長沙 410114)

中國是世界上稻谷產(chǎn)量最大的國家,年產(chǎn)量2×108t以上[1]。大米生產(chǎn)中產(chǎn)生稻谷總重10%~15%的碎米,目前其主要用作低附加值產(chǎn)品加工或大米淀粉的提取原料,對其中8%左右大米蛋白的高值化利用較少。大米蛋白具有低過敏性,體內(nèi)實際消化率大于88%的特點[2],在嬰兒配方食品中可部分替代牛奶或大豆[3],并具有降膽固醇、降血脂、抗氧化及抗癌[4]等生物功能。因此,碎米中大米蛋白的高值化利用對提升稻谷精深加工與資源化利用水平具有重要意義。

大米蛋白中米谷蛋白含量高達(dá)80%[5],米谷蛋白是一種剛性的球狀結(jié)構(gòu)蛋白,亞基間通過分子內(nèi)、分子間二硫鍵及疏水相互作用形成分子量64~500 kDa的致密分子聚集體[6],導(dǎo)致其在中性溶液中溶解度極低[7],限制了其應(yīng)用領(lǐng)域。前人[7-9]對改善大米蛋白溶解性的研究主要集中于通過脫酰胺、酶法、糖基化等方法對大米蛋白進(jìn)行改性來提高其溶解性,但仍存在最終蛋白質(zhì)得率較低的問題,仍然有可能導(dǎo)致巨大的蛋白資源浪費。本課題組[7]前期研究發(fā)現(xiàn),雖然pH 5.0和pH 7.0時其溶解度僅1.71%和6.18%,但酸性條件下,天然大米蛋白龐大的分子聚集體可充分分散,溶解度可顯著增加,酸性條件下大米蛋白的可操控性增強。因此,本試驗旨在探討中性和酸性pH條件下大米蛋白的主要成分——米谷蛋白的理化和結(jié)構(gòu)性質(zhì),為進(jìn)一步拓寬大米蛋白的應(yīng)用范圍提供理論和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

秈米:市售;

標(biāo)準(zhǔn)蛋白、丙烯酰胺:AR級,美國Sigma公司;

總巰基試劑盒:南京建成生物工程研究所;

牛血清蛋白:合肥博美生物科技有限責(zé)任公司;

SDS:國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;

氫氧化鈉、氯化鈉、鹽酸等化學(xué)試劑:分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

集熱式恒溫加熱磁力攪拌器:DF-101S型,鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;

高速萬能粉碎機:FW100型,天津泰斯特儀器有限公司;

高速離心機:LG10-24.A 型,北京京立離心機有限公司;

真空冷凍干燥機:FD-1型,北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司;

pH計:DELTA 320型,梅特勒-托利多(上海)有限公司;

鼓風(fēng)干燥箱:DHG-9140A型,上海精宏實驗設(shè)備有限公司;

紫外—可見分光光度計:UV2600型,上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;

透射電鏡:Tecnai G2 Spirit TWIN型,美國FET公司;

差示掃描量熱分析儀:Q2000型,美國TA公司;

高效液相色譜儀:Agilent 1100型,美國安捷倫公司;

迷你型垂直電泳槽: DYCZ-24D型,北京市六一儀器廠;

穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀:YY-5型,北京市六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 米谷蛋白的制備 參照文獻(xiàn)[10]。具體如下:

(1) 脫脂:秈米粉碎,以1∶ 5 (g/mL)的料液比加入正己烷,室溫下攪拌1 h后真空抽濾,濾液回收,濾餅留用,濾餅室溫干燥24 h。

(2) 堿提:按料液比1∶10 (g/mL)加入0.05 mol/L的NaOH,恒速恒溫攪拌2 h,3 500 r/min 離心20 min,取上清液。

(3) 酸沉:上清液恒速攪拌,用0.1 mol/L的鹽酸溶液調(diào)pH到蛋白質(zhì)等電點(pH 4.8),將前一步的懸濁液如上述參數(shù)離心,取沉淀中加入少量去離子水,調(diào)節(jié)pH到7.0,留用。

(4) 鹽提:按料液比1∶10 (g/mL)加入5%氯化鈉溶液,攪拌1 h,離心取沉淀。

(5) 醇提:按料液比1∶5 (g/mL)加入75%乙醇攪拌1 h,離心取沉淀。

(6) 沉淀水洗3次,料液比均為1∶15 (g/mL),攪拌20 min,離心(3 500 r/min, 20 min)取沉淀,冷凍干燥,干粉保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 米谷蛋白的常規(guī)成分檢測

