陳殿寧，李才明,2，顧正彪,2，洪雁,2，程力,2，李兆豐,2*

1(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122) 2(食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無(wú)錫，214122)

直鏈麥芽低聚糖是一種特殊的功能性淀粉糖，它通常是指由3～10個(gè)葡萄糖單元以α-1,4-糖苷鍵連接而成的寡糖聚合體，是一種集營(yíng)養(yǎng)與功能于一體的新型淀粉糖[1]。直鏈麥芽低聚糖具有極易溶于水、黏度高、甜度低、保濕能力強(qiáng)而吸濕性小等特性，食品加工適應(yīng)性良好，在改善食品質(zhì)地和風(fēng)味以及延長(zhǎng)面包和速凍食品保質(zhì)期方面有較好的應(yīng)用[1-2]；同時(shí)，直鏈麥芽低聚糖不會(huì)引起餐后血糖的迅速升高，可以為人體緩慢持續(xù)地提供能量，賦予其獨(dú)特的生理功效，在特殊疾病患者的食療和功能性運(yùn)動(dòng)運(yùn)料的開發(fā)中有較好的應(yīng)用前景[1]。據(jù)報(bào)道，直鏈麥芽低聚糖(麥芽三糖到麥芽六糖)還可以作為磷酸寡糖合成的前體，促進(jìn)機(jī)體對(duì)鈣的吸收[3]；直鏈麥芽六糖也可參與治療細(xì)菌感染疾病，有效消除多藥耐藥性細(xì)菌對(duì)人體的威脅[4]。直鏈麥芽低聚糖生成酶(maltooligosaccharide-forming amylase, MFA酶)是生產(chǎn)直鏈麥芽低聚糖的主要酶制劑，可水解淀粉中的α-1,4-糖苷鍵生成直鏈麥芽低聚糖。另外，在傳統(tǒng)的淀粉糖生產(chǎn)工藝中，玉米淀粉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)一般控制在20%～35%[5]，在淀粉酶解過程中只有極少部分的水被消耗[6]，這導(dǎo)致在淀粉糖生產(chǎn)過程中產(chǎn)生大量的能耗和水耗，以及大量的工業(yè)廢水[7]。解決上述問題最直接的方法是提高淀粉的初始濃度[8]。楊倩雯和曲世洋等[9-10]研究了底物濃度對(duì)酶法生產(chǎn)麥芽糖和葡萄糖的影響，而底物濃度對(duì)MFA酶酶解玉米淀粉生產(chǎn)直鏈麥芽低聚糖的研究還未見報(bào)道。目前美國(guó)、日本等少數(shù)發(fā)達(dá)國(guó)家已實(shí)現(xiàn)直鏈麥芽低聚糖的工業(yè)化生產(chǎn)，但國(guó)內(nèi)未見相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[11]。因此，有必要對(duì)酶法生產(chǎn)直鏈麥芽低聚糖的工藝進(jìn)行深入研究，并探究玉米淀粉初始濃度對(duì)酶法制備直鏈麥芽低聚糖的影響。

本實(shí)驗(yàn)室已成功構(gòu)建了來(lái)源于嗜熱脂肪芽孢桿菌(BacillusstearothermophilusSTB04)的直鏈麥芽低聚糖生成酶(Bst-MFA酶) (GenBank: AIV43245.1)的枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisWB600)表達(dá)系統(tǒng)，并研究了Bst-MFA酶酶解低質(zhì)量分?jǐn)?shù)(5%)玉米淀粉的產(chǎn)物合成情況[12]，以高質(zhì)量分?jǐn)?shù)玉米淀粉為底物的酶解產(chǎn)物合成情況還未研究。因此，本研究以不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)玉米淀粉為底物，探究底物初始質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)Bst-MFA酶酶解玉米淀粉生產(chǎn)直鏈麥芽低聚糖的影響，并探究相關(guān)機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米淀粉(水分含量11.85%)，購(gòu)于山東大宗生物開發(fā)股份有限公司；直鏈麥芽低聚糖生成酶(Bst-MFA酶)為本實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵所得；酵母粉和蛋白胨購(gòu)于英國(guó)Oxoid公司；麥芽三糖(G3)、麥芽四糖(G4)、麥芽五糖(G5)、麥芽六糖(G6)、麥芽七糖(G7)標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)于上?；菡\(chéng)生物科技有限公司；其他試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

