崔 鑫,朱廣藝,胡建軍,喻華英

(塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,新疆 阿拉爾 843300)

犢牛腹瀉是危害犢牛早期死亡的主要疾病之一,給奶牛場造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。犢牛腹瀉主要包括病原性因素和非病原性因素,而病原性因素主要包括：細(xì)菌性、病毒性、寄生蟲等,非病原性因素主要與營養(yǎng)元素缺乏、飼養(yǎng)管理不善、環(huán)境條件和氣候突變等諸多因素有關(guān)[1-2]。在細(xì)菌性因素中,主要有大腸桿菌、沙門菌、痢疾桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌和腸球菌等,其中由致病性大腸桿菌引起的占60%,又稱為犢牛白痢,多感染10～20日齡以內(nèi)的犢牛,發(fā)病率為30.27% ～96.4%。多表現(xiàn)為急性腹瀉、脫水及虛脫等癥狀,多發(fā)生于冬春季節(jié)[3]。

近年來,由于抗生素濫用、亂用,導(dǎo)致細(xì)菌對抗生素的耐藥性升高,耐藥菌株明顯增加[4-6]。據(jù)美國CDC統(tǒng)計,65%的人類細(xì)菌性感染都與生物膜形成有關(guān),細(xì)菌生物膜(Biofilm,BF)：是指附著于有生命或無生命物體表面被細(xì)菌胞外大分子包裹的有組織的細(xì)菌群體[7]。細(xì)菌形成生物膜后可提高細(xì)菌的耐藥性和致病力,常見的能形成生物膜的細(xì)菌主要有：大腸桿菌、沙門菌、枯草桿菌、變形桿菌、綠膿桿菌、葡萄球菌等。大腸桿菌可在動物消化道、尿道、呼吸道等表面形成生物膜,導(dǎo)致動物感染大腸桿菌病后出現(xiàn)反復(fù)感染、難以治愈現(xiàn)象[8]。

中藥在防治畜禽疾病,解決抗生素殘留和抗藥性問題的作用已成為獸醫(yī)藥理學(xué)研究熱點(diǎn)之一[9-11]。中草藥提取物對大腸桿菌耐藥性及耐藥質(zhì)粒的消除已經(jīng)取得了初步效果[12-19]。

本試驗以1株生物膜強(qiáng)陽性的大腸桿菌為研究對象,采用不同濃度甘草提取物對大腸桿菌生物膜形成進(jìn)行抑制試驗研究,為探討甘草提取物對大腸桿菌引起的犢牛腹瀉病防治提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 病料來源 2017年在新疆阿克蘇地區(qū)某養(yǎng)牛場,采集1～15日齡犢牛腹瀉的糞便6份,送實驗室檢測。

1.2 培養(yǎng)基 營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂、伊紅美藍(lán)瓊脂、膽硫乳瓊脂、三糖鐵瓊脂、西蒙氏枸櫞酸鹽瓊脂、LB液體培養(yǎng)基等,購自北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司;5×M9培養(yǎng)基,購自BD Falcon公司;糖發(fā)酵、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇等,購自天津永晟精細(xì)化工有限公司。

1.3 試劑 革蘭染色液、結(jié)晶紫(Crystal Violet)為Baso產(chǎn)品;1.6%溴甲酚紫、1%PBS、95%乙醇、甲醇,購自天津市登科化學(xué)試劑有限公司;甘草提取物,購自新疆阿拉爾市新農(nóng)開發(fā)有限公司。

1.4 設(shè)備與儀器 全自動全波長酶標(biāo)儀(Power-WaveXS美國);紫外線分光光度計(GD5406014上海棱光技術(shù)有限公司);小型離心機(jī)(Sigmal-13LabwayScience公司);全溫度多振幅高速軌道搖床(日本奧林巴斯公司);U型96孔細(xì)胞板(3599),購自Corning Costar公司;灌胃針(由塔里木大學(xué)生理實驗室提供);一次性注射器5 mL,購自塔里木大學(xué)校醫(yī)院。

1.5 實驗動物 小鼠25只,8～12周齡,體重為18～25 g,雌雄各半,購自塔里木大學(xué)動物實驗站。

2 方法

2.1 細(xì)菌分離 取少量糞便樣品接種LB液體培養(yǎng)基中,37℃震搖16 h;將過夜培養(yǎng)的菌液劃線接種于普通培養(yǎng)基,挑取單菌落接種于普通瓊脂斜面純培養(yǎng),革蘭染色、鏡檢。

