謝文娟，吳殿輝，李曉敏，蔡國(guó)林，謝廣發(fā)，陸健*

1(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無(wú)錫，214122)2(糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無(wú)錫，214122)3(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122) 4(浙江樹(shù)人大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州，310015)

氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate，EC)，又名尿烷(urethane)，不易揮發(fā)，溶于水和有機(jī)溶劑(乙醇、氯仿、乙醚、苯等)[1]。EC普遍存在于腐乳、醬油等發(fā)酵食品及清酒、黃酒、葡萄酒、威士忌、白蘭地等酒精飲料中[2-4]，被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(International Agency for Research on Cancer，IARC)列為2A類(lèi)致癌物質(zhì)，而且限定了其使用范圍[5]。鑒于酒精飲品是人體攝入EC的主要來(lái)源，加拿大和捷克等國(guó)家紛紛對(duì)市場(chǎng)上各類(lèi)酒精飲品中EC的含量規(guī)定了限量標(biāo)準(zhǔn)[6]。

黃酒中的EC主要是是由尿素和乙醇自發(fā)反應(yīng)生成的，黃酒發(fā)酵液中尿素含量的多少直接影響EC含量的高低[7]。因而，降低發(fā)酵液中尿素的含量是減少黃酒中EC含量的首要途徑。黃酒中的尿素主要由釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的精氨酸酶(由CAR1編碼)降解精氨酸生成。尿素既可以被脲基酰胺酶(由DUR1,2編碼)水解為NH3和CO2，也可以被分泌到胞外進(jìn)入發(fā)酵醪液。在氮源不足的情況下，由DUR3基因編碼的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以將發(fā)酵液中的尿素轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)，作為氮源供釀酒酵母生長(zhǎng)和代謝所用。在降低發(fā)酵酒中尿素含量的探索中，更多的學(xué)者集中在對(duì)精氨酸酶、脲基酰胺酶以及尿素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的單一代謝改造研究，通過(guò)敲除CAR1[8-10]、過(guò)表達(dá)DUR1,2[11-12]或DUR3[13-14]等策略來(lái)降低發(fā)酵酒中尿素的含量。也有學(xué)者對(duì)其中的2個(gè)基因同時(shí)進(jìn)行改造以降低發(fā)酵酒中尿素的含量[15]。分別改造CAR1、DUR1,2、DUR3基因或者雙重改造可以在一定程度上降低發(fā)酵酒中尿素和EC的含量，但是目前尚未見(jiàn)對(duì)3個(gè)基因同時(shí)進(jìn)行代謝改造以降低發(fā)酵液中尿素含量的研究。

本研究將釀酒酵母PGK1(3-磷酸甘油酸激酶基因)的強(qiáng)啟動(dòng)子(PGK1p)作為調(diào)控元件，組建DUR3過(guò)表達(dá)組件“HOL-PGK1p-DUR3-PGK1t-HOR”，利用CRISPR/Cas9技術(shù)[16-17]轉(zhuǎn)化已經(jīng)改造過(guò)CAR1和DUR1,2基因的單倍體菌株S.cerevisiaeNaDUR1,2-Δcar1，通過(guò)同源重組在HO基因位點(diǎn)插入DUR3過(guò)表達(dá)組件，以期構(gòu)建進(jìn)一步降低發(fā)酵液中尿素含量的酵母工程菌，從而減少黃酒中EC的形成，提高黃酒的飲用安全性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌(Escherichiacoli)JM109、pMGKR質(zhì)粒(攜帶釀酒酵母PGK1的強(qiáng)啟動(dòng)子PGK1p)由本實(shí)驗(yàn)室保存。單倍體黃酒酵母S.cerevisiaeNa(MATa)和工程菌S.cerevisiaeNaDUR1,2-Δcar1(MATaura3car1::ura3 Φ(DUR1,2-URA3-PGK1p))由本實(shí)驗(yàn)室分離和構(gòu)建[18-19]。其中單倍體S.cerevisiaeNa是通過(guò)敲除二倍體黃酒酵母N85的HO基因分離獲得[18]，工程菌S.cerevisiaeNaDUR1,2-Δcar1是通過(guò)敲除S.cerevisiaeNa菌株的CAR1基因和過(guò)表達(dá)DUR1,2基因獲得[19]。CRISPR/Cas9質(zhì)粒含有核酸酶Cas9蛋白和G418抗性基因KanMX，購(gòu)于Addgene公司。sgRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)框由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.1.2 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、G418篩選培養(yǎng)基(YPD加入350 μg/mL G418硫酸鹽)分別用于酵母菌的培養(yǎng)和保存、大腸桿菌的培養(yǎng)和保存、酵母轉(zhuǎn)化子的篩選。