A560型雙光束紫外可見分光光度計(jì)，上海翱藝儀器有限公司；RW 20 digital Ika攪拌器，德國(guó)IKA集團(tuán)；HPAEC-PAD配有脈沖電流檢測(cè)器的高效陰離子交換色譜，美國(guó)Thermo Scientific有限公司；Viscograph-PT100型布拉班德黏度儀，德國(guó)Brabender公司；低場(chǎng)核磁共振成像分析儀，蘇州紐邁分析儀器股份有限公司；RVA快速旋轉(zhuǎn)黏度儀，澳大利亞Newport Scientific公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 Bst-MFA酶酶活的測(cè)定

Bst-MFA酶酶活的測(cè)定采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)法[13]。以C6H8O7-Na2HPO4緩沖液(10 mmol/L，pH 5.0)配制的1%可溶性淀粉溶液作為底物，在0.90 mL底物中加入100 μL稀釋后的酶液，60 ℃下反應(yīng)15 min，加入1.0 mL DNS溶液終止反應(yīng)，沸水浴中顯色5 min后立即冰浴冷卻，于540 nm下測(cè)定吸光值，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出體系中還原糖含量。以每分鐘生成1 μmol還原糖(以葡萄糖計(jì))所需的酶量定義為1個(gè)酶活單位(U)。

1.3.2 玉米淀粉的酶解

配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為10%、20%、30%、35%、40%、45%和50%(以干基計(jì))的玉米淀粉200 g，用0.1 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH至5.0，60 ℃保溫15 min，按底物干基加入Bst-MFA酶 20 U/g，以2.0 ℃/min的速率從60 ℃升溫至90 ℃，保溫30 min，然后以10 ℃/min的速率將溫度降為65 ℃，并開始計(jì)時(shí)，定時(shí)取樣測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。

1.3.3 Bst-MFA酶酶解玉米淀粉產(chǎn)物分析

取一定質(zhì)量酶解后的樣品，沸水浴30 min滅酶[14]、定容、離心(10 000 r/min，10 min)，上清液過0.22 μm水系濾膜，稀釋一定倍數(shù)后用高效陰離子交換色譜-脈沖安培法(high performance anion-exchange chramatograph-amperemetric detection, HPAEC-PAD)分析產(chǎn)物組成[15]。

HPAEC-PAD的分析條件為：超純水、0.25 mol/L NaOH、1 mol/L NaAc溶液三元梯度淋洗，色譜柱CarboPac PA 200，流速0.5 mL/min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣體積10 μL。分析指標(biāo)為直鏈麥芽低聚糖含量、產(chǎn)率和G1～G7(G1和G2分別表示葡萄糖和麥芽糖)中各糖組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(其他組分由于缺乏相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品，未做定量分析)，按公式(1)、(2)和(3)計(jì)算：

(1)

式中：G，酶解液中目的產(chǎn)物的含量，mg/g；ρ1，酶解液中目的產(chǎn)物的質(zhì)量濃度，mg/mL；ω(淀粉)，淀粉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；m，取樣質(zhì)量，g。

(2)

式中：Y，酶解液中目的產(chǎn)物的產(chǎn)率，%；m1，取樣質(zhì)量，mg。

(3)

式中：ω，酶解液中目的產(chǎn)物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；c，酶解液中G1～G7的質(zhì)量濃度，mg/mL。

