侯海娟，龔勁松，翟珅，徐敏，周文斌，陳杰鵬，段麗麗，張曉梅，許正宏,2，史勁松*

1(江南大學(xué) 藥學(xué)院，糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122)2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122)3(廣東雙駿生物科技有限公司，廣東 汕頭,515071)

磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)于1942年由JORDI FLOCH首次從牛腦中提取出來，隨后對(duì)其進(jìn)行了分子結(jié)構(gòu)的定性分析[1]。它是磷脂中一種能夠調(diào)控膜蛋白功能狀態(tài)的磷脂[2]，在細(xì)胞膜的磷脂雙分子層中占有10%～20%[3]，由于能夠改善記憶力，并對(duì)抑郁癥有良好的抑制作用[4]，被稱為“腦專一性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)”[5-6], PS在功能食品和制藥領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景[7-8]。近年來,人們對(duì)PS的關(guān)注度越來越高。

PS對(duì)人體生命活動(dòng)具有關(guān)鍵作用，但其在自然界中的含量較少，隨著目前人們對(duì)PS需求量日益增加，高效制備PS的方法越來越受到廣泛關(guān)注。國(guó)內(nèi)外已有不少學(xué)者對(duì)PS的制備方法進(jìn)行研究，目前主要有提取法和生物酶轉(zhuǎn)化法。提取法是指通過有機(jī)溶劑從植物種籽和動(dòng)物細(xì)胞中萃取獲得PS，酶轉(zhuǎn)化法是指利用磷脂酶D(phospholipase D，PLD)的轉(zhuǎn)磷脂酰作用，生物催化合成PS。由于提取法獲得的PS得率較低，且具有攜帶瘋牛病等動(dòng)物流行病毒的安全風(fēng)險(xiǎn)，而酶轉(zhuǎn)化法具備成本較低、操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)工藝綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為了合成PS的理想方法[9-11]。

PLD (EC3.1.4.4)具備水解磷酸二酯鍵和堿基互換的能力[12]。存在于植物、動(dòng)物和微生物中，對(duì)于細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、脂質(zhì)代謝及生物膜形成等代謝過程具有重要作用[13-15]。在眾多細(xì)菌來源的PLD中，鏈霉菌來源的PLD在磷脂合成中具有更好的應(yīng)用潛力[16]。PLD的催化反應(yīng)分為2種：一種是催化底物磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine, PC)的磷酸酯鍵發(fā)生水解反應(yīng)生成磷脂酸(phosphatidic acid, PA)和羥基化合物膽堿；另一種是催化羥基化合物與磷脂?；鶊F(tuán)發(fā)生堿基互換反應(yīng)，也就是磷脂酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)[17-18]。?；D(zhuǎn)移反應(yīng)可利用底物磷脂酰膽堿合成稀有磷脂，例如磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine, PE)、磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol, PI)、磷脂酰絲氨酸(PS)等[19-21]。

早期對(duì)PLD的研究主要集中于野生菌培養(yǎng)發(fā)酵條件的優(yōu)化[22-25]。但由于野生菌發(fā)酵周期長(zhǎng)，培養(yǎng)條件復(fù)雜，越來越多的研究者采用異源表達(dá)的方法生產(chǎn)PLD[26]。ZAMBONELLI等[27]以StreptomycesPMF的全基因組為模板，擴(kuò)增獲得了一段PLD序列，并將其表達(dá)在E.coliBL21(DE3)pLysE中，酶活為0.015 U/mL。本研究為實(shí)現(xiàn)PLD應(yīng)用于生物催化制備PS，嘗試將來源于鏈霉菌的PLD基因在研究相對(duì)成熟的大腸桿菌體系中進(jìn)行異源表達(dá)和表征，并探究PLD在有機(jī)相-水相雙向體系下的PS合成工藝條件，為生物法制備PS奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