(1) 水分含量測定:按GB 5009.3—2010《食品中水分的測定》的直接干燥法執(zhí)行。

(2) 蛋白含量測定:按GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》的凱氏定氮法執(zhí)行。

1.3.3 不同pH值蛋白溶液的配制 取0.1 g米谷蛋白樣品,溶于20 mL的蒸餾水中,采用 0.1 mol/L的鹽酸分別調(diào)節(jié)溶液pH至3.0,4.0,7.0,攪拌8~10 h,4 500 r/min離心30 min,取上清液備用。

1.3.4 米谷蛋白溶解度的測定 取不同pH值蛋白上清液0.5 mL于試管中,加入Folin-酚試劑,500 nm波長處測定其吸光度值,對照標(biāo)準(zhǔn)曲線得出樣品中的蛋白質(zhì)濃度并計算溶解度[11]。

1.3.5 米谷蛋白的高效液相色譜檢測 用1 g/100 mL SDS水溶液分別配制pH 3.0,4.0,7.0,濃度為5 mg/mL的米谷蛋白溶液,經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后使用高效液相系統(tǒng)與色譜柱(7.8 mm × 300 mm)進(jìn)行測定。流動相為相應(yīng)pH值的1 g/100 mL SDS水溶液,洗脫速率1 mL/min,檢測波長220 nm,柱溫為25 ℃。

1.3.6 米谷蛋白十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳 不同pH值蛋白溶液采用SDS-PAGE電泳[12]觀察其亞基分布,其中:分離膠濃度12%,濃縮膠濃度5%,上樣量為10 μL,考馬斯亮藍(lán)R-250 染色。

1.3.7 米谷蛋白游離巰基的測定 不同pH值蛋白溶液于常溫攪拌8~10 h,4 500 r/min 離心20 min,取上清液測定蛋白質(zhì)溶解度。取空白管、對照管、測定管分別加入0.1 mL樣品于對照管和測定管中,再加入0.1 mL總巰基試劑一于3管中,加入1.1 mL試劑二于空白管,1.0 mL分別于對照管和測定管中,將0.5 mL試劑三分別加入空白管和測定管中,同時加0.5 mL蒸餾水于對照管中,混合均勻于37 ℃水浴15 min。加入0.05 mL試劑四于3管中,室溫靜置30 min直至顯色,412 nm,0.5 cm光徑,雙蒸水調(diào)零,測定各管OD值[13]。

(1)

式中:

SH——游離硫基含量,mmol/g;

A1——測定管吸光度;

A0——空白管吸光度;

A2——對照管吸光度;

V1——反應(yīng)總體積,mL;

V2——取樣量,mL;

cd——蛋白質(zhì)含量,g/mL。

1.3.8 米谷蛋白的透射電鏡檢測 取0.2 g米谷蛋白樣品,溶于20 mL的蒸餾水中,滴加鹽酸分別調(diào)節(jié)pH值至3.0,4.0,7.0,攪拌過夜,離心取上清液。取 20~30 μL上清液滴加于載樣銅網(wǎng)上,靜置1 min用濾紙從側(cè)面吸干液體,滴加0.5% 30 μL 醋酸鉛溶液于銅網(wǎng)上,室溫負(fù)染10 min,吸干液體,烤干后在透射電鏡下觀察照相[14]。

1.3.9 米谷蛋白熱力學(xué)性質(zhì)的測定 米谷蛋白溶于水,經(jīng)調(diào)整pH值后冷凍干燥,測定不同pH條件下后米谷蛋白的熱力學(xué)性質(zhì)??折釄遄鳛榭瞻祝Q取待測樣品(2.5±0.2) mg置于坩堝中進(jìn)行檢測。掃描速度:5 ℃/min,掃描范圍:20~160 ℃,平行測定3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 米谷蛋白常規(guī)成分含量

結(jié)果顯示堿法提取米谷蛋白的蛋白質(zhì)提取率為(56.40±2.20)%,水分含量(4.29±0.22)%,蛋白質(zhì)含量(90.81±0.13)%(干基)。