1.3.4 液化過程黏度的測(cè)定

參考劉文靜[16]的實(shí)驗(yàn)方法，并做部分修改。配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為10%、20%、30%、35%、40%、45%和50%(以干基計(jì))的玉米淀粉300 g，用0.1 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH至5.0，60 ℃保溫15 min，加入Bst-MFA酶 20 U/g干基玉米淀粉，攪拌均勻后倒入布拉班德黏度儀的測(cè)量杯中，測(cè)定程序?yàn)椋阂?.0 ℃/min的速率從60 ℃升溫至90 ℃，保溫30 min，再以3.5 ℃/min的速率降溫至65 ℃，保溫30 min，轉(zhuǎn)速為75 r/min，得到一條玉米淀粉液化過程黏度曲線。

1.3.5 碘藍(lán)值的測(cè)定

碘藍(lán)值的測(cè)定參考BIJTTEBIER[17]的方法并做部分修改。配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為10%、20%、30%、35%、40%、45%和50%(以干基計(jì))的玉米淀粉200 g，用0.1 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH至5.0，60 ℃保溫15 min，按底物干基加入Bst-MFA酶 20 U/g，開始反應(yīng)計(jì)時(shí)，以2.0 ℃/min的速率從60 ℃升溫至90 ℃，取酶解不同時(shí)間的樣品，沸水浴30 min滅酶，用去離子水定容至100 mL。

取適量定容后的樣品于離心管中，用去離子水補(bǔ)足4.75 mL，加入0.25 mL碘液(0.2%KI和0.02%I2)充分混勻后避光穩(wěn)定15 min，于620 nm下測(cè)定吸光度，以糊化后原淀粉的吸光度(單位質(zhì)量)為100%計(jì)算樣品的相對(duì)碘藍(lán)值。

1.3.6 玉米淀粉水分子運(yùn)動(dòng)性分析

用低場(chǎng)核磁共振技術(shù)[18]測(cè)定不同濃度玉米淀粉糊化過程中不同結(jié)合狀態(tài)水分子的運(yùn)動(dòng)特性。配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為10%、20%、30%、35%、40%、45%和50%(以干基計(jì))的玉米淀粉，取一定體積移入玻璃樣品瓶?jī)?nèi)，攪拌均勻后放入恒溫水浴鍋，以2 ℃/min的速率升溫至90 ℃，并保溫30 min，將制備好的樣品用低場(chǎng)核磁共振成像分析儀中的硬脈沖回波序列CPMG(carr-purcell-meiboom-gillsequence)測(cè)定不同結(jié)合狀態(tài)水分子的運(yùn)動(dòng)特性。

低場(chǎng)核磁共振技術(shù)分析條件參考XU[19]的方法，并做適當(dāng)修改，具體為：25 mm直徑射頻線圈，磁場(chǎng)強(qiáng)度0.28 T，共振頻率21 MHz，信號(hào)強(qiáng)度2，重復(fù)采樣等待時(shí)間3 500 ms，重復(fù)采樣次數(shù)2，回波個(gè)數(shù)9 000，回波時(shí)間1.000 ms，通過反演可得出樣品中不同結(jié)合狀態(tài)水分的橫向弛豫時(shí)間T21和T22。

1.3.7 糖化過程黏度的測(cè)定

取一定量酶解不同時(shí)間的樣品于RVA鋁盒中，按設(shè)定程序立刻測(cè)定樣品的黏度，得到糖化過程中樣品的黏度變化曲線。

測(cè)定程序：鋁盒溫度65 ℃，轉(zhuǎn)速300 r/min，測(cè)定時(shí)間3 min。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果為3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值，用平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用Origin Pro軟件分析數(shù)據(jù)和作圖，用SPSS軟件(單因素方差分析、Student-Newman-Keuls程序)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與討論

