李彥林，張蔚，李曉玉，魯心怡，曹鈺*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122) 2(教育部工業(yè)生物技術(shù)重點實驗室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)

當(dāng)前，全球表面活性劑的使用量大幅增加，每年化學(xué)和生物表面活性劑的全球市場價值超過200億美元[1-2]。和化學(xué)表面活性劑相比，生物表面活性劑是微生物發(fā)酵產(chǎn)生的生物活性分子，具有較低的毒性和較高的生物降解性，并且能夠在極端的溫度、pH和鹽度下保持表面活性[3]。

Surfactin是由C12—C17長鏈脂肪酸和7個氨基酸構(gòu)成的環(huán)狀脂肽，為研究最多的脂肽類表面活性劑之一，具有保濕[4]、抑菌[5]、抗炎[6]、抗腫瘤[7]等活性，甚至可以輔助治療人類免疫缺陷病[8]，在化妝品、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。但其工業(yè)化進程受制于較高的生產(chǎn)成本。通常在發(fā)酵類產(chǎn)品的生產(chǎn)中，原材料成本約占總成本的41%[9]。因此使用廉價的工農(nóng)業(yè)廢棄物作為碳源來發(fā)酵生產(chǎn)surfactin，在降低生產(chǎn)成本方面扮演重要角色。目前已有以梨汁[10]、橄欖油場廢料[11-12]、木薯廢水[13]、白酒糟[14]、過期糖蜜[15]、豆渣[3]作為碳源的文獻報道。啤酒糟(brewer's spent grain，BSG)是在啤酒生產(chǎn)環(huán)節(jié)麥芽汁加工過程殘留的固體物質(zhì)。全球每年BSG產(chǎn)量約3 860萬t[16]，其中我國年產(chǎn)量約1 000萬t[17]，具有豐富的資源。目前BSG主要用于動物飼料[18]，亟待高附加值的開發(fā)利用。

本研究主要根據(jù)surfactin的表面活性性質(zhì)，以及生產(chǎn)菌株具備的surfactin合成調(diào)控基因srfA，開展surfactin合成菌株的定向篩選，通過薄層層析(thin layer chromatography，TLC)和超高效液相色譜-電噴霧四級桿飛行時間質(zhì)譜(ultra performance liquid chromatography/electrospray ionization quadrupole time-of-flight high-resolution/mass spectrometry，UPLC-ESI/Q-TOF/MS)進行產(chǎn)物的定性驗證和定量分析，篩選利用BSG酶解液為碳源的surfactin高產(chǎn)菌株，并進行分子生物學(xué)鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無錫雪浪山附近篩選得到的247株芽孢桿菌，實驗室保藏。

surfactin(≥98%)標(biāo)準品S3 523,美國sigma公司；甲醇、乙腈(HPLC級),賽默飛世爾科技有限公司；三氟乙酸(HPLC級),上海麥克林生化科技有限公司；普通PCR制劑,Takara公司；其他試劑,國藥集團(上海)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，酵母膏5，NaCl 10。制備固體培養(yǎng)基時添加2%營養(yǎng)瓊脂，pH 7.0。

MSM培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖40，NH4NO38，KH2PO44.08，Na2HPO45.68，MgSO4·7H2O 2.46×10-2，CaCl21.03×10-3，F(xiàn)eSO41.11×10-3，EDTA 1.18×10-3，pH7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：用5 g/L預(yù)處理BSG的酶解液替代MSM培養(yǎng)基中葡萄糖。

1.3 儀器與設(shè)備

LDZX-50KBS高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療機械廠；T100 PCR儀，美國Bio-Rad公司；TGL-16C高速離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；GSP-9050MBE隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海博迅實業(yè)有限公司；ZQZY-70B振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器；PA2014N電子天平，梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司；SW-CJ-2FD潔凈工作臺，蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司；DCAT21表面張力動態(tài)接觸角測量儀，德國Dataphysics公司；Chromaster高效液相色譜儀，日本日立公司；MALDI SYNAPT MS超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國waters公司。