1.1.3 酶和主要試劑

Prime STAR DNA polymerase、ExTaqDNA polymerase、rTaqDNA polymerase、T4 DNA Ligase、SphI、NotI、pMD19-T Vector：寶生物工程(大連)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒，DNA膠回收試劑盒，氨芐青霉素(Amp)，G418硫酸鹽：生工生物工程(上海)有限公司；引物合成及DNA片段測(cè)序均由生工生物工程(上海)有限公司完成。

1.1.4 主要儀器

Powerpac Basic高電流電泳儀、Mastercycler pro PCR儀，德國(guó)Eppendorf公司；JD-801凝膠成像儀，江蘇省捷達(dá)科技發(fā)展有限公司；Gene Pulser Xcell電擊轉(zhuǎn)化儀，美國(guó)Bio-Rad公司；Agilent 1260高效液相色譜儀、ZORBAX Eclipse XDB C18(250 mm×4.6 mm×5 μm)色譜柱，美國(guó)Agilent公司。

1.1.5 引物設(shè)計(jì)及合成

按照釀酒酵母S.cerevisiaeS288C的PGK1p、HO與DUR3基因的核苷酸序列，設(shè)計(jì)表1中的擴(kuò)增引物。

表1 實(shí)驗(yàn)中用到的引物Table 1 Primers used in the study

注：下劃線表示用于融合PCR的重疊序列；*表示加粗斜體為SphI酶切位點(diǎn)；#表示加粗斜體為NotI酶切位點(diǎn)

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 釀酒酵母DUR3基因過(guò)表達(dá)組件的構(gòu)建

本研究基于融合PCR的原理，將釀酒酵母DUR3基因置于其自身的強(qiáng)啟動(dòng)子PGK1p調(diào)控之下。DUR3基因過(guò)表達(dá)組件的構(gòu)建如圖1所示。

圖1 DUR3基因過(guò)表達(dá)組件的組建示意圖Fig.1 Illustration of the construction of DUR3 over-expression cassette

首先，提取釀酒酵母S.cerevisiaeNa的基因組作為模板，分別以HO-L-1/HO-L-2，HO-R-1/HO-R-2，DUR3-1/DUR3-2為引物，擴(kuò)增HO上游同源臂(HOL)、HO下游同源臂(HOR)和DUR3片段。以PGK1p-F/PGK1p-R，PGK1t-F/PGK1t-R為引物，pMGKR質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增獲得PGK1基因的啟動(dòng)子PGK1p和終止子PGK1t。以HOL、HOR、PGK1p、DUR3、PGK1t為模板，HO-L-1/HO-R-2為引物，采用一種已報(bào)道的構(gòu)建基因組件的高效方法[14]獲得DUR3過(guò)表達(dá)組件“HOL-PGK1p-DUR3-PGK1t-HOR”。

1.2.2 CRISPR-DUR3質(zhì)粒的構(gòu)建

以HO-F/gRNA-R為引物，以HOL-PGK1p-DUR3-PGK1t-HOR、sgRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)框?yàn)槟０?，采用一種已報(bào)道的構(gòu)建基因組件的高效方法[18]，由融合PCR得到DUR3基因過(guò)表達(dá)組件“HOL-PGK1p-DUR3-PGK1t-HOR-sgRNA”。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后進(jìn)行T克隆，得到質(zhì)粒pMD19-DUR3-sgRNA，并測(cè)序驗(yàn)證其序列的正確性。

質(zhì)粒CRISPR-Vector與pMD19-DUR3-sgRNA分別經(jīng)SphI和NotI雙酶切(圖2)，瓊脂糖凝膠電泳后回收線性化的質(zhì)粒CRISPR-Vector (13466 bp)和DUR3-sgRNA片段(4537 bp)，利用T4 DNA連接酶連接并轉(zhuǎn)化E.coliJM109構(gòu)建CRISPR-DOR3質(zhì)粒，挑取陽(yáng)性克隆子提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)PCR和酶切，送樣測(cè)序驗(yàn)證。