2.1 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)直鏈麥芽低聚糖含量和產(chǎn)率的影響

本研究所用Bst-MFA酶是一種可以水解淀粉生成以G5和G6為主產(chǎn)物的直鏈麥芽低聚糖生成酶。本實(shí)驗(yàn)以不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)(10%～50%)的玉米淀粉為底物，研究底物濃度對(duì)酶解的影響，而酶解產(chǎn)物中直鏈麥芽低聚糖含量和產(chǎn)率是衡量酶解作用的重要指標(biāo)，不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)玉米淀粉酶解過程中G1～G7含量的變化如圖1所示。隨著底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，反應(yīng)過程中G1～G7的含量呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)(圖1-a)。對(duì)于不同底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的反應(yīng)體系，酶解24 h時(shí)，G1～G7的含量達(dá)到最高，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，G1～G7的含量為91.25 mg/g；底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%～45%時(shí)，G1～G7的含量依次增加，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)為45%時(shí)，體系中G1～G7的含量達(dá)到最大，為344.47 mg/g，相當(dāng)于10%底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)時(shí)的3.7倍，這說明提高玉米淀粉的初始質(zhì)量分?jǐn)?shù)可以增加反應(yīng)體系中直鏈麥芽低聚糖的固形物含量，達(dá)到降低能耗的目的。然而，繼續(xù)增加底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)至50%時(shí)，反應(yīng)體系中直鏈麥芽低聚糖的含量不再繼續(xù)增加。

Bst-MFA酶酶解不同濃度玉米淀粉時(shí)主產(chǎn)物G5和G6的含量變化趨勢(shì)(圖1-b)與G1～G7相同，酶解24 h時(shí)G5和G6的含量已達(dá)到最大，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，體系中G5和G6的含量為45.02 mg/g；增加底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)至30%時(shí)，體系中G5和G6的含量明顯高于低質(zhì)量分?jǐn)?shù)體系；繼續(xù)提高玉米淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)至45%時(shí)，G5和G6的含量達(dá)到最大，為192.33 mg/g，相當(dāng)于10%底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)時(shí)G5和G6含量的4.27倍，高于相同底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)下G1～G7含量的增加程度，可見提高玉米淀粉的初始質(zhì)量分?jǐn)?shù)可以明顯增加反應(yīng)體系中主產(chǎn)物G5和G6的含量。

圖1 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)玉米淀粉反應(yīng)過程中直鏈麥芽低聚糖含量的變化曲線Fig.1 Changes of malt oligosaccharide content during the reaction at different concentrations of corn starch

Bst-MFA酶酶解不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)玉米淀粉24 h時(shí)的直鏈麥芽低聚糖產(chǎn)率如圖2所示。

圖2 不同濃度玉米淀粉反應(yīng)24 h時(shí)的直鏈麥芽低聚糖產(chǎn)率Fig.2 Malt oligosaccharide yield produced by different concentrations corn starch at 24 h

隨著玉米淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，G1～G7的產(chǎn)率和主產(chǎn)物G5和G6的產(chǎn)率均逐漸降低。當(dāng)玉米淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，G1～G7的產(chǎn)率為91.25%，說明體系中玉米淀粉幾乎全部轉(zhuǎn)化為G1～G7，主產(chǎn)物G5和G6的產(chǎn)率也高達(dá)54.95%；隨著玉米淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，G1～G7的產(chǎn)率逐漸降低，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加至45%及以上時(shí)，G1～G7的產(chǎn)率明顯降低，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，G1～G7的產(chǎn)率只有68.47%，主產(chǎn)物G5和G6的產(chǎn)率也僅為36.56%，相比10%底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)時(shí)降低了33.47%。