克隆宿主E.coliJM109、表達(dá)宿主E.coliBL21(DE3)、載體pET-28a(+)均為本研究室保藏。

1.1.2 主要儀器與試劑

Waters 1525液相儀，美國(guó)Waters公司；大豆卵磷脂PC60(PC含量為60%)、膽堿氧化酶、過氧化物酶、磷脂酰絲氨酸(PS,99%)，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；酵母粉、蛋白胨，Thermo Scientific公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純和化學(xué)純。

底物卵磷脂溶液：稱取88 mg PC60溶于10 mL底物緩沖液(40 mmol/L Tris-HCl pH 7.5)。

4-氨基安替比林溶液(4-ATT)：0.058 g溶于40 mL Tris-HCl (40 mmol/L，pH 7.5)。

苯酚溶液：0.247 g溶于40 mL Tris-HCl (40 mmol/L，pH 7.5)。

反應(yīng)終止液：100 mmol/L EDTA溶于40 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5)。

過氧化物酶溶液(12.5 U/mL)：總酶活50 U的過氧化物酶粉末溶于4 mL超純水中。

膽堿氧化酶溶液(12.5 U/mL)：總酶活50 U的膽堿氧化酶粉末溶于4 mL超純水中。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：質(zhì)量濃度10 g/L NaCl、10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母粉；調(diào)節(jié)pH為7.0。滅菌條件：121 ℃，20 min。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a(+)-sspld

以實(shí)驗(yàn)室前期保藏的1條具有良好磷脂酰水解活力的來源于鏈霉菌(Streptomycessp.)的磷脂酶D編碼序列為模板，設(shè)計(jì)攜帶BamHI和HindIII酶切位點(diǎn)的引物，sspldF (CGG GAT CCA TGG CAC GTC ATC CG)、sspldR (CCA AGC TTT TAA TCC TGA CAA AT) 擴(kuò)增目的基因。擴(kuò)增產(chǎn)物以瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證，回收，與本實(shí)驗(yàn)中選用的表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)在37℃進(jìn)行雙酶切后連接，轉(zhuǎn)化E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞，取單菌落進(jìn)行菌落PCR，提取重組質(zhì)粒后進(jìn)行酶切和測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.2 表達(dá)重組質(zhì)粒pET-28a(+)-sspld

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21，轉(zhuǎn)化子接種于LB培養(yǎng)基培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.6～0.8時(shí),加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，25 ℃搖床培養(yǎng)8 h，離心收集菌體。用緩沖液洗滌重懸菌體，并進(jìn)行超聲破碎，離心后獲得的上清液即為含PLD的粗酶液。

1.2.3 酶活檢測(cè)

60 ℃條件下，40 μL酶液與60 μL底物卵磷脂溶液反應(yīng)20 min，加入50 μL反應(yīng)終止液后于100 ℃沸水浴5 min，6 000 r/min離心5 min，吸取上清加入60 μL膽堿氧化酶、200 μL苯酚溶液、200 μL 4-氨基安替比林溶液和40 μL過氧化物酶，反應(yīng)液于37 ℃反應(yīng)20 min。取反應(yīng)液于OD505處測(cè)定吸光值。酶活定義：每小時(shí)催化1 μmol膽堿所用酶液即為1個(gè)酶活單位(U/mL)。

1.2.4 培養(yǎng)條件優(yōu)化

依次對(duì)初始誘導(dǎo)條件(25 ℃搖床培養(yǎng)8 h, OD600達(dá)到0.6～0.8時(shí)加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG)進(jìn)行優(yōu)化。設(shè)置其他條件不變，改變誘導(dǎo)溫度(15、20、25、30、35 ℃)；在最佳誘導(dǎo)溫度下設(shè)置其他條件不變，改變誘導(dǎo)時(shí)間(8、10、12、14、16 h)；設(shè)置IPTG濃度不變，在最優(yōu)誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間下改變加入誘導(dǎo)劑時(shí)的初始菌體濃度OD600(0.6、0.8、1.0、1.2、1.4)；在前面3種最優(yōu)條件下，改變IPTG濃度(0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 mmol/L)。

