王 瀟,黃超華,曹琛福,史衛(wèi)軍,花群義,陳金頂

(1.深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術(shù)中心,廣東 深圳 518045;2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,廣東 廣州 510642)

藍舌病(Bluetongue,BT)是由呼腸孤病毒科、環(huán)狀病毒屬藍舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)引起,主要是由庫蠓傳播的反芻動物非接觸性病毒性傳染病。藍舌病已被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)認(rèn)為是影響反芻動物最重要的疾病之一[1]。藍舌病早在19世紀(jì)發(fā)現(xiàn)于南非,并蔓延到熱帶、亞熱帶和溫帶等多個地區(qū)[2]。1979年我國首次在云南省確定藍舌病的發(fā)生后,相繼又在湖北省、安徽省、四川省、山西省暴發(fā)過此病?，F(xiàn)已確認(rèn)有29種血清型,而我國主要的致病血清型為16型[3-4]。近年來在我國的藍舌病流行呈上升趨勢,如何有效的控制該病的流行,引起越來越多人的關(guān)注。目前,我國已經(jīng)研制出藍舌病的弱毒疫苗和滅活疫苗,但它們保護效果欠佳,并且存在一些弊端,因此研究者將目光轉(zhuǎn)移到研制新型基因工程疫苗上[5],主要集中在藍舌病病毒樣顆粒(Virus Like Particle,VLP)上[6]。

藍舌病核心樣顆粒由藍舌病結(jié)構(gòu)蛋白VP2、VP3、VP5和VP7構(gòu)成,其中VP3和VP7可裝配成藍舌病病毒核心樣顆粒(Core Like Particles,CLP)。CLP雖然不能刺激機體產(chǎn)生中和抗體,但作為病毒樣顆粒的主體結(jié)構(gòu),在病毒樣顆粒的形成過程中起到至關(guān)重要的作用。本文通過利用桿狀病毒表達系統(tǒng)表達16血清型藍舌病病毒兩種主要的結(jié)構(gòu)蛋白VP3和VP7,使其形成具有良好的抗原性和免疫原性的核心樣顆粒,為制備16血清型BTV VLP疫苗提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 大腸桿菌(E.colI)DH5α、DH10Bac(含Bacmid質(zhì)粒)、pFastBac Dual質(zhì)粒、Cellfectin? II Reagent、SF-900Ⅲ培養(yǎng)基均為Invitrogen公司產(chǎn)品;限制性內(nèi)切酶NotI、SacI、NcoI、NheI以及Taq酶均為TaKaRa公司產(chǎn)品;綿羊藍舌病陽性血清由英國動物衛(wèi)生研究所(IAH)提供;Rabbit Anti-Sheep lgG H&L(HRP)為 Abcam公司產(chǎn)品;W-TMB顯色試劑為Sangon Biotech公司產(chǎn)品;昆蟲細胞Sf9為深圳出入境檢驗檢疫局保存。

1.2 方法

1.2.1 VP3、VP7基因的合成以及pFastBac Dual-VP7-VP3質(zhì)粒的構(gòu)建 以生工生物工程(上海)股份有限公司合成BTVVP7整個開放閱讀框,而獲得的重組質(zhì)粒pUC-VP7為模板,上游引物VP7-S：5′-ATGGACACTATCGCTGCAAG-3′含有NotI酶切位點;下游引物 VP7-A：5′-TATGCGTAAGCGGCGCGTGC-3′,含有SacI酶切位點。進行PCR擴增,并將PCR擴增產(chǎn)物與質(zhì)粒pFastBac Dual經(jīng)限制性內(nèi)切酶NotI、SacI酶切后,用T4 DNA連接酶在16℃條件下,反應(yīng)3 h后,將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。經(jīng)鑒定后,將重組質(zhì)粒命名為pFastBac Dual-VP7。按照同樣方法構(gòu)建重組質(zhì)粒pFastBacDual-VP7-VP3。其中可擴增VP3基因的 PCR上游引物為VP3-S：5′-AACGAGCAACGTCCGGAGAG-3′含有 NcoI酶切位點;下游引物為 VP3-A：5′-AGCCTACACAGTCGGCGCAG-3′,含有NheI酶切位點。