2.2 底物濃度對(duì)直鏈麥芽低聚糖產(chǎn)物組成的影響

不同濃度玉米淀粉酶解24 h時(shí)產(chǎn)物中直鏈麥芽低聚糖組成如表1所示。玉米淀粉經(jīng)Bst-MFA酶酶解后，產(chǎn)物以G5和G6為主，體系中還存在部分G2和G3，以及少量的G1、G4和G7。玉米淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)由10%增加到45%的過程中，G1～G4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)無(wú)顯著性差異，主產(chǎn)物G5和G6的質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，而G7的質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸增加；當(dāng)玉米淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)繼續(xù)增大至50%時(shí)，G1～G7中各小分子糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)與45%質(zhì)量分?jǐn)?shù)體系無(wú)顯著性差異，但G1～G7和主產(chǎn)物G5、G6的產(chǎn)率明顯降低?？梢?，隨著底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高，Bst-MFA酶對(duì)玉米淀粉的酶解程度降低，導(dǎo)致主產(chǎn)物質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降以及聚合度較大的線性低聚糖的增多。一方面，隨著底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高，體系黏度增大導(dǎo)致Bst-MFA酶對(duì)淀粉酶解不充分；另一方面，Bst-MFA酶的作用方式在不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)底物下可能存在差異，因此，有必要進(jìn)一步探究主產(chǎn)物質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低的原因。

表1 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)直鏈麥芽低聚糖產(chǎn)物組成的影響Table 1 Effect of the substrate concentration on product composition of malt oligosaccharide

注：表中同一列中不同字母表示存在顯著性差異(P<0.05)。

2.3 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)水分子運(yùn)動(dòng)性的影響

氫核(1H)多為低場(chǎng)核磁共振技術(shù)的研究對(duì)象，根據(jù)1H在磁場(chǎng)中所具備的自旋特性，其將以非輻射的方式從高能態(tài)向低能態(tài)轉(zhuǎn)變，弛豫時(shí)間的測(cè)量多用氫質(zhì)子的橫向弛豫時(shí)間T2來(lái)表示，由于體系中氫質(zhì)子主要來(lái)源于水分子，故可以通過弛豫時(shí)間的變化來(lái)分析不同體系中水分子的運(yùn)動(dòng)特性[20]。在不同的反應(yīng)體系中T2弛豫時(shí)間的長(zhǎng)短不同，證明質(zhì)子所處的化學(xué)環(huán)境不同，即水分子的自由度不同。T2弛豫時(shí)間越短，表明水分的自由度越低，水分子與物質(zhì)結(jié)合越緊密；T2弛豫時(shí)間越長(zhǎng)表明水分子的自由度越高，故可以通過測(cè)定不同體系的T2弛豫時(shí)間來(lái)間接表明體系中水分子的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)[21]。習(xí)慣上將弛豫時(shí)間較短的水分子稱為結(jié)合水，這部分水一般通過氫鍵作用力與其他物質(zhì)結(jié)合在一起，結(jié)合水幾乎沒有流動(dòng)性；將弛豫時(shí)間較長(zhǎng)的水分子稱為自由水，這部分水的流動(dòng)性較強(qiáng)，可以充當(dāng)反應(yīng)的介質(zhì)。

不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)玉米淀粉在90 ℃下加熱30 min，用低場(chǎng)核磁共振儀的硬脈沖回波序列CPMG分析不同體系樣品中水分子的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，通過反演擬合發(fā)現(xiàn)不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)玉米淀粉均表現(xiàn)出兩個(gè)不同的自旋-自旋弛豫時(shí)間，說明體系中存在兩種流動(dòng)性不同的水分，T21表示與玉米淀粉分子緊密結(jié)合的水分的橫向弛豫時(shí)間，即結(jié)合水的自旋-自旋弛豫時(shí)間，結(jié)合越緊密弛豫時(shí)間越短，水分子的流動(dòng)性越差；T22表示體系中流動(dòng)性較強(qiáng)的自由水的自旋-自旋弛豫時(shí)間[22]。

不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)玉米淀粉在90 ℃下保溫30 min后質(zhì)子的弛豫時(shí)間如圖3所示。結(jié)合水的橫向弛豫時(shí)間T21隨底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加逐漸下降(圖3-a)，表明隨著底物濃度的提高，玉米淀粉對(duì)水分子的束縛能力逐漸增強(qiáng)，水分子的流動(dòng)性逐漸降低。當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%～40%時(shí)，T21高于25 ms，玉米淀粉對(duì)水分子的束縛作用較小，對(duì)Bst-MFA酶酶解玉米淀粉幾乎沒有影響；當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)高于40%時(shí)，體系T21繼續(xù)降低，玉米淀粉對(duì)水分子的束縛作用明顯增強(qiáng)，嚴(yán)重阻礙了水分子的流行性，使得直鏈麥芽低聚糖的產(chǎn)率明顯下降。

