燕榮帥 周鑫 陳鑫 樊東力 張一鳴

創(chuàng)面愈合是燒創(chuàng)傷的基本問題，促進(jìn)皮膚創(chuàng)面的修復(fù)是燒創(chuàng)傷治療的主要任務(wù)[1-2]。在當(dāng)前的臨床治療中，創(chuàng)面的再上皮化是創(chuàng)面愈合的關(guān)鍵標(biāo)志，表皮細(xì)胞的增殖及遷移又是創(chuàng)面再上皮化的重要步驟[3-5]，表皮細(xì)胞的增殖及遷移在創(chuàng)面愈合的調(diào)控過程顯得極其重要。

在急性創(chuàng)面早期，由于細(xì)胞的高氧耗狀態(tài)，使得創(chuàng)面周圍常處于低氧或缺氧微環(huán)境[6-7]。大量的研究已顯示，這種短時的低氧微環(huán)境對創(chuàng)面的愈合起著極大的促進(jìn)作用[8-9]，但目前其具體的分子調(diào)控機(jī)制并不清楚。本研究擬采用基因芯片技術(shù)，探究短時低氧處理后表皮細(xì)胞HaCaT轉(zhuǎn)錄組表達(dá)調(diào)控變化，找出其關(guān)鍵調(diào)控因子，同時探究其可能的信號調(diào)控方式。本研究對進(jìn)一步闡明皮膚創(chuàng)面愈合機(jī)理，并進(jìn)行有效地干預(yù)、進(jìn)一步促進(jìn)創(chuàng)面愈合具有重要的作用，同時也可為促進(jìn)燒、創(chuàng)傷創(chuàng)面愈合提供新的思路與策略。

材料與方法

一、細(xì)胞株及關(guān)鍵的試劑、儀器及電腦軟件

本研究所采用的表皮細(xì)胞株為購置于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫的人正常皮膚永生化角質(zhì)形成細(xì)胞株（HaCaT細(xì)胞）。細(xì)胞培養(yǎng)基為美國Hyclone公司 MEM/EBSS培養(yǎng)基，胎牛血清（美國Gibco公司），雙抗 Penicillin-Streptomycin（美國Hyclone公司）。TRIzol Reagent（美國Invitrogen公司）。反轉(zhuǎn)錄及Taq聚合酶等試劑盒（大連TaKaRa公司）。基因芯片[美國Affymetrix公司GeneChip?Human Transcriptome Assay 3.0（Clariom D human）]。 此外在基因芯片步驟還用到的試劑有美國Affymetrix公司GeneChip WT Terminal Labeling and Controls Kit、Ambion WT Expression Kit以及GeneChip Hybridization，Wash，and Stain Kit。基因芯片步驟中用到的儀器包括芯片洗脫工作站GeneChip Fluidics Station 450、基因芯片雜交爐GeneChip Hybridization Oven 645、基因芯片掃描儀GeneChip Scanner 3000 7G以及GeneChip GCOS軟件Affymetrix GeneChip Operating Software。

二、方法

（一）細(xì)胞培養(yǎng)及低氧處理

HaCaT細(xì)胞采用10%胎牛血清、1%雙抗的MEM/EBSS培養(yǎng)液，置于常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（37 ℃，5%CO2，10%O2，85%N2）。待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時胰酶消化傳代，分別置于常規(guī)培養(yǎng)箱及低氧培養(yǎng)箱（37 ℃，5%CO2，1%O2，94%N2）繼續(xù)培養(yǎng)。在放到低氧培養(yǎng)箱之前，細(xì)胞更換提前在低氧培養(yǎng)箱中放置處理的培養(yǎng)液。

（二）RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄

待細(xì)胞在低氧或常氧條件下培養(yǎng)30 min后取出培養(yǎng)皿，在低氧條件下培養(yǎng)為低氧組，常氧條件下培養(yǎng)為常氧對照組。采用Trizol法提取兩樣本總RNA。其后保存于無RNA酶的EP管中，然后凍存在-80℃冰箱備用。取一管采用NanoDrop檢測RNA濃度，A260/A280的比值在1.8 ～ 2.0之間為符合要求，進(jìn)一步采用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。對符合要求的總RNA進(jìn)一步采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒按照步驟要求進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄進(jìn)入下一步的實(shí)驗(yàn)。