1.2.5 酶學(xué)性質(zhì)

最適pH值和pH穩(wěn)定性：配制不同緩沖液體系(pH 4.0～10.0, pH值間隔0.5)，替代標(biāo)準(zhǔn)PLD酶活檢測(cè)方法中所使用的pH 7.5，40 mmol/L的Tris-HCl緩沖液，以酶活力最高的樣品為對(duì)照，設(shè)置值為100%；將酶液分別在不同pH值下放置60 min，進(jìn)行殘余酶活的檢測(cè)，以未經(jīng)任何處理的酶液作為對(duì)照。

最適溫度和溫度穩(wěn)定性：在初始緩沖液體系中，取適量酶液分別測(cè)定其在不同溫度下(20～80 ℃，間隔5 ℃)的酶活力，以酶活測(cè)定最高值作為100%；將酶液分別在不同溫度下放置60 min后進(jìn)行殘余酶活的測(cè)定，以未經(jīng)任何處理的酶液作為對(duì)照。

金屬離子及化學(xué)試劑：將NaCl、KCl、LiCl、CoCl2、MnCl2、CaCl2、MgCl2、CuCl2、FeCl3、FeCl2、BaCl2、AgCl3、ZnSO4、Al2(SO4)3、β-巰基乙醇、DTT、SDS、PMSF、EDTA等化學(xué)試劑分別配制成10、50 mmol/L母液，在酶液中分別加入適量母液，使其終濃度分別為1、5 mmol/L。于4 ℃條件下放置60 min后，測(cè)定酶的殘留活性，并以無上述試劑加入的酶液為對(duì)照，計(jì)算酶的相對(duì)活性。

1.2.6 產(chǎn)物PS的檢測(cè)分析

采用HPLC檢測(cè)，色譜柱：Vensil XBP Silica(5 μm，250 mm×4.6 mm)；流動(dòng)相：V(正己烷)∶V(異丙醇)∶V(25 mmol/L乙酸銨溶液)=8∶8∶1；柱溫：30 ℃；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)器：ELSD蒸發(fā)光檢測(cè)器；漂移管溫度：65 ℃；霧化器氮?dú)饬魉伲?.8 SLPM。

1.2.7 PS的制備工藝優(yōu)化

初始催化體系：有機(jī)相為8 mL乙酸乙酯，PC60質(zhì)量濃度為8 mg/mL；水相為8 mL粗酶液，其中包含200 mgL-絲氨酸；兩相液體混合反應(yīng)12 h。PS即存在于有機(jī)相中。

工藝優(yōu)化：對(duì)不同的催化條件進(jìn)行優(yōu)化，包括有機(jī)溶劑的種類(乙醚、正己烷、乙酸乙酯、氯仿)，底物濃度比(L-Ser∶PC，1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1)，有機(jī)相和水相體積比(4∶4、4∶3、4∶2、4∶1)以及反應(yīng)溫度(25、30、35、40、45、50 ℃)。PS產(chǎn)率定義：HPLC檢測(cè)到的PS濃度與初始投入的PC60濃度的百分比。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組菌株的構(gòu)建

通過PCR擴(kuò)增獲得攜帶有酶切位點(diǎn)的sspld序列，電泳分析顯示目的基因大小為1 600 bp左右，如圖1-a所示。

圖1 重組質(zhì)粒PCR驗(yàn)證(a)，重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物核酸電泳圖(b)和重組菌的SDS-PAGE分析(c)Fig.1 PCR amplification of the pld gene (a)， restriction endonucleases digestive identification of recombinant plasmids (b) and SDS-PAGE analysis of recombinant strains (c)注：圖1-a中，M-Marker;1-sspld;圖1-b中，M-Marker;1- sspld;圖1-c中，M-Marker;1-E. coli BL21/pET-28a(+);2-E. coli BL21/pET-28a(+)-sspld