隨著玉米淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，自由水的橫向弛豫時(shí)間T22明顯下降(圖3-b)。當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)低于30%時(shí)，T22高于1 500 ms，Bst-MFA酶作用于玉米淀粉時(shí)有充足的自由水可以利用，自由水對(duì)Bst-MFA酶酶解反應(yīng)幾乎沒有影響，因此直鏈麥芽低聚糖的產(chǎn)率較高，產(chǎn)物中主產(chǎn)物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高；當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%～40%時(shí)，反應(yīng)體系T22低于1 000 ms，自由水含量的減少使得Bst-MFA酶對(duì)玉米淀的酶解作用不夠充分，導(dǎo)致直鏈麥芽低聚糖的產(chǎn)率降低；當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)高于40%時(shí)，T22進(jìn)一步下降，說明體系中的自由水進(jìn)一步減少，不足以提供酶促反應(yīng)所需水分，導(dǎo)致直鏈麥芽低聚糖的產(chǎn)率明顯下降，產(chǎn)物中主產(chǎn)物質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低。

圖3 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)玉米淀粉結(jié)合水T21和自由水T22的弛豫時(shí)間Fig.3 The bound water T21 and free water T22 relaxation time of corn starch milk with different concentrations

2.4 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)液化過程中體系黏度的影響

Bst-MFA酶不能作用于生淀粉，故玉米淀粉必須經(jīng)過糊化才能被水解，隨著底物濃度的提高，糊化過程中體系黏度逐漸變大導(dǎo)致不能攪拌均勻，因此必須加入Bst-MFA酶進(jìn)行液化以降低體系的黏度。

不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)玉米淀粉糊化、液化過程中體系黏度變化如圖4所示，隨著玉米淀粉初始質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，其峰值黏度也逐漸升高，高黏度持續(xù)時(shí)間逐漸延長(zhǎng)。當(dāng)玉米淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%和20%時(shí)，液化過程中體系黏度增幅較小，黏度對(duì)Bst-MFA酶作用的影響不顯著，這是因?yàn)榉磻?yīng)體系中水分子的橫向弛豫時(shí)間較長(zhǎng)(圖3)，可為Bst-MFA酶酶解淀粉提供充足的水分；質(zhì)量分?jǐn)?shù)由20%逐漸增加到40%的過程中，液化液的峰值黏度增長(zhǎng)迅速且高黏度持續(xù)時(shí)間明顯增長(zhǎng)，黏度的增加使酶解體系不易攪拌和混合均勻，這可能是Bst-MFA酶酶解高質(zhì)量分?jǐn)?shù)玉米淀粉時(shí)酶解效率和產(chǎn)物產(chǎn)率降低的主要原因之一。與40%玉米淀粉相比，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為45%時(shí)玉米淀粉在糊化和液化過程中的黏度增加并不顯著，但高黏度持續(xù)時(shí)間明顯加長(zhǎng)，且最終液化液的黏度高于其他質(zhì)量分?jǐn)?shù)體系。同時(shí)，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)為45%時(shí)，在淀粉糊化、液化過程中的黏度曲線(峰值黏度附近)會(huì)出現(xiàn)波動(dòng)現(xiàn)象，這可能與高黏度下反應(yīng)體系未攪拌均勻有關(guān)。當(dāng)玉米淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高至50%時(shí)，60 ℃時(shí)已較難攪拌與混合均勻，在糊化、液化過程中出現(xiàn)結(jié)塊現(xiàn)象導(dǎo)致黏度曲線無(wú)法測(cè)定，這可能是因?yàn)?0%的玉米淀粉由于水分含量過低，在糊化、液化過程中淀粉顆粒的天然半結(jié)晶結(jié)構(gòu)破壞程度較小，抗酶解性能增加[23]，從而導(dǎo)致Bst-MFA酶的酶解效率顯著降低。