2.2 細(xì)菌生化鑒定 (1)將分離細(xì)菌分別接種到葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)16 h,觀察是否產(chǎn)酸產(chǎn)氣;(2)將分離細(xì)菌分別接種三糖鐵瓊脂斜面、枸櫞酸鹽瓊脂斜面試驗、觸酶(過氧化氫酶)試驗等生化鑒定試驗。

2.3 細(xì)菌選擇鑒別培養(yǎng) 將革蘭陰性桿菌分別接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基、膽硫乳瓊脂鉍培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)24 h。

2.4 大腸桿菌生物膜形成的檢測試驗-96孔微量板法 (1)挑取麥康凱培養(yǎng)基上的紅色單菌落,接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基,37℃震蕩培養(yǎng)16 h;(2)取菌液按1∶100接種于LB液體培養(yǎng)基,37℃震蕩培養(yǎng)4 h,OD600值在0.4～0.6之間,取200 μL稀釋的菌液上96微孔板,每列加樣6孔,余下2孔用LB液體培養(yǎng)基做空白對照,37℃培養(yǎng)24～48 h;(3)棄液,加1%PBS洗滌3次,甲醇固定15 min,棄液,加1%結(jié)晶紫染色液染色5 min,洗滌,晾干;(4)加入33%冰醋酸溶液,作用30 min,測OD600值;(5)計算和結(jié)果判定：大腸桿菌生物膜粘附性判定標(biāo)準(zhǔn)：測定的值減去空白對照值大于0.12為生物膜陽性;臨界值ODc(CUT OFF)計算：空白對照平均OD值(X)+3×標(biāo)準(zhǔn)差SD;不粘附(-)：OD≤ODc;弱粘附(+)：ODc＜OD≤2ODc;中等粘附(++)：2ODc＜OD≤3ODc;強(qiáng)粘附(+++)：OD＞3ODc。

2.5 甘草提取物MIC的測定 (1)大腸桿菌XN-3-6株接種LB液體培養(yǎng)基,37℃,震蕩培養(yǎng)18～24 h。將培養(yǎng)的菌液與麥?zhǔn)媳葷峁鼙葷?將細(xì)菌數(shù)稀釋約為1×105CFU/mL;(2)甘草提取物藥液的配制：所用甘草提取物規(guī)格為1 g,無菌操作溶于10 mL滅菌蒸餾水中,加熱加速溶解,配制藥液濃度為0.1 g/mL;(3)取96孔板,在無菌條件下,在A、C、E行第1孔至第10孔內(nèi)加入稀釋好的菌液各100 μL,在第1孔內(nèi)加入配制好的濃度為0.1 g/mL的甘草提取物藥液100 μL,混勻后吸取100 μL到第2孔,混勻,再吸取100 μL至第3孔,依次類推到第9孔,混勻后第9孔棄去含甘草提取物藥液的培養(yǎng)液100 μL;再在C行第1孔至第10孔內(nèi)加入滅菌生理鹽水100 μL,混勻,最終第10孔為不加甘草提取物藥液的LB培養(yǎng)基做對照。于37℃培養(yǎng)24 h,此時,第1孔至第9孔藥液濃度分別為50、25、12.5、6.25、3.12、1.56、0.78、0.39、0.195 g/mL。

2.6 甘草提取物對大腸桿菌(XN-3-6)生物膜形成抑制試驗 (1)大腸桿菌(XN-3-6)株分別接種到5 mL的LB液體培養(yǎng)基,37℃,震蕩培養(yǎng)18～24 h;(2)配制甘草提取物濃度：將甘草提取物溶解并配制下列濃度備用,分別為0%、5%、2.5%、1.25%、0.625%;(3)取菌液按1∶100接種于LB液體培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)4 h,OD600值在0.4～0.6之間的菌液200 μL加入96孔細(xì)胞板,每列加樣6孔,余下2孔加LB液體培養(yǎng)基作空白對照,37℃培養(yǎng)24～48 h;(4)在96孔細(xì)胞板第1、2列分別加入100 μL 的 LB 液體培養(yǎng)基,在第 3、4、5、6、7、8、9、10列中,分別加入100 μL不同濃度藥液,37℃培養(yǎng)24 h;(5)棄液,加入1%PBS洗滌3次,甲醇固定15 min,棄液,拍干,1%結(jié)晶紫染色5 min。洗滌,晾干;(6)加入33%冰醋酸溶解,作用30 min,測OD600值。