圖2 CRISPR-DUR3質(zhì)粒的構(gòu)建Fig.2 Construction of CRISPR-DUR3

1.2.3 電轉(zhuǎn)化單倍體S.cerevisiaeNaDUR1,2-Δcar1以及轉(zhuǎn)化子的鑒定

將構(gòu)建的質(zhì)粒CRISPR-DUR3通過(guò)高效電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化釀酒酵母S.cerevisiaeNaDUR1,2-Δcar1[20-22]，并涂布于G418篩選培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)至長(zhǎng)出轉(zhuǎn)化子，以HO-L-1/HO-R-2為引物進(jìn)行菌落PCR初步驗(yàn)證，并提取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的基因組，以HO-L-1/HO-R-2為引物再次驗(yàn)證，送樣測(cè)序驗(yàn)證。

將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接到不含抗性的YPD液體培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)10代以上，丟失CRISPR-DUR3質(zhì)粒，最終得到不含外源抗性基因的釀酒酵母工程菌。

1.2.4 工程菌S.cerevisiaeNaDUR1,2/DUR3-Δcar1中DUR3基因轉(zhuǎn)錄水平驗(yàn)證

1.2.5 實(shí)驗(yàn)室規(guī)模黃酒釀造實(shí)驗(yàn)

分別以出發(fā)菌株S.cerevisiaeNaDUR1,2-Δcar1、親本菌株S.cerevisiaeNa及本研究構(gòu)建的釀酒酵母工程菌S.cerevisiaeNaDUR1,2/DUR3-Δcar1進(jìn)行黃酒釀造實(shí)驗(yàn)。黃酒發(fā)酵工藝流程按照文獻(xiàn)進(jìn)行[24]。

1.2.6 黃酒發(fā)酵液指標(biāo)測(cè)定

黃酒發(fā)酵液中氨基酸態(tài)氮、pH值、總酸、酒精度和總糖等指標(biāo)的測(cè)定按照國(guó)標(biāo)GB/T13662-2008黃酒的測(cè)定方法[25]。

1.2.7 黃酒發(fā)酵液中尿素含量的測(cè)定

采用高效液相色譜法，結(jié)合熒光檢測(cè)器測(cè)定黃酒發(fā)酵液中尿素的含量[26]。

1.2.8 黃酒發(fā)酵液中EC含量的測(cè)定

發(fā)酵液中EC含量的測(cè)定采用固相萃取-同位素稀釋法[2]。

2 結(jié)果與分析

2.1 釀酒酵母工程菌的構(gòu)建與鑒定

2.1.1DUR3基因過(guò)表達(dá)組件及CRISPR-DUR3質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

按照1.2.1中所述的融合PCR方法獲得DUR3基因過(guò)表達(dá)組件“HOL-PGK1p-DUR3-PGK1t-HOR”。由圖3的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，PCR擴(kuò)增獲得的DUR3過(guò)表達(dá)組件大小為4 087 bp，與預(yù)期片段大小相符，并通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證了其序列的正確性。然后，按照1.2.2的方法，將含有DUR3基因過(guò)表達(dá)組件的T克隆質(zhì)粒與CRISPR-Vector分別進(jìn)行雙酶切，在DNA連接酶的作用下構(gòu)建含有DUR3過(guò)表達(dá)組件和sgRNA片段的CRISPR-DUR3質(zhì)粒，并通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證了其序列的正確性。

M-5kb Marker; 1- DUR3過(guò)表達(dá)組件“HOL-PGK1p-DUR3-PGK1t-HOR”的PCR產(chǎn)物圖3 DUR3基因過(guò)表達(dá)組件的PCR驗(yàn)證Fig.3 The verification of DUR3 overexpression cassette by PCR

2.1.2 過(guò)表達(dá)DUR3基因的釀酒酵母工程菌的構(gòu)建

因CRISPR-DUR3質(zhì)粒帶有G418抗性，因此，CRISPR-DUR3質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化S.cerevisiaeNaDUR1,2-Δcar1后獲得的釀酒酵母轉(zhuǎn)化子可以在G418篩選培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。提取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的基因組，用HO-L-1/HO-R-2作為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證,如圖4所示。