（三）基因芯片的檢測

本研究采用Affymetrix WT芯片推薦試劑盒GeneChip WT Terminal Labeling and Controls Kit、Ambion WT Expression Kit以及 GeneChip Hybridization，Wash，and Stain Kit，按照標(biāo)準(zhǔn)步驟對總RNA進(jìn)行放大、標(biāo)記及純化，同時獲取標(biāo)記生物素的cDNA。按照Affymetrix表達(dá)譜芯片配套的雜交標(biāo)準(zhǔn)流程在滾動雜交爐GeneChip Hybridization Oven 645中45℃、16 h滾動雜交，雜交完成后再在洗滌工作站GeneChip Fluidics Station 450洗滌，芯片結(jié)果采用GeneChip Scanner 3000 7G進(jìn)行數(shù)據(jù)掃描，進(jìn)一步采用GeneChip GCOS軟件Affymetrix GeneChip Operating Software讀取原始數(shù)據(jù)，各項(xiàng)滿足要求的數(shù)據(jù)采用Expression Console?Software進(jìn)行歸一化處理。低氧和常氧對照樣本均制備3個生物學(xué)重復(fù)，并根據(jù)基因芯片掃描結(jié)果與常氧對照，利用微陣列置信度分析軟件SAM篩選出顯著差異基因。

（四）GO與KEGG Pathway分析

GO全稱為Gene ontology，中文名為基因本體論，主要用于分析差異基因。KEGG全稱為Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，中文名稱為京都基因和基因組百科全書。通過前期篩選出顯著差異基因，將差異基因采用GO及KEGG的方法進(jìn)行分析，篩選出各富集結(jié)果關(guān)鍵基因。

（五）qRT-PCR

使用Trizol試劑盒采用上述方法重新提取RNA，進(jìn)一步按照試劑盒要求反轉(zhuǎn)錄。選用基因芯片中具有顯著性差異的CCL20、IL6及DDIT3共3 個基因進(jìn)行驗(yàn)證，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列如下表1所示。GAPDH為內(nèi)參基因，相關(guān)基因表達(dá)水平采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。

表1 各基因引物序列

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

為了統(tǒng)計(jì)顯著差異的基因，對每個基因以1個統(tǒng)計(jì)量衡量其在相應(yīng)的低氧情況下與常氧條件下之間的相關(guān)程度，然后模擬統(tǒng)計(jì)量在隨機(jī)狀態(tài)下的分布情況，結(jié)合低豐都基因方差的影響及基因間的相關(guān)性，進(jìn)一步通過調(diào)整統(tǒng)計(jì)量的計(jì)算與顯著性評判方法來得到基因的顯著性水平。關(guān)于誤判率的控制，通過調(diào)整多重檢驗(yàn)的P值，通過構(gòu)建一系列離散化拒絕域的方法來計(jì)算Q值并以此進(jìn)行。

在GO和KEGG分析中，采用統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)的方法計(jì)算每個GO條目中差異基因富集的顯著性，按照生物學(xué)過程、細(xì)胞組成以及分子功能3個方面列表注釋。進(jìn)一步通過KEGG數(shù)據(jù)庫，對通路顯著性分析，統(tǒng)計(jì)出各條目基因數(shù)目。以P＜ 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、 差異基因篩選結(jié)果

圖1 表皮細(xì)胞經(jīng)過低氧處理30 min后各RNA相關(guān)表達(dá)基因聚類

采用Clariom D human基因芯片對低氧處理30 min與常氧條件下差異進(jìn)行了分析，通過分析，其mRNA、lncRNA、microRNA以及small RNA聚類結(jié)果如圖1所示。所有圖中顏色反映相對表達(dá)水平，紅色代表高表達(dá)，綠色代表低表達(dá)，從圖中可以看出各樣本均能得到較好的聚類。進(jìn)一步分析顯示，低氧處理0.5 h后，與對照組相比，上調(diào)基因數(shù)目為5 416個，下調(diào)基因數(shù)目為5 060個，其中上、下調(diào)大于1.2倍且P＜ 0.05的基因數(shù)分別為3 866、4 181個，mRNA、lncRNA、microRNA、small RNA以及其他類別上、下調(diào)數(shù)目如表2所示，表達(dá)倍數(shù)排前20的基因如表3所示。從表3中可以看出，上下調(diào)表達(dá)倍數(shù)排前20位的基因中與炎癥及轉(zhuǎn)錄調(diào)控有重要關(guān)系的基因占大多數(shù)。