2.7 大腸桿菌生物膜陽性菌株(XN-3-6)致病力觀察 (1)將大腸桿菌生物膜強(qiáng)陽性菌XN-3-6株接種于5 mL LB,37℃培養(yǎng)16 h;(2)將小鼠隨機(jī)分成三組：試驗組、試驗對照組和空白組,試驗組和試驗對照組,每組各10只,體重20 g,組內(nèi)體重差不超過10%,雌雄各半。試驗前禁食12 h,自由飲水。試驗組：每只小鼠腹腔接種大腸桿菌生物膜強(qiáng)陽性菌(XN-3-6)株,接種劑量0.4 mL(1×109CFU/mL);試驗對照組：每只小鼠腹腔接種生物膜陰性菌株(XN-3-10)株,接種劑量0.4 mL(1×109CFU/mL)。空白組5只小鼠,每只小鼠注射0.4 mL生理鹽水[29]。觀察記錄小鼠變化情況,死亡小鼠及時剖檢,無菌取肝臟、脾臟、腹腔積液涂片觀察。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果 在6份犢牛腹瀉糞便中,經(jīng)細(xì)菌常規(guī)分離鑒定得到31株菌,革蘭染色鏡檢,得到革蘭陰性菌有29株,革蘭陽性菌有2株,經(jīng)生化鑒定和選擇培養(yǎng)基鑒定獲得：大腸桿菌24株,占82.8%;沙門菌5株,占17.2%。

3.2 選擇培養(yǎng)和生化鑒定結(jié)果 大腸桿菌在麥康凱培養(yǎng)基上菌落呈紅色,在伊紅美藍(lán)瓊脂上呈黑色帶金屬光澤;沙門菌在麥康凱培養(yǎng)基上的菌落呈白色、透明,在伊紅美藍(lán)瓊脂上呈白色、透明或半透明,膽硫乳瓊脂平板上呈黑色,有的帶有金屬光澤。

生化鑒定結(jié)果(見表1)。

表1 大腸桿菌和沙門菌生化鑒定結(jié)果

3.3 大腸桿菌生物膜篩選結(jié)果(見圖1) 經(jīng)過細(xì)菌分離以及96孔微量板的篩選可知：24株大腸桿菌中,,生物膜陽性的菌株有 3株,陽性率為12.5%;其中(XN-3-3)是弱粘附性菌株(+);(XN-3-1)是中等粘附性菌株(++);(XN-3-6)是強(qiáng)粘附性菌株(+++);(3-10)是陰性對照。

3.4 不同濃度的甘草提取物對大腸桿菌細(xì)菌(XN-3-6)生長及生物膜生長抑制作用的結(jié)果見圖 2、圖 3。

圖2所示：與正常不加藥的濃度相比較,在藥物濃度為0.625%時,細(xì)菌生長明顯受到抑制,隨著藥物濃度的升高,甘草提取物對大腸桿菌(XN-3-6)細(xì)菌的生長也在逐漸增強(qiáng)的趨勢,由此可判定：甘草提取物對大腸桿菌(XN-3-6)的MIC值為62.5 mg/mL。

圖2 不同濃度甘草提取物對大腸桿菌(3～6)細(xì)菌生長的影響

圖3所示：與不加藥的生物膜生長比較,甘草提取物在濃度為0.625%、1.25%、2.5%時,細(xì)菌生物膜的生長呈增強(qiáng)的趨勢。在2.5% ～5%時,生物膜生長呈現(xiàn)下降的趨勢,在5%濃度生物膜達(dá)到最低,由此可知：在本試驗中甘草提取物抑制大腸桿菌(XN-3-6)生物膜生長的最小濃度為5%。

圖3 不同濃度甘草提取物對大腸桿菌(3～6)生物膜生長的影響

3.5 生物膜陽性菌株致病力觀察-動物攻毒試驗的結(jié)果 試驗組：4只小鼠在4 h死亡;4只小鼠在12 h死亡,;2只在23 h死亡,死亡率100%。試驗對照組：2只小鼠8 h死亡;4只小鼠在18 h死亡,;2只在23 h死亡;2只存活,死亡率80%?？瞻捉M無小鼠死亡。