M-5kb Marker；1-以S. cerevisiae NaDUR1,2-Δcar1的基因組為模板的PCR產(chǎn)物；2-以S. cerevisiae NaDUR1,2/DUR3-Δcar1的基因組為模板的PCR產(chǎn)物圖4 酵母工程菌轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定電泳圖Fig.4 Screening of transformations of overexpression cassette by PCR

陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子可以擴(kuò)增出1條4 087 bp大小的片段，與基因表達(dá)組件“HOL-PGK1p-DUR3-PGK1t-HOR”的大小相符；而陰性對(duì)照則只能得到1049 bp大小的HO基因片段。回收和純化4 087 bp大小的片段后，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證了其序列的正確性。表明DUR3過(guò)表達(dá)組件在CRISPR/Cas9的作用下成功整合到S.cerevisiaeNaDUR1,2-Δcar1菌株的基因組。獲得的酵母工程菌命名為S.cerevisiaeNaDUR1,2/DUR3-Δcar1。由圖5可知，將工程菌S.cerevisiaeNaDUR1,2/DUR3-Δcar1在YPD培養(yǎng)基中連續(xù)傳代培養(yǎng)10代以后，工程菌不能在含有G418的平板上生長(zhǎng)，說(shuō)明CRISPR-DUR3質(zhì)粒已丟失，工程菌S.cerevisiaeNaDUR1,2/DUR3-Δcar1不含外源抗性基因。

A-工程菌S. cerevisiae NaDUR1,2/DUR3-Δcar1在YPD平板上的培養(yǎng)結(jié)果； B-工程菌S. cerevisiae NaDUR1,2/DUR3-Δcar1在G418篩選培養(yǎng)基平板上的培養(yǎng)結(jié)果圖5 連續(xù)傳代培養(yǎng)10代后釀酒酵母工程菌S. cerevisiae NaDUR1,2/DUR3-Δcar1在不同培養(yǎng)基平板上的培養(yǎng)結(jié)果Fig.5 The growth of modified strain S. cerevisiae NaDUR1,2/DUR3-Δcar1 on different medium plate after 10 generation of continuous culture

2.2 工程菌S. cerevisiae NaDUR1,2/DUR3-Δcar1中DUR3基因轉(zhuǎn)錄水平驗(yàn)證結(jié)果

如圖6所示,DUR3基因過(guò)表達(dá)組件“HOL-PGK1p-DUR3-PGK1t-HOR”在酵母基因組重組后，構(gòu)建的工程菌S.cerevisiaeNaDUR1,2/DUR3-Δcar1的DUR3基因表達(dá)水平提高，相較出發(fā)菌株S.cerevisiaeNaDUR1,2-Δcar1，在12、24、36、48 h，DUR3基因的轉(zhuǎn)錄水平分別提高了2.1倍、3.7倍、2.3倍和2.2倍，說(shuō)明強(qiáng)啟動(dòng)子PGK1p的插入明顯提高了工程菌DUR3 基因的轉(zhuǎn)錄水平。

圖6 代謝改造對(duì)酵母DUR3基因表達(dá)量的影響Fig.6 Effects of metabolic engineering on the expression of DUR3

2.3 釀酒酵母工程菌發(fā)酵性能的驗(yàn)證

將構(gòu)建的工程菌S.cerevisiaeNaDUR1,2/DUR3-Δcar1與親本菌株S.cerevisiaeNa及出發(fā)菌株S.cerevisiaeNaDUR1,2-Δcar1分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室三角瓶黃酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，考察工程菌在黃酒發(fā)酵過(guò)程中的生長(zhǎng)和發(fā)酵性能。由CO2失重曲線(圖7)可知，工程菌與親本菌株和出發(fā)菌株的失重曲線一致，說(shuō)明其發(fā)酵能力與親本菌株和出發(fā)菌株基本相同。

圖7 工程菌黃酒發(fā)酵過(guò)程中CO2失重曲線Fig.7 Loss weight of CO2during the fermentation of Chinese rice wine by engineered strain

由表2檢測(cè)結(jié)果可知，工程菌與親本菌株和出發(fā)菌株發(fā)酵液的總糖、總酸、氨基酸態(tài)氮和酒精含量以及pH值基本沒(méi)有差異，說(shuō)明對(duì)出發(fā)菌株S.cerevisiaeNaDUR1,2-Δcar1的DUR3基因進(jìn)行代謝工程改造沒(méi)有影響其生長(zhǎng)和發(fā)酵性能。