2.2 米谷蛋白的溶解度

由圖1可知,pH 7.0時米谷蛋白的溶解度僅(6.24±1.25)%,在pH 5.0(接近米谷蛋白等電點)時溶解度最低,僅有2.01%;而在酸性條件下,溶解度顯著增加,pH 3.0 時其溶解度最高,達(dá)到(72.47±2.36)%。隨著pH值降低,米谷蛋白的溶解度明顯提高,主要是由于pH值低于等電點時蛋白質(zhì)帶正電荷相互排斥,增加了其水溶性。但是,pH 2.0時米谷蛋白的溶解度小于pH 3.0的,在pH 2.0這種強酸條件下,大米蛋白分子嚴(yán)重變性以致相互交聯(lián),其水溶液變的黏稠,使溶解度降低。后續(xù)研究中,選擇了pH 3.0,4.0,7.0 3種pH條件對米谷蛋白的性質(zhì)進(jìn)行研究。

圖1 米谷蛋白在不同pH下的溶解度Figure 1 Solubility of rice glutelin at different pH values

2.3 米谷蛋白的高效液相檢測

圖2表征了pH 3.0,4.0, 7.0時米谷蛋白的分子量變化,三者的洗脫出峰時間有較大不同。由圖2可知,3種樣品均在約5.6 min出現(xiàn)一個小峰,但pH 3.0條件下主要的出峰時間為10.707,11.123,11.773 min,3個峰的分離效果不明顯;pH 4.0條件下主要的出峰時間為10.305,10.889,11.627 min;中性條件下主要的出峰時間為9.476,10.052,10.851 min,前2個峰的分離效果不是很明顯。pH 7.0時的響應(yīng)值低于pH 3.0和pH 4.0,這是由于pH 7.0時的溶解度很低,SDS的溶解度很低,導(dǎo)致其響應(yīng)值很低。根據(jù)凝膠色譜按分子量從大到小出峰的規(guī)律,結(jié)果表明pH 3.0時米谷蛋白主要峰的洗脫時間大于pH 7.0時的,出峰時間延長了約1~2 min,這是因為酸性環(huán)境使蛋白大分子團(tuán)體解聚分散成小分子,較晚洗脫出來。

圖2 米谷蛋白在不同pH下的高效液相色譜圖Figure 2 High-performance liquid chromatograms of rice glutelin at different pH values

2.4 米谷蛋白的SDS-PAGE電泳

如圖3與表1所示,pH 3.0與pH 4.0時,米谷蛋白的亞基組成及多肽差異不大,而pH 7.0時米谷蛋白亞基組成與之相比有明顯差異。在pH 3.0條件下電泳圖譜顯示5個條帶,亞基相對分子質(zhì)量分別為62,51,33,19,18 kDa;在pH 4.0 的條件下電泳圖譜顯示有5個條帶,其亞基分子量分別為63,52,33,19,18 kDa;在中性條件下電泳圖譜顯示有8個條帶,其亞基分子量分別為123,93,63,51,33,21,19,18 kDa。對比酸性條件和中性條件下的樣品電泳圖,123,93 kDa 亞基消失,說明酸性環(huán)境會改變米谷蛋白的分子結(jié)構(gòu)從而影響其亞基分布。

圖3 不同pH條件下米谷蛋白的SDS-PAGE電泳圖Figure 3 SDS-PAGE electrophoresis of rice glutelin at different pH values

表1不同pH條件下米谷蛋白電泳圖的光密度值

Table 1 Optical density values of rice glutelin electrophoresis patterns at different pH values

pH 3.0亞基分子量/kPaIODpH 4.0亞基分子量/kPaIODpH 7.0亞基分子量/kPaIOD----123304----931 467628663954631 13351255522 003512 07833714331 158331 506191 148191 73421336186271885219657----18340

pH 3.0與pH 4.0相比,亞基組成雖然大致相同,但每個條帶的光密度值有較大差距。從光度值分布可以看出,pH 3.0 時19 kDa的條帶比大分子量的條帶含量更高,pH 4.0 時52 kDa的條帶含量更高,pH 7.0時酸性條件下沒有觀察到的123,93 kDa的條帶含量較高,因此,電泳圖光密度值的結(jié)果進(jìn)一步證明酸性條件下米谷蛋白中較大的分子逐漸解離,pH 3.0時體系中存在更多的較小分子量的分子。