圖4 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)玉米淀粉液化過程中黏度變化曲線Fig.4 Viscosity curves of corn starch milk at different concentrations during liquification注：曲線1,2,3,4,5,6分別表示玉米淀粉濃度為10%，20%，30%，35%，40%，45%。

2.5 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)液化產(chǎn)物相對(duì)碘藍(lán)值的影響

直鏈淀粉和支鏈淀粉均可以和I2形成絡(luò)合物[24]而顯色，因此淀粉酶解產(chǎn)物的碘藍(lán)值可以用來(lái)反映其與碘形成絡(luò)合物能力的強(qiáng)弱。通常，當(dāng)寡糖鏈的聚合度大于12時(shí)才可以和I2形成絡(luò)合物并顯色，且顯色強(qiáng)度與聚合度有關(guān)，因此，通過測(cè)定淀粉反應(yīng)過程中酶解產(chǎn)物的碘藍(lán)值，可以推斷淀粉水解產(chǎn)物的鏈段聚合度和分子量大小[25]，從而判斷玉米淀粉水解程度。

不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)玉米淀粉酶解反應(yīng)過程中的相對(duì)碘藍(lán)值變化如圖5所示。通常，在玉米淀粉水解過程中，體系的相對(duì)碘藍(lán)值會(huì)迅速降低。BAILEY等[25]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)麥芽糊精聚合度小于12時(shí)不能與I2結(jié)合顯色。由圖5可知，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，反應(yīng)過程中酶解產(chǎn)物的相對(duì)碘藍(lán)值迅速降低，反應(yīng)50 min后幾乎不能檢測(cè)樣品碘藍(lán)值，說明體系中水解產(chǎn)物的分子量較小、鏈長(zhǎng)較短，淀粉分子已被充分水解。隨著底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，相同反應(yīng)時(shí)間樣品的相對(duì)碘藍(lán)值逐漸增加，當(dāng)玉米淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%～45%時(shí)，相同反應(yīng)時(shí)間各樣品相對(duì)碘藍(lán)值逐漸增加，但增幅相對(duì)較小；當(dāng)玉米淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高至50%時(shí)，淀粉酶解產(chǎn)物相對(duì)碘藍(lán)值明顯高于其他反應(yīng)體系，反應(yīng)120 min后水解產(chǎn)物相對(duì)碘藍(lán)值仍有11.08%。KONG等[26]用耐高溫α-淀粉酶液化不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)玉米淀粉時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，酶水解底物的模式表現(xiàn)出接近TAKA淀粉酶(嚴(yán)格內(nèi)切)的內(nèi)切作用模式，淀粉分子的內(nèi)鏈被攻擊，淀粉水解產(chǎn)物的相對(duì)碘藍(lán)值下降較快；當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)升高至45%時(shí)，酶對(duì)底物的作用模式更傾向于多重攻擊，即在反應(yīng)前期，酶更多地作用于淀粉分子的外鏈，導(dǎo)致水解產(chǎn)物的相對(duì)碘藍(lán)值降低不明顯。由表1可知，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)升高時(shí)，最終產(chǎn)物中G7的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于其他低質(zhì)量分?jǐn)?shù)反應(yīng)體系，結(jié)合圖5相對(duì)碘藍(lán)值隨玉米淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化趨勢(shì)，推測(cè)Bst-MFA酶作用于不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的玉米淀粉時(shí)可能表現(xiàn)出與耐高溫α-淀粉酶相同的作用模式，其詳細(xì)的作用機(jī)理有待進(jìn)一步分析。

圖5 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)玉米淀粉反應(yīng)過程中相對(duì)碘藍(lán)值的變化Fig.5 The relative blue value of corn starch milk at different concentrations during reaction

