張青青,李月華,趙建梅,馬金梅,劉煥奇,曲志娜

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,山東 青島 266109;2.中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心,山東 青島 266032;3.蓬萊市畜牧獸醫(yī)工作站,山東 蓬萊 265600)

牛奶作為生活中的必備品,關(guān)系到人們的身心健康,日常所飲用的牛奶都是經(jīng)過消毒、滅菌后投入市場中,但是新鮮牛乳中的病原菌是不可忽視的。奶牛乳房炎作為當(dāng)今世界各國奶牛生產(chǎn)中經(jīng)濟(jì)損失最多的疾病之一,主要病因是多種病原微生物的感染。研究表明,牛奶中主要病原菌為金黃色葡萄球菌,其次為大腸桿菌和鏈球菌[1-4]。且大腸桿菌是一種條件致病菌,大多數(shù)是人和動(dòng)物腸道內(nèi)的正常菌群,但也有一部分具有致病性,致病性大腸桿菌會(huì)對(duì)畜牧業(yè)養(yǎng)殖造成一定的經(jīng)濟(jì)損失,危害人類健康。

本試驗(yàn)采集山東13個(gè)地級(jí)市的奶樣,樣品包含非乳房炎奶樣和乳房炎奶樣,對(duì)奶樣進(jìn)行金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和鏈球菌的分離鑒定,并對(duì)分離到的大腸桿菌進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化群分析,以期了解山東地區(qū)牛奶中主要病原菌的流行情況以及大腸桿菌的致病情況,為后期病原菌耐藥性以及菌株分子流行情況提供支持。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 7.5%氯化鈉肉湯、NB肉湯、乙基紫疊氮鈉肉湯、胰蛋白胨大豆肉湯、MH肉湯;金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂、三糖鐵瓊脂、細(xì)菌瓊脂粉、哥倫比亞血瓊脂基礎(chǔ)、糖發(fā)酵管、凍干兔血漿;大腸桿菌生化鑒定條以及試劑盒;Swarm瓊脂、GoTaqGreen Master Mix酶、DNA Marker DL-1 000。

1.2 樣品采集 本試驗(yàn)采集了山東省13個(gè)地區(qū)35個(gè)牧場的非乳房炎奶樣985份和乳房炎奶樣284份,每份奶樣來自奶牛的一個(gè)乳區(qū)。取樣前先用溫水清洗乳房,然后依次用0.2%新潔爾滅浸泡的紗布、75%酒精棉擦拭消毒乳頭,擠去采樣乳區(qū)的頭3把奶后采集乳汁5 mL于滅菌試管中,做好標(biāo)記后4℃ 保存帶回實(shí)驗(yàn)室,進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)。

1.3 細(xì)菌分離培養(yǎng)與純化 每份樣品各取3份,每份1 mL置于滅菌離心管中,12000 r/min離心2 min后,棄上層液體,留底部沉淀物。3份沉淀物分別經(jīng)7.5%NaCl肉湯、NB肉湯和乙基紫疊氮鈉肉湯37℃培養(yǎng)18～24 h后再分別于金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、哥倫比亞血平板上分離純化培養(yǎng),觀察菌落形態(tài),直到顯色培養(yǎng)基上沒有雜菌即可。

疑似金黃色葡萄球菌在顯色培養(yǎng)基上菌落呈(淺)紫紅色;疑似大腸桿菌在麥康凱培養(yǎng)基上呈表面光滑的紅色菌落;疑似鏈球菌在哥倫比亞血平板上呈淡灰色、隆起、閃光的小菌落,無乳鏈球菌常呈α或β溶血,但有的菌株不溶血;停乳鏈球菌和乳房鏈球菌一般不溶血,有時(shí)也可產(chǎn)生微弱的α溶血。

1.4 大腸桿菌系統(tǒng)進(jìn)化群分析 利用PCR方法擴(kuò)增菌株的chuA和yjaA基因以及DNA片段TspE4.C2,引物序列由擎科生物公司合成,見表1。根據(jù)結(jié)果對(duì)菌株進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化群分析[5],判定標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表1 引物序列及目的片段大小

