劉 晶,張西臣,朱興全,劉 群

(1.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院,北京 海淀 100193;2.吉林大學動物醫(yī)學學院,吉林 長春 130012;3.中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學國家重點實驗室甘肅省動物寄生蟲病重點實驗室,甘肅 蘭州 730046)

新孢子蟲病(Neosporosis)是由新孢子蟲(Neospora caninum)感染多種動物的原蟲病,在全世界廣泛分布[1]。我國多個省市自治區(qū)均有流行,不同地區(qū)血清陽性率差異顯著[2]。新孢子蟲隸屬于頂復亞門,孢子蟲綱,真球蟲目,肉孢子蟲科,新孢子蟲屬,是1988年才被確認的一種動物寄生原蟲。新孢子蟲感染會引起孕畜流產(chǎn)、死胎及新生兒運動神經(jīng)功能障礙,主要危害牛和犬,也會引起山羊、綿羊和鹿的臨床感染[3]。新孢子蟲是引起牛繁殖障礙最重要的病原之一,引起的流產(chǎn)和新生犢牛的死亡導致全球養(yǎng)牛業(yè)遭受重大經(jīng)濟損失。鑒于新孢子蟲病對養(yǎng)牛業(yè)的重大威脅,開發(fā)有效保護的疫苗迫在眉睫。目前唯一一種商品化的全蟲滅活疫苗(BOVILIS NEOGUARDTM),對防止流產(chǎn)有很好的保護效果,但不能阻斷垂直傳播,且由于保質期短和高生產(chǎn)成本等問題并未廣泛應用。因此需要對新孢子蟲進行更深入的基礎研究,找到更有效的靶點。2015年立項的國家重點基礎研究發(fā)展計劃(973計劃)項目“牛、羊重要寄生蟲致病機制的分子基礎”(項目編號：2015CB150300)將新孢子蟲作為重要研究對象之一,旨在通過對致病機制的研究,為新孢子蟲病新型藥物、疫苗、診斷方法的研制提供理論基礎。

1 新孢子蟲的生活史

新孢子蟲是專性細胞內(nèi)寄生原蟲,完成其全部生活史需要兩個宿主。犬和其他犬科動物是新孢子蟲的終末宿主[4]。新孢子蟲的中間宿主非常廣泛,哺乳動物、海洋哺乳動物和鳥類等都可以感染[5]。生活史以3個感染階段為代表,分別是速殖子、組織包囊和卵囊。速殖子和組織包囊出現(xiàn)在中間宿主體內(nèi),速殖子呈月牙形,約6×2 μm。速殖子可以侵入多種有核細胞,包括巨噬細胞和淋巴細胞,可通過血液循環(huán)迅速擴散到全身并在體內(nèi)多種細胞內(nèi)進行繁殖。在免疫系統(tǒng)正常的宿主體內(nèi),蟲體可由活躍的速殖子轉換為生長緩慢的緩殖子,最終形成組織包囊。組織包囊主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS),呈圓形或橢圓形,一般為15～35 μm×10 ～27 μm,最大可達107 μm,內(nèi)含20 ～100 個緩殖子。終末宿主吞食了中間宿主體內(nèi)的組織包囊,蟲體進入終末宿主小腸內(nèi)完成類似球蟲樣的有性生殖,形成約10～12 μm大小的卵囊,隨糞便排出體外,在外界適宜的溫度和濕度下經(jīng)48～72 h發(fā)育為感染性卵囊。中間宿主吞食了被感染性卵囊污染的飲水或飼料而被感染(見中插彩版圖1)。

圖1 新孢子蟲生活史[6]