2.4 釀酒酵母工程菌降低發(fā)酵液中尿素和EC能力的考察

如表2所示，過(guò)表達(dá)DUR3基因的酵母工程菌S.cerevisiaeNaDUR1,2/DUR3-Δcar1發(fā)酵液中尿素的含量為(3.0±0.4)mg/L，與親本菌株S.cerevisiaeNa(38.0±0.8) mg/L和出發(fā)菌株S.cerevisiaeNaDUR1,2-Δcar1(5.3±0.5)mg/L相比，分別降低了92.1%和43.4%。

表2 黃酒發(fā)酵液中理化指標(biāo)及尿素和EC含量的測(cè)定Table 2 Measurement of the concentrations of metabolites and urea and EC in Chinese rice wine samples by different strains

尿素是黃酒發(fā)酵液中EC形成的主要前體物質(zhì)，因此工程菌發(fā)酵液中EC含量也顯著降低(表2)。與親本菌株和出發(fā)菌株相比，S.cerevisiaeNaDUR1,2/DUR3-Δcar1發(fā)酵液中EC含量[(17.1±1.2)μg/L]分別降低了58.6%和16.2%。說(shuō)明過(guò)表達(dá)DUR3基因的釀酒酵母工程菌可以在黃酒發(fā)酵過(guò)程中吸收醪液中的尿素，從而進(jìn)一步降低了發(fā)酵液中尿素的含量，減少了EC的形成。

3 討論

釀酒酵母HO基因能夠使單倍體的接合型MATa和MATα發(fā)生轉(zhuǎn)變，然后與周?chē)膯伪扼w發(fā)生同宗融合形成二倍體，而該基因的表達(dá)對(duì)酵母自身的生長(zhǎng)和代謝并無(wú)影響。本研究將構(gòu)建的DUR3基因過(guò)表達(dá)組件通過(guò)同源重組整合在釀酒酵母基因組的HO位點(diǎn)，可以在不影響酵母生長(zhǎng)和代謝的情況下實(shí)現(xiàn)DUR3基因的過(guò)表達(dá)。此外，借助CRISPR/Cas9基因組編輯系統(tǒng)和一段短的單鏈引導(dǎo)RNA (single guide RNA, sgRNA)對(duì)釀酒酵母特定的DNA序列進(jìn)行識(shí)別并高效編輯，無(wú)外源基因殘留于酵母基因組上，具有生物安全性。

氨基甲酸乙酯(EC)是存在于黃酒中的潛在致癌物，主要由尿素和乙醇自發(fā)反應(yīng)形成。所以降低發(fā)酵液中尿素的含量可以從根源上減少黃酒中EC的形成。黃酒中大部分的尿素是由釀酒酵母在發(fā)酵過(guò)程中代謝精氨酸產(chǎn)生，而釀造原料也會(huì)帶入少量尿素。因此，本研究以前期構(gòu)建的工程菌S.cerevisiaeNaDUR1,2-Δcar1為出發(fā)菌株，在敲除CAR1和過(guò)表達(dá)DUR1,2基因的基礎(chǔ)上過(guò)表達(dá)DUR3基因，成功構(gòu)建具有“尿素吸收”功能的工程菌S.cerevisiaeNaDUR1,2/DUR3-Δcar1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與出發(fā)菌株S.cerevisiaeNaDUR1,2-Δcar1相比，工程菌S.cerevisiaeNaDUR1,2/DUR3-Δcar1的DUR3基因表達(dá)量顯著提高，而且黃酒發(fā)酵液中尿素和EC的含量分別降低了43.4%和16.2%。說(shuō)明在黃酒發(fā)酵過(guò)程中，工程菌S.cerevisiaeNaDUR1,2/DUR3-Δcar1在不影響釀酒酵母生長(zhǎng)和發(fā)酵性能的前提下，不但可以減少釀酒酵母代謝產(chǎn)生的尿素，還可以將發(fā)酵醪液中由原料帶入的尿素轉(zhuǎn)運(yùn)至酵母胞內(nèi)，從而進(jìn)一步降低發(fā)酵液中尿素的含量，減少EC的形成，具有工業(yè)化應(yīng)用的潛在可能性。