2.5 pH值對米谷蛋白游離巰基含量的影響

由表2可知,隨著 pH 的增大,米谷蛋白游離巰基含量逐漸減少。原因可能是蛋白質(zhì)在酸性條件下二硫鍵斷裂內(nèi)部結(jié)構(gòu)展開[15],使其內(nèi)部的巰基暴露出來,或是蛋白質(zhì)的亞基發(fā)生解離,使表面疏水性增大[16]。

2.6 pH值對米谷蛋白透射電鏡檢測結(jié)果的影響

如圖4(a)所示,中性條件下的米谷蛋白分子較為密集,凝集成團(tuán),而在酸性條件下,米谷蛋白分子較為松散。圖4(b)、(c)中,米谷蛋白分子之間空隙較大,相比中性條件下較為分散無巨大團(tuán)聚現(xiàn)象,且pH 3.0下的米谷蛋白分子比pH 4.0下的更為分散。

表2 不同pH條件下米谷蛋白游離巰基的含量Table 2 Free thiol content of in rice glutelin under different pH values

2.7 pH值對米谷蛋白熱力學(xué)性質(zhì)的影響

DSC測量蛋白質(zhì)體系在程序控溫過程中發(fā)生的熱量變化,可得到與蛋白質(zhì)熱變性有關(guān)的一些信息,從而得到蛋白分子的熱穩(wěn)定性特征[17]。由表3可得,3種pH環(huán)境下的米谷蛋白的變性峰值溫度相差不大,但其變性熱焓的差別較為明顯。焓值代表鍵斷裂累積在一起的吸熱量,同時也反映了蛋白質(zhì)樣品的結(jié)構(gòu)有序程度[18]。樣品在pH 3.0時焓值最低,可能與其分子在低酸性環(huán)境下較為分散有關(guān),而在pH 4.0 時樣品焓值最高,此時pH值較為接近等電點,蛋白質(zhì)分子有序程度高,因此焓值最高。pH 3.0,4.0,7.0下,米谷蛋白的熱變性溫度依次升高,表明在酸性環(huán)境中,米谷蛋白的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,中性條件下的米谷蛋白分子穩(wěn)定。

圖4 不同pH條件下米谷蛋白的透射電鏡圖像Figure 4 Transmission electron microscopy of rice glutelin at different pH values

表3 不同pH條件下米谷蛋白的熱力學(xué)性質(zhì)Table 3 Thermodynamic properties of rice glutelin at different pH values

3 結(jié)論

試驗結(jié)果顯示,在酸性條件下米谷蛋白的溶解性比中性條件下好,可能是在強酸或堿性條件下,米谷蛋白質(zhì)與淀粉等物質(zhì)結(jié)合的粒子被分解,其緊密的結(jié)構(gòu)變得疏松,同時破壞了蛋白質(zhì)分子的次級鍵,促進(jìn)了蛋白質(zhì)與結(jié)合物的分離,從而增加了米谷蛋白的溶解性。隨著米谷蛋白pH值下降,其分子結(jié)構(gòu)、亞基組成都發(fā)生了變化,同時米谷蛋白游離巰基含量增加,熱變性溫度下降,可能是米谷蛋白質(zhì)分子在酸性條件下內(nèi)部結(jié)構(gòu)展開,分子鍵斷裂等,使結(jié)構(gòu)變得松散,從而引起蛋白質(zhì)溶解度增加。

近年來,帶相反電荷的蛋白質(zhì)和多糖復(fù)合凝聚實現(xiàn)組裝,形成具有特定結(jié)構(gòu)和功能的復(fù)合凝聚產(chǎn)物[19],其通常具有優(yōu)于蛋白質(zhì)或多糖本身的功能性質(zhì)[19-21]。因此利用本研究中酸性條件分散的大米蛋白與帶相反電荷的多糖混合,控制兩種生物大分子的相互作用從而設(shè)計和構(gòu)建結(jié)構(gòu)可控及功能獨特的組裝體系,對獲得改善功能性質(zhì)的產(chǎn)物、設(shè)計新型大米蛋白食品及拓寬低值原材料中提取的大米蛋白的應(yīng)用范圍均具有重要意義。下一步試驗將針對酸性條件下大米蛋白和多糖的復(fù)合凝聚進(jìn)行深入探索。

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