周云冬，章漪玲，宗紅，陸信曜，諸葛斌，沈微

1(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)微生物研究中心，江蘇 無錫，214122)3(江南大學(xué)，中國(guó)高校工業(yè)微生物資源和信息中心，江蘇 無錫，214122)

近年來，由于食用或飲用被食源性致病菌污染了的食品或飲品引起的疾病頻發(fā)，食品安全受到國(guó)際社會(huì)越來越多的重視，成為公眾所關(guān)心的熱點(diǎn)[1]。餐飲食品是導(dǎo)致各類食物中毒和食源性疾病發(fā)生的主要來源，其中導(dǎo)致水產(chǎn)品、肉類及涼拌即食食品腐敗變質(zhì)的是革蘭氏陰性銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[2-4]。同時(shí)，銅綠假單胞菌也是一種機(jī)會(huì)致病菌，是引起免疫力低下患者慢性感染的常見病原體[5]；常會(huì)引起呼吸系統(tǒng)感染，尿路感染，腸道傳染病感染，傷口形成綠色膿液等[6-7]。銅綠假單胞菌已成為危害人類健康的重要污染源之一。

牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.，PSABE)除了其根皮(牡丹皮)是一種重要的中藥外，牡丹花也有重要的食用和藥用價(jià)值，具有清熱解毒、活血等功效[8]。目前，國(guó)內(nèi)外研究表明，牡丹花中含有沒食子酸、芍藥苷、山奈酚3,7-二-O-葡萄糖苷、1,2,3,4,6-O-五沒食子?；咸烟堑扔行С煞?，具有較強(qiáng)的抗腫瘤、清除自由基，抗氧化等活性[9-11]。然而迄今為止，牡丹花抑菌活性方面的研究報(bào)道甚少，關(guān)于牡丹花的抑菌機(jī)理尚未見報(bào)道。因此，本研究以銅綠假單胞菌為試驗(yàn)菌，探究牡丹花蕾提取物對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌活性及其抑菌機(jī)理，以期為牡丹花蕾提取物應(yīng)用于水產(chǎn)品及肉類等食品保鮮提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

P.aeruginosaATCC 27853，本研究室保藏。

牡丹花蕾，無錫市中藥店；N-苯基-1-萘胺(NPN)、14%三氟化硼甲醇溶液，Alaladin；KOH、NaCl、無水Na2SO4、甲醇、正己烷、戊二醛、無水乙醇,為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DHG-9075A電恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；R220E真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士步琦工業(yè)有限公司；12Plus低溫冷凍干燥機(jī)，美國(guó)Labconco公司；synergy H4多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)伯騰儀器有限公司；Thermos-21R高速冷凍離心機(jī)，上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司；F-7 000熒光分光光度計(jì)，日本Hitachi公司；TSQ8000三重四級(jí)桿氣質(zhì)聯(lián)用儀，美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；SU8220冷場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡，日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 牡丹花蕾提取物制備

牡丹花蕾去除表面損傷和微生物污染部分，在60 ℃下烘干至恒重，研磨成細(xì)粉。在體積分?jǐn)?shù)70%乙醇、60 ℃、料液比1∶20(g∶mL)的條件下浸提2 h，真空過濾收集濾液，重復(fù)2次。40 ℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，將濃縮物在4 ℃靜置24 h，上清液使用低溫冷凍干燥機(jī)干燥得干粉，置于4 ℃密封儲(chǔ)存。

1.3.2 最低抑制濃度和最低殺死濃度測(cè)定

參照微量稀釋法[12]，在無菌96孔平底微量培養(yǎng)板中，取100 μL稀釋的牡丹花蕾提取物(終濃度100、50、25、12.5、6.25、3.12、1.56、0.78和0 mg/mL)與菌體濃度為1×108CFU/mL細(xì)菌懸浮液混合，37 ℃培養(yǎng)24 h后，于600 nm處檢測(cè)光密度。光密度變化值<0.05,認(rèn)為是抑制菌體生長(zhǎng)的最低濃度，并被定義為最低抑制濃度(minimum inhibition concentration, MIC)。從大于最低抑制濃度的孔中吸取100 μL細(xì)菌懸浮液均勻涂布于新鮮LB瓊脂平板上，37 ℃?zhèn)鞔囵B(yǎng)24 h后，以每個(gè)平板菌落數(shù)少于5個(gè)定義為最低殺死濃度(minimum bactericide concentration, MBC)。