1.4 方法

1.4.1 發(fā)酵上清液性質(zhì)測定

基于surfactin的表面活性特性，通過無細胞發(fā)酵上清液排油活性、乳化指數(shù)及表面張力性質(zhì)的測定，初步篩選產(chǎn)生物表面活性劑的菌株。即將篩選得到的247株芽孢桿菌接種于MSM培養(yǎng)基中30 ℃，200 r/min搖瓶培養(yǎng)96 h，發(fā)酵液于10 000 r/min離心5 min得到無細胞上清，進行性質(zhì)測定。

1.4.1.1 排油活性(ODA)測定

取30 mL蒸餾水于培養(yǎng)皿中，加20 μL大豆油于蒸餾水表面，形成油層之后，滴加10 μL無細胞上清液，若能夠形成透明圈，說明有表面活性物質(zhì)產(chǎn)生，并記錄透明圈直徑大小。

1.4.1.2 乳化指數(shù)(E24)測定

以乳化指數(shù)來表征無細胞上清液的乳化能力。取2 mL大豆油于試管中，然后加入2 mL無細胞上清液，旋渦高速振蕩2 min后，在室溫下靜置24 h，計算乳化指數(shù)E24：

(1)

式中：h1，乳化層高度；h2，液體總高度。

1.4.1.3 表面張力(SFT)測定

利用德國Dataphysics公司表面張力動態(tài)接觸角測量儀測定無細胞上清液表面張力。取40 mL無細胞上清液于燒杯中，放置到張力計檢測品臺上，按照說明書方法進行操作。測定不同樣品之間需用無菌的MSM培養(yǎng)基進行洗滌后測定。

1.4.2srfA基因特異PCR分析

經(jīng)過發(fā)酵液性質(zhì)測定，選擇初步確定能產(chǎn)表面活性劑的菌株。進行srfA基因檢測，進一步確定菌株是否具有合成surfactin合成酶的能力。PCR擴增引物及條件參照文獻[19]。

1.4.3 發(fā)酵產(chǎn)物分析

向無細胞上清液中添加5 mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH至2.0，放于4 ℃冰箱過夜，10 000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀用甲醇溶解后備用。

1.4.3.1 薄層層析(TLC)

通過TLC初步半定性半定量surfactin的產(chǎn)生，使用Merck硅膠60熒光薄層層析鋁箔板F254進行薄層層析，流動相為V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(乙酸)=80∶10∶10，surfactin標(biāo)品作為對照。

1.4.3.2 UPLC-ESI/Q-TOF MS條件

液相條件：使用Waters C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動相A為含有體積分數(shù)為0.1%甲酸的色譜乙腈溶液，流動相B為含有體積分數(shù)為0.1%甲酸的水溶液，V(A)∶V(B)=90∶10等度洗脫；柱溫30 ℃，流速為0.3 mL/min；進樣體積5 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)，正離子檢測模式；離子源溫度為20 ℃；毛細管電壓3 000 V；錐孔電壓30 V；去溶劑氣體流速500 L/h；去溶劑溫度500 ℃；錐孔氣流50 L/h；范圍m/z500～1 500，檢測時間20 min。

1.4.4 surfactin定量檢測

采用高效液相色譜儀對surfactin進行定量測定。色譜柱：Agilent C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相A為含有體積分數(shù)為0.1%三氟乙酸的色譜乙腈溶液，流動相B為含有體積分數(shù)為0.1%三氟乙酸水溶液，V(A)∶V(B)=90∶10等度洗脫；柱溫30 ℃，流速為1 mL/min；檢測波長205 nm；進樣體積20 μL。

1.4.5 利用預(yù)處理BSG酶解液中發(fā)酵生產(chǎn)surfactin

參考文獻[20]BSG酶解條件，酶解完成后，100 ℃滅酶10 min，酶解液處理方式分為2種，一種是10 000 r/min離心5 min，得到BSG酶解上清液(supernatant of enzymatic hydrolysate of BSG，SEH-BSG)，另一種紗布過濾得到BSG酶解濾液(filtrate of enzymatic hydrolysate of BSG，F(xiàn)EH-BSG)，配制發(fā)酵培養(yǎng)基，121 ℃滅菌20 min。按照10%接種量接入菌株，30 ℃，200 r/min培養(yǎng)96 h，測定surfactin產(chǎn)量，選出利用BSG酶解液最好的菌株。