表2 大腸桿菌系統(tǒng)進(jìn)化群判定標(biāo)準(zhǔn)

1.5 細(xì)菌鑒定

1.5.1 PCR鑒定 對(duì)金黃色葡萄球菌和鏈球菌進(jìn)行PCR鑒定,引物[6-7]由擎科生物公司合成,見表3。將分離的疑似菌株經(jīng)PCR擴(kuò)增、電泳鑒定,同時(shí)擴(kuò)增出16s RNA、nuc條帶的菌株為金黃色葡萄球菌,如圖1;擴(kuò)增出sip1、sip2和sip3的分別為無乳鏈球菌、停乳鏈球菌和乳房鏈球菌,電泳結(jié)果見圖2。

表3 引物序列及目的片段大小

圖1 金黃色葡萄球菌電泳鑒定結(jié)果

圖2 三種鏈球菌電泳結(jié)果

1.5.2 生化鑒定

對(duì)葡萄球菌疑似菌株進(jìn)行血漿凝固酶試驗(yàn);大腸桿菌疑似菌株進(jìn)行三糖鐵、生化鑒定條試驗(yàn);鏈球菌疑似菌株進(jìn)行CAMP、馬尿酸鈉、七葉苷、甘露醇、山梨醇、乳糖和水楊苷試驗(yàn),觀察其結(jié)果。

1.6 數(shù)據(jù)處理

利用卡方檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析,P≤0.01,差異極顯著;P＜0.05,差異顯著;P＞0.05,差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 生化鑒定結(jié)果

2.1.1 金黃色葡萄球菌血漿凝固酶試驗(yàn)結(jié)果 結(jié)果顯示為膠凍樣固體的為凝固酶陽性菌株,結(jié)果顯示為肉湯液體的為凝固酶陰性菌株。

2.1.2 大腸桿菌生化試驗(yàn)結(jié)果 大腸桿菌在三糖鐵斜面試驗(yàn)中產(chǎn)生斜面黃色/底層黃色現(xiàn)象的為陽性菌株,斜面/底層產(chǎn)生黑色現(xiàn)象的為陰性菌株;根據(jù)大腸桿菌生化鑒定條使用說明書進(jìn)行判定,靛基質(zhì)、甲基紅、V-P試驗(yàn)和西蒙氏枸櫞酸鹽生化反應(yīng)結(jié)果依次為++--的細(xì)菌為陽性菌株,其他為陰性菌株。

2.1.3 鏈球菌生化鑒定試驗(yàn) 對(duì)分離到的鏈球菌疑似菌株進(jìn)行CAMP試驗(yàn),原來不溶血或者溶血不明顯的無乳鏈球菌會(huì)呈明顯的β溶血,再進(jìn)行生化鑒定試驗(yàn),根據(jù)顏色變化進(jìn)行判斷,判斷結(jié)果參照表4。

表4 鏈球菌生化鑒定結(jié)果判斷

2.2 樣品檢測結(jié)果

2.2.1 樣品總體檢測概況 本試驗(yàn)采集了山東13個(gè)地區(qū)35個(gè)牧場1 269份樣品,其中非乳房炎樣品985份,乳房炎樣品284份,通過分離鑒定試驗(yàn),共分離到422株菌,陽性率為33.25%,其中金黃色葡萄球菌樣品檢出率為11.82%(150/1 269)、大腸桿菌19.54%(248/1 269)、無乳鏈球菌2.76%(35/1 269)、停乳鏈球菌1.42%(18/1 269)、乳房鏈球菌 3.86%(49/1 269)。結(jié)果見表5。