3.5.1 死亡小鼠腹腔剖檢及肝、脾、腹腔液的革蘭染色鏡檢觀察結(jié)果 觀察試驗組注射(XN-3-6)：小鼠蜷縮趴臥,精神萎靡,被毛豎立,呼吸急促。出現(xiàn)抓臉、撓嘴,有腹瀉癥狀出現(xiàn),糞便粘糊在尾根、后肢臀部。剖檢可見：腹腔內(nèi)有大量腹腔液,腸臌氣明顯,腸黏膜有明顯出血,肝臟顏色呈土黃。肝、脾、腹腔積液涂片觀察,有大量革蘭陰性短桿狀細(xì)菌。

3.5.2 試驗對照組注射(XN-3-10) 小鼠精神萎靡,呼吸急促。出現(xiàn)抓臉、撓嘴,無腹瀉癥狀出現(xiàn)。剖檢可見：腹腔內(nèi)有少量腹腔液,腸臌氣,腸黏膜有輕微出血。肝、脾、腹腔積液涂片觀察,均有少量革蘭陰性短桿狀細(xì)菌。

4 討論

4.1 引起犢牛腹瀉優(yōu)勢菌株的分析 引起犢牛腹瀉的病因有：細(xì)菌、病毒和寄生蟲等[20-23],文獻(xiàn)[28]喻華英等在2009對新疆阿克蘇某奶牛場患腹瀉的12份糞便分離鑒定：分離出28株菌,其中大腸桿菌11株,占39.3%,沙門菌9株,占32.1%,克雷伯菌5株,占17.9%,未鑒定3株,占10.7%。本試驗在2017年對新疆阿克蘇某奶牛場患腹瀉6份糞便中,分離出31株菌,其中大腸桿菌24株,占82.8%;沙門菌5株,占17.2%;未鑒定的有2株,占6.5%。從細(xì)菌學(xué)角度看：隨著時間的變遷,該地區(qū)引起犢牛腹瀉的優(yōu)勢菌株依然是大腸桿菌。

4.2 大腸桿菌生物膜的形成與犢牛腹瀉病的關(guān)系利用96孔微量板法,從24株大腸桿菌篩選得到3株生物膜陽性,陽性率為12.5%。表明：臨床上大腸桿菌病出現(xiàn)反復(fù)感染、不易根治等,這可能與大腸桿菌形成生物膜有一定的相關(guān)性。

4.3 甘草提取物對大腸桿菌(XN-3-6)生物膜形成抑制作用的分析 本試驗用濃度為0.625%、1.25%、2.5%、5%甘草提取物,對篩選出的生物膜強(qiáng)陽性菌株(XN-3-6)進(jìn)行了藥物作用試驗。發(fā)現(xiàn)甘草提取物在濃度為0.625%、1.25%、2.5%時,細(xì)菌生物膜的生長呈增強(qiáng)的趨勢,在濃度為5%時,生物膜生長明顯受到抑制。甘草藥理研究表明：甘草對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌、綠膿桿菌、乙型鏈球菌有明顯抑制作用[24]。甘草提取物,其主要成分是甘草甜素、甘草次酸、甘草類黃酮等的混合物。甘草甜素的主要成分是甘草酸,具有抗菌和抗病毒作用;甘草次酸具有抗炎、抗?jié)兊茸饔谩?jù)[25-27]相關(guān)研究,甘草類黃酮化合物含有甘草查爾酮B、甘草查爾酮A、光甘草素,其中光甘草素對金黃色葡萄球菌和枯草桿菌以及革蘭陰性菌都有一定的抗菌活性。

本試驗結(jié)果顯示：甘草提取物中一定存在對大腸桿菌生物膜有抑制作用的成分,對這種成分單體提取和獲得是今后研究工作的重點(diǎn)。

4.4 大腸桿菌生物膜陽性菌株(XN-3-6)致病力觀察-動物攻毒試驗的討論 大腸桿菌生物膜強(qiáng)陽性菌株(XN-3-6),引起10只小鼠均死亡,死亡率100%;大腸桿菌生物膜陰性(XN-3-10)8只小鼠均死亡,2只存活,死亡率80%,從死亡時間和死亡率看出：大腸桿菌形成生物膜后其致病力呈現(xiàn)增強(qiáng)的趨勢,這為臨床上大腸桿菌病呈現(xiàn)出耐藥性升高、反復(fù)感染、不易根治提供了有力的佐證。