1.4.6 發(fā)酵產(chǎn)物純化及保濕性測定

發(fā)酵產(chǎn)物純化方法參照文獻[21]，保濕性測定參照文獻[22]。

1.4.7 菌株鑒定

1.4.7.1 菌株形態(tài)觀察

活化菌株，挑取芽孢桿菌新鮮培養(yǎng)物，進行革蘭氏染色和芽孢桿菌顯微形態(tài)觀察；同時在LB平板劃線，培養(yǎng)觀察菌落形態(tài)。

1.4.7.2 菌株16S rDNA分析

采用細菌基因組抽提盒提取芽孢桿菌總DNA，使用通用引物27F和1 492R對菌株16S rDNA進行PCR擴增，目標(biāo)片段1 500 bp左右，PCR條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，進行30個循環(huán)，72 ℃修復(fù)延伸5 min，10 ℃保溫。PCR產(chǎn)出純化后，由蘇州金唯智生物科技有限公司進行測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)surfactin菌株定向篩選

2.1.1 基于發(fā)酵上清液表面活性特性的初篩

Surfactin是一種生物表面活性劑，具有表面活性劑的典型特征，即排油活性(ODA)、乳化指數(shù)(E24)和降低水表面張力(SFT)，SFT值越低，表明表面活性越強，ODA與E24值越大。據(jù)此，從247株芽孢桿菌的MSM培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)上清液中共篩選出17株同時具有上述3種特性的菌株，測定結(jié)果如圖1。

圖1 不同菌株發(fā)酵上清液的表面活性特性分析Fig.1 The surface activity parameters of different strains’ fermentation supernatant

以無菌的MSM培養(yǎng)基為對照，發(fā)現(xiàn)菌株41-3發(fā)酵液降低培養(yǎng)基SFT值，提高培養(yǎng)基ODA和E24值效果最好，表明該菌株合成生物表面活性劑能力最強，有可能是surfactin高產(chǎn)菌株。

2.1.2 基于菌株srfA基因特異PCR的復(fù)篩

由于srfA是編碼surfactin合成酶的基因，缺失srfA基因，surfactin將不能合成。具有表面活性劑典型特征的17株芽孢桿菌進行srfA基因檢測，如圖2所示，發(fā)現(xiàn)有8株芽孢桿菌srfA基因陽性，編號分別為20-2，41-3，43-3，44-3，47-3，49-5，50-1，56-2。

M-maker2000；1～17分別代表菌株9-1,19-1,34-2,41-3,20-2,43-3,44-3,15-1,44-1,47-3,49-5,51-5,46-3,68-1,50-1,56-2,60-1圖2 不同菌株srfA基因特異性PCR分析Fig.2 Analysis of srfA gene specific PCR in different strains

2.2 利用BSG的高產(chǎn)菌株的選擇

將srfA基因檢測陽性的8株芽孢桿菌接種到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中30 ℃培養(yǎng)96 h，經(jīng)酸沉，甲醇溶解，通過TLC和UPLC-ESI/Q-TOF MS定性分析菌株的發(fā)酵產(chǎn)物中是否含有surfactin。通過HPLC定量測定surfactin。

2.2.1 發(fā)酵產(chǎn)物的定性分析

2.2.1.1 TLC法定性分析發(fā)酵產(chǎn)物

如圖3所示，菌株41-3發(fā)酵液提取物和sigma公司surfactin標(biāo)品(S3 523)經(jīng)薄層層析板的條帶一致，有相同的Rf值。表明發(fā)酵液中含有surfactin。故進一步進行UPLC-ESI/Q-TOF MS分析，以明確該產(chǎn)物是否為surfactin。

1- surfactin標(biāo)品(S3 523)；2-菌株41-3發(fā)酵液提取物圖3 紫外254nm波長下樣品的TLC分析結(jié)果Fig.3 TLC results of samples at UV 254 nm