雙酶切驗(yàn)證結(jié)果如圖1-b所示，在1 600 bp左右有目的條帶存在，5 000 bp位置處條帶與表達(dá)載體pET-28a(+)大小一致。結(jié)合測(cè)序結(jié)果，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。將其轉(zhuǎn)化E.coliBL21，經(jīng)菌液PCR、提取質(zhì)粒酶切及測(cè)序驗(yàn)證，獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，并接種于LB培養(yǎng)基發(fā)酵誘導(dǎo)產(chǎn)酶。重組菌株E.coliBL21/pET-28a(+)-sspld發(fā)酵酶液經(jīng)分子量分析，結(jié)果如圖1-c所示，蛋白大小約為60 kDa，與其理論值一致。酶活檢測(cè)結(jié)果顯示以卵磷脂為底物其酶活能達(dá)到17.07 U/mL。

2.2 重組菌株誘導(dǎo)條件優(yōu)化

誘導(dǎo)條件的改變對(duì)菌體的生長(zhǎng)速度和產(chǎn)酶有著重要影響。由圖2可知，初始誘導(dǎo)溫度為20 ℃時(shí)發(fā)酵酶活最高。加入IPTG的最佳時(shí)間應(yīng)為重組菌生長(zhǎng)至OD600為1.0。當(dāng)IPTG終濃度為0.5 mmol/L時(shí)，重組菌誘導(dǎo)發(fā)酵所產(chǎn)PLD的酶活可達(dá)最高。重組菌在誘導(dǎo)14 h時(shí)酶活達(dá)到最高，繼續(xù)增加誘導(dǎo)時(shí)間，酶活逐漸降低。最終，重組菌經(jīng)優(yōu)化后酶活最高可達(dá)38.58 U/mL，是優(yōu)化前的2.26倍。

2.3 酶學(xué)性質(zhì)研究

2.3.1 最適反應(yīng)pH和pH穩(wěn)定性

本研究首先對(duì)粗酶液的最適反應(yīng)pH以及在不同pH下的酶活穩(wěn)定性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。由圖3可知，PLD粗酶液的最適pH反應(yīng)為7.5。在pH 4.0～7.5，相對(duì)酶活隨著pH的增加而增加，而在pH高于7.5時(shí)，相對(duì)酶活則開始下降，因此中性條件更適合重組酶反應(yīng)，強(qiáng)酸強(qiáng)堿條件容易使酶變性失活，這與來源于StreptomycesPMF的PLD性質(zhì)相似[27]?？疾靝H穩(wěn)定性的結(jié)果表明，PLD粗酶液在pH 6.5～8.5比較穩(wěn)定，殘余酶活保持在80%以上。

2.3.2 最適反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性

由圖4可知，PLD重組菌的最適反應(yīng)溫度為60 ℃。在20～60 ℃，相對(duì)酶活隨著溫度的增加逐漸增加，而在更高溫度條件下，相對(duì)酶活開始緩慢下降，可能是因?yàn)樵谶^高溫度下，酶蛋白的空間結(jié)構(gòu)迅速被破壞，使得酶活大幅度降低[28]。磷脂酶D重組菌在55 ℃以內(nèi)較穩(wěn)定，在55 ℃時(shí)的殘余酶活為69%，但在高于60 ℃條件下殘余酶活則急劇下降。

2.3.3 金屬離子及化學(xué)試劑對(duì)酶活的影響

金屬離子對(duì)酶活也會(huì)產(chǎn)生重要影響，由表1可知，在加入蛋白抑制劑后，磷脂酶D粗酶液酶活被2-ME、DTT、SDS和PMSF部分抑制，而被EDTA幾乎完全抑制，在5 mmol/L的EDTA作用下，酶活僅為對(duì)照的6%。在加入金屬離子后，Mg2+、Na+和Mn2+在1和5 mmol/L下對(duì)酶活均沒有明顯影響；K+、Cu2+、Li+、Ba2+、Ca2+、Co2+、Fe3+、Zn2+和Al3+對(duì)酶活具有促進(jìn)作用。Ca2+對(duì)酶活的促進(jìn)作用最為明顯，5 mmol/L的Ca2+可使酶活提高至對(duì)照的134%。