1.3.3 抑菌圈及抑菌活性穩(wěn)定性研究

將100 mg/mL的牡丹花蕾提取物用濃度為0.1 mol/L NaOH和HCl溶液調(diào)成 9個(gè)pH值梯度: 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7. 0、8.0、9.0、10.0；100 mg/mL牡丹花蕾提取物分別在20、40、60、80、100 ℃下30 min，用瓊脂濾紙片擴(kuò)散法[13]測(cè)定抑菌效果。將100 μL菌體濃度為1×108CFU/mL細(xì)菌懸浮液均勻涂布于LB瓊脂培養(yǎng)基表面，待表面稍干后將浸漬了10 μL牡丹花蕾提取物(相當(dāng)于1 mg劑量)的6 mm無菌濾紙圓盤貼于最上層，以無菌生理鹽水作為陰性對(duì)照，每個(gè)組3個(gè)平行，37 ℃培養(yǎng)24 h后，通過測(cè)量抑制區(qū)直徑(diameter of the inhibition zone, DIZ)評(píng)估pH值和溫度對(duì)牡丹花蕾提取物抑菌活性的影響。

1.3.4 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

參照WU等[14]方法稍作修改。將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期的銅綠假單胞菌轉(zhuǎn)接到含不同濃度(終濃度分別為1/8MIC，1/4MIC，1/2MIC，MIC和MBC)牡丹花蕾提取物的LB液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃條件下培養(yǎng)，每隔2 h測(cè)定OD600的光密度。

1.3.5 細(xì)胞膜脂肪酸分析

將銅綠假單胞菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期中后期，加入牡丹花蕾提取物(終濃度為MIC和MBC)，以無菌生理鹽水作為對(duì)照；在37 ℃孵育3 h后，4 ℃ 4 000×g離心15 min，收集細(xì)胞，用PBS洗滌2次后待用。根據(jù)HUANG等[15]的方法進(jìn)行脂肪酸甲酯化反應(yīng)，氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)鑒定膜脂肪酸。色譜條件：TG-5石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，升溫程序：初始溫度為50 ℃，保持1 min，以10 ℃/min升溫至200 ℃，再以3 ℃/min升溫至250 ℃，最后以10 ℃/min升溫至280 ℃、保持8 min；載氣(He)流速為2.0 mL/min，進(jìn)樣口溫度為220 ℃；進(jìn)樣量為1 μL；分流比為5∶1。質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；四級(jí)桿溫度150 ℃；接口溫度280 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z29～450。

1.3.6 對(duì)細(xì)胞膜膜蛋白影響

銅綠假單胞菌細(xì)胞膜蛋白的熒光光譜測(cè)定參照WANG等[16]的方法并稍有修改，在1×108CFU/mL的細(xì)胞懸浮液中加入不同濃度的KI(終濃度分別為0、0.5×10-2、1.0×10-2、1.5×10-2、2.0×10-2、2.5×10-2、3.0×10-2mol/L)和牡丹花蕾提取物(終濃度分別為0、1/64MIC、1/32MIC、1/16MIC、1/8MIC、1/4MIC、1/2MIC、MIC、MBC)，25 ℃溫育1 h，258、280和296 nm的固定激發(fā)波長(zhǎng)下記錄細(xì)菌樣品的發(fā)射光譜。

1.3.7 細(xì)胞膜通透性測(cè)定

參照NING等[17]方法稍作修改，將不同濃度牡丹花蕾提取物(1/8MIC，1/4MIC，1/2MIC，MIC和MBC)加入菌體濃度為1×108CFU/mL的細(xì)胞懸液中，37 ℃溫育1 h。在4 ℃下4 000×g離心15 min收集細(xì)胞，用PBS洗滌2次并調(diào)節(jié)菌體濃度為1×108CFU/mL，加入N-苯基-1-萘胺(NPN)，使NPN終濃度為0.1 mol/L，用熒光分光光度計(jì)測(cè)定隨時(shí)間變化的熒光強(qiáng)度，直到強(qiáng)度不再變化。熒光光度計(jì)儀器參數(shù)設(shè)置為：激發(fā)光波長(zhǎng)350 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)420 nm，縫隙寬度5 mm，電壓500 mV。