1.2.2 重組桿狀病毒的獲得及VP3、VP7基因的表達 用構(gòu)建好的重組pFastBac Dual-VP7-VP3質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)菌后,平鋪到含有慶大霉素、卡那霉素、四環(huán)素、X-gal和IPTG的LB平板上,在37℃條件下,培養(yǎng)48 h后進行藍白菌落篩選,挑取白色菌落并鑒定。將鑒定后含有重組桿狀病毒DNA的菌落,進行提取Bacmid,并按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Cellfectin?II Reagent的說明書,將Bacmid轉(zhuǎn)染 Sf9細胞,觀察是否有細胞病變及減少的情況,從而獲得重組桿狀病毒。將獲得的重組桿狀病毒接入正常Sf9細胞,96 h后收集細胞,并進行SDS-PAGE以及Western Blot的驗證。

1.2.3 重組核心樣顆粒的收集與純化 收取重組病毒感染的細胞,加入適量的裂解緩沖液[50 mmol/L Tris-HCl(pH值8.0),150 mmol/L NaCl,0.5%NP40(v/v)],經(jīng)反復(fù)凍融后,放置4℃過夜。次日,4℃,10 000 r/min離心10 min,取上清,用PEG20 000包埋或者超濾管濃縮至適當(dāng)體積,用不連續(xù)蔗糖密度梯度超速離心進行純化。用 Tris-Nacl緩沖液(50 mmol/L MTris-HCl,15 mmol/L NaCl pH值8.4)配置30%和50%蔗糖,在4℃,26 400 r/min水平轉(zhuǎn)頭離心3 h,收集離心管底部沉淀,再加入Tris-Nacl緩沖液,再次進行4℃,30 000 r/min水平轉(zhuǎn)頭離心3 h,進行純化,收集底部已純化的病毒核心樣顆粒,并進行SDS-PAGE及Western Blot驗證。

1.2.4 電鏡觀察 將提純的病毒樣顆粒直接用醋酸鈾負(fù)染或者經(jīng)甲醛固定后按常規(guī)磷鎢酸負(fù)染后,將電鏡設(shè)置為×30.0 k放大倍數(shù)下進行觀察。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pFastBac Dual-VP7-VP3質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定 將所構(gòu)建的命名為pFastBac Dual-VP7質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶NotI、SacI對提取的質(zhì)粒進行雙酶切鑒定,證實VP7已經(jīng)成功克隆至表達載體pFast-Bac Dual。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pFastBac Dual-VP7-VP3經(jīng)PCR擴增和限制性內(nèi)切酶NcoI,NheI進行雙酶切鑒定,證實VP3成功克隆至表達載體pFastBac Dual-VP7。經(jīng)送檢測序確認(rèn)目的基因正確插入,最終證實重組pFastBac Dual-VP7-VP3質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖1)。

圖1 重組桿狀病毒表達載體質(zhì)粒結(jié)構(gòu)

2.2 重組桿狀病毒的獲得及VP3、VP7蛋白的表達 用構(gòu)建好的重組pFastBac Dual-VP7-VP3質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)菌,挑取白色菌落,通過菌落PCR鑒定后。按照大量提取試劑盒說明書,大量提取重組桿粒 Bacmid-VP7-VP3。將 Bacmid-VP7-VP3轉(zhuǎn)染Sf9細胞,72 h收集上清,再取適量的上清液接入健康的Sf9細胞,并設(shè)置正常細胞組,培養(yǎng)72 h后,將正常Sf9細胞組與接毒組(見封二彩版圖2)進行對比,觀察到接毒組細胞病變明顯,細胞體積增大,數(shù)量減少。收集上清獲得重組桿狀病毒。