2.6 底物濃度對(duì)糖化過程中體系黏度的影響

Bst-MFA酶可以依次完成對(duì)玉米淀粉的液化和糖化過程來(lái)制備直鏈麥芽低聚糖[10]。不同濃度玉米淀粉糖化過程中體系黏度變化如圖6所示。在玉米淀粉糖化過程中，體系黏度逐漸降低，且隨玉米淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高，糖化過程中反應(yīng)體系的黏度下降速率逐漸加快。當(dāng)玉米淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%～40%時(shí)，體系黏度一直處于較低水平，黏度對(duì)Bst-MFA酶水解玉米淀粉的影響并不明顯；當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)升高至45%時(shí)，糖化反應(yīng)前期體系黏度較大，反應(yīng)8 h后體系黏度明顯下降并趨于穩(wěn)定，黏度的降低使得Bst-MFA酶酶解玉米淀粉分子的速度加快，體系中直鏈麥芽低聚糖的含量逐漸增多；當(dāng)玉米淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高至50%時(shí)，糖化起始階段體系黏度高達(dá)1 925 mPa·s，為45%質(zhì)量分?jǐn)?shù)起始黏度的3.58倍，反應(yīng)12 h后體系黏度雖降為起始時(shí)的37.51%(722 mPa·s)并趨于穩(wěn)定，但穩(wěn)定后黏度仍明顯高于其他反應(yīng)體系。隨底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，糖化過程中黏度升高帶來(lái)的負(fù)面影響嚴(yán)重抑制了Bst-MFA酶對(duì)玉米淀粉的催化水解，導(dǎo)致直鏈麥芽低聚糖的產(chǎn)率明顯降低。

圖6 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)玉米淀粉糖化過程中黏度曲線變化Fig.6 Viscosity curve of maltodextrin with different concentration during saccharification

3 結(jié)論

在Bst-MFA酶酶解玉米淀粉生產(chǎn)直鏈麥芽低聚糖的過程中，玉米淀粉的初始質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)酶解反應(yīng)有重要影響，以不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)玉米淀粉為底物的酶解反應(yīng)規(guī)律存在差異。隨著底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高，玉米淀粉經(jīng)Bst-MFA酶水解24 h后產(chǎn)生的直鏈麥芽低聚糖和主產(chǎn)物G5、G6的含量均呈逐漸增加的趨勢(shì)，而直鏈麥芽低聚糖的產(chǎn)率逐漸降低。玉米淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)由10%提高至45%時(shí)，產(chǎn)物中G1～G7的含量由91.25 mg/g增加至344.47 mg/g，提高了2.78倍，繼續(xù)提高質(zhì)量分?jǐn)?shù)至50%時(shí)，G1～G7的含量不再繼續(xù)增加；而玉米淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)由10%提高至50%過程中，酶解24 h后產(chǎn)物中G1～G7的產(chǎn)率由91.25%逐漸減少至68.74%，降低了24.67%。另外，隨著玉米淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高，反應(yīng)24 h后產(chǎn)物中G5和G6的質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸下降，而G7等大分子的質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸增加。其主要機(jī)理是：隨著玉米淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高，體系中淀粉分子密度變大，Bst-MFA酶與淀粉分子碰撞幾率增加，直鏈麥芽低聚糖含量逐漸升高，但底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加伴隨著液化和糖化過程中體系黏度的增大，水分子運(yùn)動(dòng)性降低，體系中的自由水明顯減少，導(dǎo)致Bst-MFA酶對(duì)玉米淀粉分子的水解不夠充分，直鏈麥芽低聚糖的產(chǎn)率逐漸降低。另外，Bst-MFA酶在不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)玉米淀粉中的酶解作用模式可能存在差異，這也是導(dǎo)致直鏈麥芽低聚糖產(chǎn)率降低的原因之一，還有待于進(jìn)一步研究加以驗(yàn)證。