2 新孢子蟲的傳播途徑和危害

新孢子蟲病對牛的危害最為嚴重,主要造成孕畜流產(chǎn)、死胎以及新生幼畜的神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙。新孢子蟲在中間宿主群中有兩種傳播方式：垂直傳播和水平傳播。攝入卵囊感染是中間宿主與終末宿主之間的主要水平傳播途徑,肉食動物攝入其他動物組織中的包囊是另一種水平傳播;垂直傳播則是速殖子經(jīng)胎盤感染胎兒,是妊娠期母牛到胎牛的傳播方式。垂直傳播被認為是牛群中新孢子蟲傳播的最主要和更有效的途徑[7]。盡管新孢子蟲不能通過精液傳播,但是新孢子蟲感染的公牛精子濃度、活力和運動性均顯著降低[8]。垂直傳播可以是母牛食入外源性卵囊導致的急性感染,也可能由于孕期免疫狀態(tài)的改變激活了隱性感染母牛體內(nèi)的緩殖子,轉換為速殖子再經(jīng)胎盤傳播。成年牛感染新孢子蟲后沒有任何臨床癥狀,但當孕牛持續(xù)感染至懷孕時包囊內(nèi)的緩殖子轉換為速殖子快速增殖導致組織受損,胎盤發(fā)生病理變化,可引起母體流產(chǎn)并直接危及胎兒生命。最嚴重的病理變化多發(fā)生在胎盤和胎兒腦部,胎牛表現(xiàn)為非化膿性腦脊髓炎的典型病變。流產(chǎn)多發(fā)生于妊娠3個月到妊娠后期,妊娠3～8個月的胎兒流產(chǎn)時常見不同程度的自溶;妊娠5個月內(nèi)死亡的胎兒若未及時排出死胎,則在子宮中滯留數(shù)月形成木乃伊胎;妊娠早期發(fā)生死亡的胎兒則可能被母體吸收而被忽視。若沒發(fā)生流產(chǎn)則產(chǎn)下的犢?；虺霈F(xiàn)神經(jīng)癥狀,嚴重者表現(xiàn)為四肢無力、后肢麻痹、運動失調,頭部震顫明顯,反射遲鈍;或大部分新生犢牛臨床表現(xiàn)健康,但存在隱性感染。這些隱性感染的犢牛在成年妊娠時,組織包囊內(nèi)的緩殖子可能活化,導致流產(chǎn)發(fā)生或者繼續(xù)傳給子代,如此往復,新孢子蟲得以在牛群中持續(xù)感染,嚴重威脅牛群繁殖,生產(chǎn)性能大大下降。

新孢子蟲在不同地區(qū)、同一地區(qū)不同牛場的感染率差異很大。新孢子蟲感染引起的流產(chǎn)存在地區(qū)散發(fā)性和流行性兩種方式,爆發(fā)性流產(chǎn)不常見。如果某牛場在6～8周內(nèi)流產(chǎn)風險超過10%,則被認為是一種流行性流產(chǎn)。而流產(chǎn)在某個牛群中持續(xù)存在數(shù)月甚至數(shù)年,則為地方性流產(chǎn)。新孢子蟲病所致流產(chǎn)可以全年反復發(fā)生,無明顯的季節(jié)性。大部分新孢子蟲引起的流產(chǎn)都發(fā)生在妊娠第4～6個月,流產(chǎn)的奶牛將錯過一個泌乳期。因此,孕牛感染新孢子蟲造成流產(chǎn)的損失相當于一頭犢牛和泌乳期牛奶的損失。

牛新孢子蟲病給養(yǎng)殖業(yè)帶來的巨大經(jīng)濟損失,包括流產(chǎn)導致的直接經(jīng)濟損失,也包括流產(chǎn)母牛淘汰率增加、流產(chǎn)奶牛的護理和重新繁育成本增加、產(chǎn)奶量下降、更換飼料和牛舍等成本的間接經(jīng)濟損失。每年因新孢子蟲病在澳大利亞、巴西、墨西哥和美國造成的損失均超過1億美元。越來越多的證據(jù)表明,新孢子蟲感染或許會導致母牛終生帶蟲,且其大部分后代也可能獲得先天感染。因此,新孢子蟲病的危害不僅是導致牛群繁殖障礙,更重要的是牛一旦感染新孢子蟲,可通過垂直傳播方式在牛群中散播,導致群體內(nèi)持續(xù)感染該病原,也就意味著流產(chǎn)可能不斷發(fā)生,是非常嚴重的潛在威脅。

3 診斷與防控

鑒于新孢子蟲對牛的危害最為嚴重,診斷常是針對牛新孢子蟲病的診斷。應對牛場流行病學情況、牛的臨床癥狀、檢測或分離病原的情況,結合分子生物學及免疫學方法進行綜合診斷。同時要考慮混合感染其他繁殖障礙疾病的可能,以及與弓形蟲病的鑒別診斷。新孢子蟲病原的分離和鑒定是最有力的直接證據(jù)。但新孢子蟲的分離成功率很低,直接從病料涂片檢出率更低。病理組織學配合免疫組織化學的方法可以確認新孢子蟲的存在。分子生物學診斷則利用PCR擴增新孢子蟲的特異性基因,如Nc5、14-3-3、ITS1等,主要應用于檢測流產(chǎn)胎牛等中間宿主組織內(nèi)的蟲體。血清學診斷應用于動物活體檢測,包括直接凝集試驗(DAT)、乳膠凝集試驗(LAT)、免疫印跡技術(WB)、免疫膠體金技術(ICT)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)等,其中ELISA操作簡單規(guī)范,結果的判定不受主觀因素的影響,更適用于大批量血清樣本的血清流行病學調查。