2.2.1.2 菌株41-3發(fā)酵液提取物中surfactin定性分析

利用UPLC-ESI/Q-TOF MS液質(zhì)連用法，對菌株41-3發(fā)酵液提取物中的surfactin進行定性分析。結(jié)果見圖4。從圖4可見，surfactin標(biāo)品(S3 523，Sigma公司)和菌株41-3發(fā)酵提取物均為一些同系物，其[M+H]+峰均位于1 008、1 022、1 036、1 050、1 064m/z，[M+Na]+峰均位于在m/z1 030、1 044、1 058、1 072、1 086，分別代表C13—C17surfactin同系物。

a-surfactin標(biāo)準品；b-菌株41-3發(fā)酵提取物圖4 液質(zhì)聯(lián)用分析樣品的[M+H]+和[M+Na]+質(zhì)譜圖Fig.4 Comparison of [M+H]+ and [M+Na]+ spectra of samples by LC/MS analysis

2.2.2 surfactin高產(chǎn)菌株的篩選

根據(jù)不同濃度的surfactin標(biāo)品配置的標(biāo)準溶液，繪制出surfactin標(biāo)準曲線。得到surfactin濃度與峰面積的對應(yīng)關(guān)系：

Y=2×10-5X峰面積-0.966 7，R2=0.999 1

(2)

式中：Y，surfactin濃度質(zhì)量濃度，g/L;X,峰面積。

對8株產(chǎn)surfactin的菌株以MSM培養(yǎng)30 ℃，200 r/min發(fā)酵96 h，HPLC測定其產(chǎn)量，結(jié)果見圖5。其中菌株41-3 surfactin產(chǎn)量最高，達到541.32 mg/L。其次為菌株43-3，其surfactin產(chǎn)量達到258.39 mg/L，其余菌株發(fā)酵產(chǎn)量均不到100 mg/L。據(jù)文獻報道，通常天然分離的芽孢桿菌surfactin產(chǎn)量為100 mg/L左右，而菌株41-3 surfactin產(chǎn)量達到541.32 mg/L，故選用菌株41-3作進一步研究。

圖5 不同菌株在MSM中surfactin產(chǎn)量Fig.5 Surfactin production of different strains in MSM

2.2.3 利用BSG產(chǎn)surfactin菌株surfactin產(chǎn)量及同系物成分分析

2.2.3.1 利用BSG產(chǎn)surfactin菌株surfactin產(chǎn)量

為考察菌株對BSG的發(fā)酵利用情況，采用10 g/L的NaOH稀堿溶液預(yù)處理BSG，去除木質(zhì)素便于纖維素酶更好地水解纖維素，以酶解液中的還原糖供菌株生長和發(fā)酵并生產(chǎn)surfactin。選取菌株在MSM培養(yǎng)基中surfactin產(chǎn)量最高的菌株41-3和43-3，進行BSG發(fā)酵試驗，結(jié)果見表1。

表1 菌株利用BSG酶解液發(fā)酵試驗Table 1 Fermentation results by using BSG enzymatic hydrolysate

從表1中看出，相比于MSM培養(yǎng)基，菌株41-3和43-3在SHE-BSG酶解液(無固形物)中培養(yǎng)，surfactin產(chǎn)量分別下降了34.93 mg/L、26.89 mg/L。然而，菌株41-3和43-3在FEH-BSG酶解液(含固形物)中培養(yǎng)，surfactin產(chǎn)量相比于MSM培養(yǎng)基均有提高，特別是菌株41-3 surfactin產(chǎn)量達到746.35 mg/L，提高了1.38倍，同時生物量和MSM培養(yǎng)基培養(yǎng)相比，也從1.85×107CFU/mL提高到7.15×107CFU/mL?？赡茉蚴荁SG酶解完成后，F(xiàn)EH-BSG酶解液含有固體BSG顆粒，而且有報道稱，固體物質(zhì)能夠使菌體吸附，提高生物量，進而提高surfactin產(chǎn)量[23]。

2.2.3.2 不同碳源條件下發(fā)酵產(chǎn)物中surfactin同系物分析

根據(jù)UPLC-ESI/Q-TOF MS樣品出峰時間和質(zhì)荷比對應(yīng)關(guān)系，對發(fā)酵產(chǎn)物中的surfactin各同系物的相對含量進行分析，結(jié)果見表2。

表2 利用不同碳源發(fā)酵產(chǎn)的surfactin同系物分析Table 2 Analysis of surfactin homologues produced by fermented with different carbon sources