圖2 轉(zhuǎn)染后Sf9細胞病變情況

2.3 重組核心樣顆粒的獲取與鑒定 收集重組桿狀病毒感染Sf9細胞并進行裂解處理后,將4℃,10 000 r/min離心10 min后取上清裂解液,進行不連續(xù)蔗糖密度梯度超速離心,將收集各層蛋白并進行驗證。結(jié)果顯示,核心樣顆粒位于離心管底部,并通過SDS-PAGE(圖3)及Western Blot(圖4)試驗驗證,均出現(xiàn)了兩條分別為100 kD和38 kD大小的目的條帶,所對應(yīng)的蛋白分別為VP3、VP7。同時將底部蛋白進行負(fù)染后電鏡觀察,發(fā)現(xiàn)在離心管底部收集到的蛋白中含有大量的空心顆粒(圖5),其與藍舌病核心樣顆粒形態(tài)一致。藍舌病病毒是一種20面體結(jié)構(gòu),所以在電鏡下多數(shù)會呈現(xiàn)出正六角形,直徑大約為70 nm左右,與多篇文獻報道一致[7-10]。

圖3 純化的病毒樣顆粒SDS-PAGE驗證結(jié)果

3 討論

隨著藍舌病快速的傳播,對我國畜牧業(yè)及產(chǎn)品進出口貿(mào)易的發(fā)展帶來了嚴(yán)重影響[11]。目前我國用于藍舌病病毒預(yù)防的疫苗主要是滅活疫苗和弱毒疫苗,但是效果并不是很理想。弱毒疫苗雖然有用量小以及可以有效的控制地方流行性藍舌病暴發(fā)的優(yōu)點,但是藍舌病病毒弱疫苗有致畸性,并且弱毒株也有可能與野毒株重組而產(chǎn)生新基因型毒株,引發(fā)一系列生物安全問題[12]。滅活疫苗雖然沒有毒性,但是,它免疫效果維持時間短,需要多次注射且要進行加強免疫,所以至今無法很好的運用于藍舌病的預(yù)防中。

圖4 純化的病毒樣顆粒Western Blot驗證結(jié)果

圖5 純化的病毒樣顆粒在電鏡×30.0 k放大倍數(shù)下的形態(tài)

隨著免疫學(xué)的發(fā)展,現(xiàn)如今重組技術(shù)已被用于藍舌病病毒疫苗的研究中,特別是關(guān)于核心樣顆?；蛑亟M病毒樣顆粒疫苗的研制,更是越來越多,并取得了一定的成果。VLP疫苗技術(shù)發(fā)展迅速,應(yīng)用性強,得到越來越多人肯定。VLPs制備的原理是在體外高效的表達某種病毒的一種或幾種主要的結(jié)構(gòu)蛋白,使其能夠自動裝配成在形態(tài)上類似于天然病毒的空心顆粒,因此VLPs技術(shù)在病毒的自主組裝與形態(tài)多樣性等基礎(chǔ)研究中也發(fā)揮著重要作用[13-15]。

藍舌病病毒是一類無包膜且結(jié)構(gòu)復(fù)雜的病毒,它外層蛋白外殼主要是由VP2和VP5蛋白構(gòu)成,內(nèi)層則主要是由VP3和VP7蛋白構(gòu)成[16]。本文通過構(gòu)建重組質(zhì)粒pFastBac Dual-VP7-VP3,在昆蟲細胞中同時表達兩個主要的內(nèi)層結(jié)構(gòu)蛋白VP3、VP7,觀察其自主裝配BTV CLP情況。試驗結(jié)果表明,通過所構(gòu)建的重組pFastBac Dual-VP7-VP3質(zhì)粒,獲得重組桿狀病毒后感染Sf9細胞,通過密度梯度離心可以大量獲取核心樣病毒顆粒,并證實其具有良好的反應(yīng)原性。在電鏡下也觀察到有病毒核心樣顆粒的形成。本文的試驗結(jié)果與王健偉[10]等的研究結(jié)果相似。與之相比,本研究在梯度離心和核心樣顆粒收集過程中作了一些改進,如采用30%和50%蔗糖進行梯度離心,收集沉淀后,再加入緩沖溶液,通過加大離心力的方式,進行再次離心,從而提升了核心樣顆粒的純化純度和效率;采用Tris-Nacl緩沖液(50 mMTris-HCl,15mmol/L MNaCl pH值8.4)溶解和保存核心樣顆粒,使之更加穩(wěn)定;本研究以國內(nèi)主要流行的藍舌病16型 VP3、VP7蛋白構(gòu)建核心樣顆粒,為國內(nèi)BTV VLP疫苗的研制以及藍舌病的防控工作打下基礎(chǔ)。