新孢子蟲至今仍沒有理想疫苗可以使用,也沒有能夠徹底清除感染的特效藥物。雖然磺胺類、乙胺嘧啶等藥物對蟲體具有一定的殺傷效果[3],但是藥物均不能有效殺滅包囊階段蟲體,且出于對耐藥性及藥物殘留的考慮,這些藥物在控制奶牛新孢子蟲感染中的應用受到了極大限制。針對新孢子蟲在牛群中的流行狀況,淘汰病牛防止新孢子蟲病垂直傳播是最為有效的方法。同時,切斷水平傳播途徑,禁止用流產(chǎn)胎牛喂犬,禁止犬進入牛場,以防排出的卵囊污染水源和飼料。此外,通過日常規(guī)范管理,在引進奶牛時做好檢驗檢疫工作,防止引入新孢子蟲陽性牛。

4 新孢子蟲感染與致病的分子機制

隨著國家973計劃相關項目的順利開展,新孢子蟲感染與致病分子機制的研究取得了重要階段性成果。通過生物信息學分析,從分泌蛋白包括棒狀體蛋白、微線體蛋白和致密顆粒蛋白中篩選出多個擬毒力因子,利用新孢子蟲基因調控平臺的Crispr/Cas9技術和同源重組技術,獲得了基因調控蟲株。通過對表型和毒力的觀察,確定毒力因子并深入探討其功能和分子作用機制。目前已經(jīng)明確ROP5、ROP16、NcMIC6和 GRA16為新孢子蟲毒力因子。缺失這些基因的蟲株增殖能力和對小鼠的致病力均明顯下降。其中ROP5通過抑制細胞免疫因子GBP1和GBP2向蟲體納蟲空泡膜聚集,抵抗免疫細胞對蟲體的殺傷能力,介導新孢子蟲的免疫逃避[9]。ROP16是新孢子蟲激活宿主細胞STAT3的重要蛋白,依賴其核定位信號進入核內(nèi)持續(xù)磷酸化STAT3,其磷酸激酶結構域是發(fā)揮磷酸化功能的關鍵[10]。MIC6以 NcMIC1/4/6復合體的形式存在,在蟲體入侵宿主細胞時會從蟲體前端移至后端,在新孢子蟲入侵和逸出過程中發(fā)揮作用[11]。GRA17定位在納蟲空泡膜上,參與新孢子蟲的小分子跨膜運輸,對維持納蟲空泡形態(tài)穩(wěn)定起重要作用,氨基端參與將GRA17運輸?shù)街旅茴w粒,α螺旋與GRA17定位于納蟲空泡膜有關[12]。

對宿主抗新孢子蟲先天免疫機制進行的探討發(fā)現(xiàn),巨噬細胞衍生的細胞外陷阱(ETs)是宿主抵抗新孢子蟲早期感染的有效機制[13],感染新孢子蟲的巨噬細胞能夠激活NLRP3炎性體,并在宿主抗新孢子蟲中發(fā)揮作用[14]。新孢子蟲14-3-3蛋白可通過激活MAPK、AKT和NF-κB信號通路誘導有效的免疫應答并刺激細胞因子表達,是抗新孢子蟲病的新型候選疫苗[15]。

我國學者對新孢子蟲及新孢子蟲病的研究,在國內(nèi)外同類研究中處于領先地位。對新孢子蟲毒力因子和宿主抗新孢子蟲先天免疫機制的研究將為闡明新孢子蟲致病的分子機制奠定基礎。但有效防控牛的新孢子蟲病任重而道遠,關于新孢子蟲致病分子機制的研究還在繼續(xù)進行中,這些研究結果將為發(fā)現(xiàn)新的抗新孢子蟲藥物和開發(fā)有效疫苗、診斷方法提供堅實的理論基礎。