從表2可以看出，菌株41-3產(chǎn)生的surfactin同系物中，以脂肪酸鏈為C14和C13的surfactin為主，兩者含量約占75%。利用FEH-BSG酶解液和利用葡萄糖發(fā)酵生產(chǎn)surfactin相比，surfactin的合成向更長鏈脂肪酸surfactin遷移。有文獻報道，surfactin的表面活性會隨著脂肪酸鏈的增長而顯著提高，同時其乳化，保濕性能也有所增強[24-25]。分別以FEH-BSG酶解液和葡萄糖為碳源發(fā)酵，對獲得的surfactin進行表面活性特性分析，結(jié)果見表3。利用前者生產(chǎn)的surfactin同系物的表面張力、乳化指數(shù)以及保濕性均優(yōu)于后者，其中，表面張力降低了6.31%，乳化指數(shù)和保濕性分別提高了7.53%和48.04%。因此，F(xiàn)EH-BSG酶解液作為碳源時不僅提高了surfactin產(chǎn)量，也增強了surfactin的表面活性性能，可以作為葡萄糖的替代品用來發(fā)酵生產(chǎn)surfactin。

表3 利用不同碳源發(fā)酵產(chǎn)的surfactin表面活性分析Table 3 Surface activity analysis of surfactin produced by fermented with different carbon sources

2.2.4 高產(chǎn)surfactin菌株鑒定

2.2.4.1 菌株41-3形態(tài)觀察

菌株41-3為革蘭氏陽性菌，菌落易挑起，呈白色，表面粗糙不透明。菌體細胞呈桿狀，能夠形成芽孢，芽孢呈橢圓狀，位于細胞中央。圖6-a為菌株平板形態(tài)，圖6-b為菌株細胞革蘭氏染色后油鏡下的顯微鏡形態(tài)。

a-平板菌落形態(tài)；b-細胞顯微形態(tài)圖6 菌株41-3平板菌落形態(tài)和細胞顯微形態(tài)Fig.6 Colony morphology and cell microscopic morphology of strain 41-3

2.2.4.2 菌株41-3分子生物學(xué)鑒定

以通用引物27F和1 492R對41-3菌株16s rDNA進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，得到大約為1 500 bp的條帶，如圖7。

1- DNA分子標(biāo)記；2- PCR產(chǎn)物圖7 菌株41-3 16S rDNA的PCR結(jié)果Fig.7 16S rDNA PCR results of strain 41-3

PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，送樣測序，經(jīng)過NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST序列進行同源性比對，發(fā)現(xiàn)41-3菌株與Bacillussubtilis具有99%的同源性，親緣關(guān)系最近，由此可確定菌株41-3菌株為Bacillussubtilis(枯草芽孢桿菌)。在NCBI數(shù)據(jù)庫中下載相似度高的序列，利用MEG6軟件構(gòu)建進化樹，如圖8。

圖8 菌株41-3進化樹Fig.8 The phylogenetic tree of strain 41-3

3 結(jié)論

Surfactin是目前發(fā)現(xiàn)的最有效的生物表面活性劑，但生產(chǎn)成本過高限制了其工業(yè)化生產(chǎn)，篩選高產(chǎn)surfactin生產(chǎn)菌株及降低生產(chǎn)原料成本勢在必行。

本研究根據(jù)surfactin性質(zhì)及其編碼基因，通過TLC和UPLC-ESI/Q-TOF MS定性定量分析，篩選分離得到1株surfactin產(chǎn)量較高的菌株41-3。經(jīng)過形態(tài)學(xué)觀察和16S rDNA分子生物學(xué)實驗，菌株41-3為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。另外，在MSM培養(yǎng)基中，枯草芽孢桿菌41-3surfactin產(chǎn)量為541.32 mg/L。然而，使用BSG酶解液作為碳源發(fā)酵生產(chǎn)surfactin，surfactin產(chǎn)量提高了1.38倍，達到746.35 mg/L。經(jīng)過同系物分析比較，以BSG酶解液為碳源生產(chǎn)surfactin，長脂肪鏈的同系物含量提高，意味著BSG不僅僅可以作為碳源生產(chǎn)surfactin，而且surfactin的生物活性也隨著長脂肪鏈的同系物含量提高而增強。