1.3.8 掃描電鏡觀察

參考SHI等[18]的方法觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 牡丹花蕾提取物對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌活性及其穩(wěn)定性

牡丹花蕾提取物對(duì)銅綠假單胞菌的DIZ、MIC及MBC分別為(15.71±0.25)mm，3.13和6.25 mg/mL；提取物對(duì)銅綠假單胞菌抑菌活性的pH值和溫度穩(wěn)定性如圖1所示。由圖1-A可以看出，在常溫下pH 2.0～7. 0，牡丹花蕾提取物具有較好的穩(wěn)定性，抑菌圈直徑在15.42～16.02 mm，在弱堿(pH 8.0～10.0)條件下抑菌活性稍有下降， pH為10.0時(shí)，抑菌圈直徑為自然條件(pH 4.5)的93.04%。由圖1-B可知，牡丹花蕾提取物(自然pH)經(jīng)較低溫度(20～60 ℃)處理30 min后，抑菌活性較穩(wěn)定，抑菌圈直徑處于15.73～15.88 mm；當(dāng)溫度>80 ℃，抑菌圈直徑略有變小，100 ℃時(shí)降至最高值的 88.77%。結(jié)果表明，牡丹花蕾提取物對(duì)pH值和溫度不敏感，具有較好的穩(wěn)定性。

圖1 牡丹花蕾提取物對(duì)銅綠假單胞菌抑菌活性pH(A)和溫度(B)穩(wěn)定性Fig.1 Stability of antibacterial activity of P. suffruticosa extract under different pH (A) and temperature (B)

2.2 牡丹花蕾提取物對(duì)銅綠假單胞菌細(xì)胞生長(zhǎng)影響

如圖2所示，在LB培養(yǎng)基中加入濃度為1/8MIC和1/4MIC的牡丹花蕾提取物，銅綠假單胞菌細(xì)胞的生長(zhǎng)基本不受影響。但當(dāng)添加濃度為MIC的牡丹花蕾提取物，銅綠假單胞菌細(xì)胞的生長(zhǎng)受到顯著抑制，與對(duì)照相比，延滯期延長(zhǎng)，且最終的菌體量?jī)H為對(duì)照的12%。此外，當(dāng)添加濃度為MBC時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)被完全抑制，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

圖2 不同濃度牡丹花蕾提取物下銅綠假單胞菌細(xì)胞生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth curves of P. aeruginosa under different concentrations of P. suffruticosa Andr. buds extract

2.3 銅綠假單胞菌細(xì)胞膜脂肪酸組成和含量變化

不同濃度牡丹花蕾提取物下對(duì)銅綠假單胞菌細(xì)胞膜脂肪酸組成和含量變化如圖3所示，細(xì)胞膜脂肪酸分為飽和脂肪酸(saturated fatty acids, SFAs)，單不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acids, MUFAs)，多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFAs)。從圖3-A可以看出，在提取物0、MIC和MBC濃度下飽和脂肪酸的相對(duì)含量分別為43.73%、46.38%和47.11%，呈上升趨勢(shì)；單不飽和脂肪酸的相對(duì)含量分別為56.27%、53.36%和52.38%，呈下降趨勢(shì)。

圖3 牡丹花蕾提取物不同濃度下銅綠假單胞菌細(xì)胞膜脂肪酸變化Fig.3 The changes of cell membrane fatty acid of P. aeruginosa cells under different concentrations of P. suffruticosa buds extract