表5 山東各地區(qū)奶樣數(shù)量、菌株分離情況與分離率

2.2.2 非乳房炎/乳房炎樣品檢測結(jié)果比較 非乳房炎和乳房炎樣品中各種細(xì)菌檢測結(jié)果見表5和圖3。結(jié)合表5和圖3可知,乳房炎/非乳房炎樣品中大腸桿菌檢出率(23.24%/18.48%),均高于其他4種細(xì)菌的檢出率,其次是金黃色葡萄球菌;統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得出,乳房炎樣品中金黃色葡萄球菌檢出率(15.14%)高于非乳房炎樣品(10.86%),差異顯著(P=0.049);乳房炎樣品中大腸桿菌檢出率(23.24%)與非乳房炎(18.48%)差異不顯著(P=0.075);乳房炎樣品中鏈球菌檢出率(13.03%)高于非乳房炎(6.60%),差異極顯著(P=0.000 5)。從3種細(xì)菌總體檢出率來看,乳房炎中細(xì)菌檢出率(51.41%)明顯高于非乳房炎(35.94%)(P=2.60E-06),說明乳房炎與病原菌的存在有關(guān)。

圖3 非乳房炎/乳房炎樣品檢出率

2.2.3 不同地區(qū)樣品檢測結(jié)果比較 不同地區(qū)樣品中各種細(xì)菌檢出結(jié)果見表5和封三彩版圖4。

由表5和圖4可知,青島地區(qū)樣品檢出率(67.91%)高于其他地區(qū),金黃色葡萄球菌在青島檢出率(50.0%)最高,其次是日照(25.0%)、棗莊(18.79%)和臨沂(16.28%),而在泰安、濟(jì)寧、菏澤和煙臺(tái)并未檢出;大腸桿菌在東營的檢出率(40.0%)最高,而在日照并未檢出;無乳鏈球菌和停乳鏈球菌在各地的檢出率總體不高,且無明顯差異;而乳房鏈球菌在日照的檢出率(31.25%)最高,其次是東營地區(qū)(15.0%),在德州和淄博并未檢出。

圖4 不同地區(qū)樣品檢測結(jié)果

2.2.4 不同時(shí)間樣品檢測結(jié)果比較 不同采樣時(shí)間樣品檢測結(jié)果見表6和圖5。

表6 不同采樣時(shí)間與樣品檢測率

圖5 不同采樣時(shí)間樣品檢出結(jié)果

由表6可知,6月樣品檢出率(67.91%)最高,明顯高于其他時(shí)間(P=3.24E-26),12月最低(16.28%);圖5可知,樣品檢出率隨著采樣時(shí)間的推移呈現(xiàn)下降趨勢;9月和10月檢出率差異不明顯(P=0.846),11月和12月檢出率差異不明顯(P=0.421)。

2.2.5 大腸桿菌系統(tǒng)進(jìn)化群分群結(jié)果 248株大腸桿菌通過系統(tǒng)進(jìn)化群分析,得到共生群A群213株,檢出率為85.89%;致病群35株,檢出率為14.11%,其中低致病群B1群29株,檢出率為11.69%,高致病群B2群2株和D群4株,檢出率分別為0.81%和1.61%,由此可見,分離到的大腸桿菌多數(shù)不是致病菌株,具體結(jié)果見表7和圖6。由表7可知,非乳房炎樣品中大腸桿菌共生群A群為161株,占88.95%,致病群20株,占11.05%;而乳房炎樣品中大腸桿菌共生群A群為52株,占77.61%,致病群15株,占22.39%。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得出,乳房炎樣品致病群的檢出率(22.39%)明顯高于非乳房炎(11.05%)(P=0.023),說明乳房炎的發(fā)生與致病菌有關(guān)。