圖2 誘導(dǎo)溫度(a), OD600 (b), IPTG濃度(c)和誘導(dǎo)時(shí)間(d)對(duì)酶活的影響Fig.2 Effect of induction temperature (a), induction opportunity (b), IPTG concentration (c) and induction time (d) on PLD activity

圖3 pH及穩(wěn)定性對(duì)酶活的影響Fig.3 Effect of pH and pH stability on PLD activity and stability

圖4 溫度及穩(wěn)定性對(duì)酶活的影響Fig.4 Effect of temperature and temperature stability on PLD activity and stability

表1 金屬離子及化學(xué)試劑對(duì)PLD酶活影響Table 1 Effects of met al ion and chemical reagents on PLD activity

2.4 PS的制備工藝優(yōu)化

為篩選出PLD催化制備PS的最適條件，本研究對(duì)轉(zhuǎn)化條件中的有機(jī)溶劑種類、有機(jī)相與水相體積比、底物L(fēng)-Ser與PC60的濃度比、轉(zhuǎn)化溫度4個(gè)因素進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化，結(jié)果如圖5所示。以乙酸乙酯為有機(jī)相時(shí)的PS轉(zhuǎn)化率最高，約為14.2%，因此將乙酸乙酯作為催化反應(yīng)中的有機(jī)相。有機(jī)相與水相比例為4∶2，即有機(jī)相為8 mL，水相為4 mL時(shí)，PS的轉(zhuǎn)化率最高，因此選擇有機(jī)相與水相比例為4∶2作為反應(yīng)體系中兩相體積比。隨著L-ser與PC60濃度比增加，PS轉(zhuǎn)化率逐漸增大，當(dāng)比例為5∶1，即PC60質(zhì)量濃度為8 mg/mL，L-ser質(zhì)量濃度為40 mg/mL時(shí)，轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高，因此選擇反應(yīng)體系中底物L(fēng)-ser和PC60的最適濃度比為5∶1。在此基礎(chǔ)上對(duì)轉(zhuǎn)化溫度進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示當(dāng)反應(yīng)溫度為40 ℃時(shí)，PS轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高為28%，此時(shí)PS產(chǎn)量為1.34 g/L。

圖5 不同有機(jī)溶劑(a),有機(jī)相與水相體積比(b),底物濃度比(c)和溫度(d)對(duì)PS轉(zhuǎn)化率的影響Fig.5 Effect of different organic solvents (a), organic and aqueous phase volume ratio(b), substrate concentration ratio (c) and temperature (d) on PS yield

3 結(jié)論

近年來，PS廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、保健行業(yè)，主要用于治療腦衰老和修復(fù)腦損傷，且療效顯著。PLD因其較高的轉(zhuǎn)磷脂?；钚?，寬泛的反應(yīng)溫度和pH值，被廣泛用于磷脂類產(chǎn)品的合成。目前制備PS的方法主要為PLD的生物轉(zhuǎn)化法。本研究首先實(shí)現(xiàn)了PLD在大腸桿菌中的異源表達(dá)，并對(duì)重組菌產(chǎn)酶誘導(dǎo)條件進(jìn)行了初步優(yōu)化，酶活可達(dá)38.58 U/mL。為了評(píng)估生物催化劑的應(yīng)用性能，了解重組菌的催化性質(zhì)和特點(diǎn)，并為其生物轉(zhuǎn)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，本研究進(jìn)一步對(duì)重組PLD的催化性質(zhì)進(jìn)行了考察。最后通過對(duì)有機(jī)溶劑種類、有機(jī)相與水相體積比、底物濃度比及轉(zhuǎn)化溫度這些轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化，以PLD為催化劑制備PS最高產(chǎn)量達(dá)1.34 g/L。該P(yáng)LD具有良好的堿基互換能力，在催化產(chǎn)生稀有磷脂方面具有良好的應(yīng)用前景。