即在MIC和MBC濃度下，飽和脂肪酸相對(duì)含量分別提高了6.06%和8.19%，而單不飽和脂肪酸相對(duì)含量分別降低了5.17%和6.91%。這種變化主要是由于十六烷酸(C16∶0)和十八烷酸(C18∶0)相對(duì)含量增加，如圖3-B所示，在MBC濃度下，C16∶0和C18∶0的相對(duì)含量分別從33.31%、1.79%增加到36.89%、2.10%；相反的，單不飽和脂肪酸包括(Z)-9-十六碳烯酸(C16:1ω9(c))、順式-10-十七碳烯酸(C17∶1ω10(c))、(Z)-9-十八碳烯酸(C18∶1ω9(c))和順-10-十九碳烯酸(C19∶1ω10(c))，相對(duì)含量分別從13.08%、2.70%、36.93%和3.56%下降到11.78%、1.92%、35.89%和2.78%。膜的流體性質(zhì)與膜脂肪酸的組成和比例有關(guān)[19]。通常，低熔點(diǎn)脂肪酸(單不飽和脂肪酸) 增加膜流動(dòng)性，而高熔點(diǎn)脂肪酸(飽和脂肪酸)降低膜流動(dòng)性[20]。結(jié)果表明飽和脂肪酸相對(duì)含量增加，單不飽和脂肪相對(duì)含量降低，這種改變導(dǎo)致細(xì)胞膜剛性增加，膜流動(dòng)性降低，細(xì)胞形態(tài)和功能發(fā)生變化，容易引起細(xì)胞死亡。另一方面，細(xì)胞膜脂肪酸不飽和程度也可在一定程度影響銅綠假單胞菌的群集運(yùn)動(dòng)能力[21]。因此，細(xì)胞膜脂肪酸組成的改變導(dǎo)致細(xì)胞膜脂肪酸不飽和程度下降，這可能在一定程度上影響了銅綠假單胞菌生物膜的形成，降低了細(xì)胞膜的流動(dòng)性，從而影響了群集運(yùn)動(dòng)能力，降低了其感染能力。

2.4 銅綠假單胞菌膜蛋白的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象改變

膜蛋白是細(xì)胞膜中最重要的組成部分之一，它具有多種細(xì)胞功能，包括受體結(jié)合、信號(hào)傳遞、擴(kuò)散、膜結(jié)合酶活性以及細(xì)胞與細(xì)胞間的通訊[22]。膜蛋白中含有苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)等氨基酸，可以在膜蛋白中發(fā)出熒光。KI是一種熒光猝滅劑，只猝滅膜蛋白表面殘留的熒光，不能影響位于膜蛋白內(nèi)部或縫隙中殘基的熒光光譜，因此，可以定性地確定Phe、Tyr和Tyr殘基在蛋白質(zhì)中的位置[23-24]。圖4-A、圖4-B和圖4-C分別顯示了KI在258、280和296 nm的固定激發(fā)波長(zhǎng)對(duì)Phe、Trp和Tyr殘基的熒光發(fā)射光譜的影響，隨著KI的增加，Phe的熒光強(qiáng)度顯著下降，Trp和Tyr殘基的熒光猝滅效果不明顯，表明Phe的殘留主要位于膜外，而Trp和Tyr的殘基主要位于膜內(nèi)。從圖5可以看出，在不同濃度牡丹花蕾提取物下，Phe、Trp和Tyr殘基的最大發(fā)射強(qiáng)度逐漸降低，并伴隨著明顯的紅移，這些結(jié)果表明牡丹花蕾提取物與膜蛋白結(jié)合，改變了細(xì)胞膜膜蛋白的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象，使Phe、Trp和Tyr殘基變得更加親水，導(dǎo)致細(xì)胞膜功能障礙和細(xì)胞損傷。

圖4 不同濃度KI下銅綠假單胞菌膜蛋白氨基酸殘基苯丙氨酸(A)，色氨酸(B)和酪氨酸(C)熒光光譜Fig.4 Fluorescence spectra of amino acid residues Phe(A),Trp(B) and Tyr(C) of P. aeruginosa membrane proteins

圖5 不同濃度牡丹花蕾提取物下銅綠假單胞菌膜蛋白氨基酸殘基苯丙氨酸(A)，色氨酸(B)和酪氨酸(C)熒光光譜Fig.5 Fluorescence spectra of amino acid residues Phe(A),Trp(B) and Tyr(C) of P. aeruginosa membrane proteins at the different concentrations of P. suffruticosa buds extract