表7 大腸桿菌系統(tǒng)進(jìn)化群分群統(tǒng)計(jì)結(jié)果

圖6 大腸桿菌系統(tǒng)進(jìn)化群分群統(tǒng)計(jì)結(jié)果

3 討論

3.1 細(xì)菌分離鑒定 試驗(yàn)?zāi)虡觼碜陨綎|13個(gè)地級(jí)市的非乳房炎和乳房炎奶樣,采樣具有廣泛代表性。研究表明,主要病原菌為大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌,故本研究也圍繞這3種細(xì)菌開展相關(guān)試驗(yàn)。結(jié)果顯示,大腸桿菌分離率為19.54%,這與丁丹丹[8]等調(diào)查河南省分離率(21.51%)和趙秋云[9]等調(diào)查陜西地區(qū)分離率(22.22%)結(jié)果相似;而金黃色葡萄球菌分離率為11.82%,這與覃杰[10]等調(diào)查新疆鐵門地區(qū)分離率(33.6%)、薛梅[11]等調(diào)查濰坊分離率(34.34%)和易明梅[12]等調(diào)查上海地區(qū)分離率(69.16%)的結(jié)果相差較大;鏈球菌分離率為8.04%,與項(xiàng)開合[13]調(diào)查丹東地區(qū)鏈球菌分離率(35.25%)和王金濤[14]等調(diào)查黑龍江墾區(qū)分離率(32%)結(jié)果不一致。分析原因發(fā)現(xiàn),這些研究主要是針對(duì)奶牛乳房炎樣品,而本試驗(yàn)樣品包含非乳房炎和乳房炎奶樣,使得金黃色葡萄球菌和鏈球菌的分離率低;其次地區(qū)不同對(duì)于細(xì)菌的分離情況也有所差異;最后通過本試驗(yàn)分析,細(xì)菌分離率也與采樣時(shí)間有關(guān),從表6可以看出,6月細(xì)菌檢出率(67.91%)最高,因?yàn)?月份天氣炎熱,空氣潮濕,使奶牛應(yīng)激反應(yīng)大,免疫力下降,細(xì)菌大量繁殖,造成乳房炎的發(fā)生,且乳房炎以夏季發(fā)病率最高,其次是秋季,最低是冬季;隨著采樣時(shí)間的推移,乳房炎奶樣數(shù)量減少,且奶樣中細(xì)菌檢出率減低。

3.2 大腸桿菌系統(tǒng)進(jìn)化群分析 大腸桿菌系統(tǒng)進(jìn)化群可以分為A、B1、B2和D四個(gè)群,A群一般為共生群,B1為低致病群、B2和D群為高致病群。系統(tǒng)進(jìn)化群的分布與動(dòng)物種類、動(dòng)物健康狀態(tài)和地理位置有關(guān)[15],目前大多數(shù)研究對(duì)象為禽和豬,而關(guān)于牛奶中大腸桿菌系統(tǒng)進(jìn)化群的相關(guān)研究幾乎沒有,所以在大腸桿菌分離的基礎(chǔ)上開展了相關(guān)試驗(yàn)。結(jié)果顯示,A群檢出率(85.89%)最高,致病群檢出率為14.11%,說明我們在對(duì)大腸桿菌進(jìn)行分離鑒定時(shí)也要對(duì)其致病群進(jìn)行相關(guān)研究。通過差異顯著性分析,乳房炎樣品致病群檢出率(22.39%)明顯高于非乳房炎(11.05%)(P=0.023),說明奶牛發(fā)生乳房炎與致病群的存在有關(guān)。另外,與其他動(dòng)物中大腸桿菌的分群結(jié)果相比存在差異,牛春玲[16]對(duì)來自江蘇、安徽、山東等地區(qū)病死鴨的480株大腸桿菌進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化群分析,結(jié)果表明A群最高(56.25%);其次是B2群(19.17%)。蘇志新[17]對(duì)來自上海閔行區(qū)周邊病死雞的80株大腸桿菌進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化群分析,結(jié)果表明B1群為優(yōu)勢進(jìn)化群。本試驗(yàn)中高致病群B2群的菌株在非乳房炎奶樣中檢出,說明大腸桿菌作為一種條件致病菌,在健康奶牛中也會(huì)存在高致病菌株,而這些菌株在適宜條件下也會(huì)導(dǎo)致奶?；疾?所以牧場要加強(qiáng)養(yǎng)殖衛(wèi)生狀況和飼養(yǎng)管理水平,提前預(yù)防乳房炎的發(fā)生。