2.5 銅綠假單胞菌細(xì)胞外膜的通透性

革蘭氏陰性菌由內(nèi)膜和外膜兩層膜包被，完整的外膜是滲透性屏障，不包括疏水性熒光探針，如N-苯基-1-萘胺(NPN)，在水環(huán)境中發(fā)出微弱的熒光，一旦受損，它就可以進(jìn)入細(xì)胞外膜的疏水性環(huán)境(膜內(nèi)部磷脂層)，產(chǎn)生明顯的熒光[25-26]。因此，銅綠假單胞菌細(xì)胞對(duì)NPN的攝取能力反映了牡丹花蕾提取物作用下細(xì)胞外膜通透性變化。如圖6顯示，在低濃度1/8MIC，1/4MIC和1/2MIC處理下，NPN熒光吸收值顯著升高，說明細(xì)胞外膜通透性明顯增大，當(dāng)濃度達(dá)到1/2MIC，細(xì)胞外膜通透性最大。在MBC處理后，NPN熒光吸收值反而下降，這時(shí)觀察銅綠假單胞菌細(xì)胞懸浮液，形成不均勻的絮狀物。由于NPN要進(jìn)入細(xì)胞外膜的疏水環(huán)境中才能發(fā)光，但在MBC濃度下，膜結(jié)構(gòu)遭到破壞，細(xì)胞裂解，NPN將無法進(jìn)入疏水性環(huán)境，從而導(dǎo)致NPN的熒光吸收值下降。因此，在低濃度下提取物增大細(xì)胞膜通透性，當(dāng)濃度達(dá)到MIC，部分細(xì)胞膜受損，濃度增大到MBC時(shí)細(xì)胞破裂，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

圖6 不同濃度牡丹花蕾提取物處理銅綠假單胞菌后攝取NPN的熒光吸收值Fig.6 NPN uptake of P. aeruginosa treated with different concentrations of P. suffruticosa buds extract

2.6 銅綠假單胞菌的細(xì)胞形態(tài)變化

從圖7-A中可以看出，正常銅綠假單胞菌細(xì)胞具有規(guī)則的細(xì)胞形態(tài)，呈桿狀分布，結(jié)構(gòu)完整，見完整的細(xì)胞壁，大量的銅綠假單胞菌黏附，連接成片，見多聚分泌物，呈膜狀包裹的典型生物膜性狀。

A-對(duì)照；B-MIC處理；C-MBC處理圖7 不同濃度牡丹花蕾提取物處理銅綠假單胞菌后掃描電鏡顯微照片F(xiàn)ig.7 SEM photomicrographs of P. aeruginosa treated with different concentrations of P. suffruticosa buds extract

圖7-B顯示，通過濃度MIC牡丹花蕾提取物處理3 h后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯變化，無明顯細(xì)胞壁，細(xì)胞變短，絕大部分細(xì)胞發(fā)生萎縮并出現(xiàn)凹陷，部分細(xì)胞出現(xiàn)干癟或空洞，且無可見生物膜；濃度為MBC牡丹花蕾提取物處理3 h后結(jié)果如圖7-C所示，細(xì)胞形態(tài)完全破壞，大部分細(xì)胞裂解，出現(xiàn)大量細(xì)胞碎片。說明牡丹花蕾提取物抑制銅綠假單胞菌細(xì)胞生長(zhǎng)，清除生物膜，破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

3 結(jié)論

本研究以銅綠假單胞菌為試驗(yàn)菌，初步探討了牡丹花蕾提取物的抑菌活性及抑菌機(jī)理。結(jié)果表明，牡丹花蕾提取物對(duì)銅綠假單胞菌的最低抑制濃度和最低殺死濃度分別為3.13和6.25 mg/mL，且具有較好的穩(wěn)定性；牡丹花蕾提取物使銅綠假單胞菌細(xì)胞膜飽和脂肪酸相對(duì)含量增加，單不飽和脂肪酸相對(duì)含量降低，導(dǎo)致膜流動(dòng)性降低；通過改變膜蛋白結(jié)構(gòu)和構(gòu)象使細(xì)胞膜功能發(fā)生障礙和細(xì)胞損傷；同時(shí)可破壞細(xì)胞膜完整性和增加細(xì)胞外膜的通透性，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此，牡丹花蕾提取物可以作為一種新型的具有應(yīng)用前景的植物源防腐保鮮劑。