表2 基因芯片檢測差異基因數(shù)目情況

二、GO及KEGG Pathway分析結(jié)果

對所有差異基因采用GO及KEGG進(jìn)行分析，GO分析結(jié)果顯示，遷移調(diào)控相關(guān)基因、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、炎癥及免疫反應(yīng)等相關(guān)基因具有顯著性差異。因此，GO結(jié)果中反應(yīng)出，短時低氧微環(huán)境在表皮細(xì)胞的遷移運(yùn)動、炎癥等反應(yīng)中起著極其重要的作用。差異表達(dá)基因主要的GO分析結(jié)果如下表4，從各條目富集到的基因情況可以看出，DDIT3、CCL20以及IL6基因出現(xiàn)頻率較高。進(jìn)一步對差異基因進(jìn)行KEGG分析，結(jié)果如表5所示，KEGG結(jié)果顯示TNF、IL-17以及細(xì)胞因子等結(jié)果具有顯著性差異，此外，從表中也反應(yīng)出CCL20、IL6以及DDIT3在低氧條件下表皮細(xì)胞調(diào)控中扮演著重要的作用。綜合GO及KEGG結(jié)果，可以看出DDIT3、CCL20以及IL6基因是低氧條件下表皮細(xì)胞的重要調(diào)控分子，具有重要的研究價值。

三、 芯片結(jié)果驗(yàn)證

采用qRT-PCR技術(shù)對芯片結(jié)果中顯著性差異基因進(jìn)行驗(yàn)證。通過分析表達(dá)倍數(shù)差異發(fā)現(xiàn)，qRT-PCR結(jié)果與基因芯片結(jié)果表達(dá)趨勢一致，結(jié)果如圖2所示。這進(jìn)一步說明基因芯片數(shù)據(jù)的有效性。

表3 上下調(diào)排前10位的基因情況

表4 差異表達(dá)基因主要GO分析結(jié)果

表5 差異基因主要的KEGG分析結(jié)果

圖2 基因芯片與qRT-PCR檢測結(jié)果對比

討 論

表皮細(xì)胞是創(chuàng)面愈合的關(guān)鍵，對其習(xí)性行為的研究對了解創(chuàng)面愈合過程，促進(jìn)創(chuàng)面愈合具有極其重要的意義[10]。在急性創(chuàng)面早期，由于創(chuàng)周細(xì)胞的高氧耗狀態(tài)，使得創(chuàng)面微環(huán)境常處于低氧或缺氧微環(huán)境。大量的研究已經(jīng)顯示，創(chuàng)面低氧微環(huán)境對創(chuàng)面表皮細(xì)胞的習(xí)性起著重要的調(diào)控作用，但具體分子作用機(jī)制尚不清楚。本研究對短時低氧處理前后表皮細(xì)胞HaCaT轉(zhuǎn)錄組表達(dá)差異進(jìn)行了探討。其結(jié)果顯示炎癥、細(xì)胞遷移及轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)基因在低氧微環(huán)境下表皮細(xì)胞的調(diào)控中起著極其重要的促進(jìn)作用。進(jìn)一步GO以及KEGG分析發(fā)現(xiàn)，DDIT3、CCL20以及IL6基因在相關(guān)調(diào)控中起到極其重要的作用。

趨化因子是一種小分子的多肽，與細(xì)胞膜表面上G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合，在各種細(xì)胞調(diào)控及免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用，使細(xì)胞發(fā)生向刺激物方向定向運(yùn)動[11-12]。趨化因子CCL20是β趨化因子家族一員，最早是在巨噬細(xì)胞上清液中發(fā)現(xiàn)，主要表達(dá)于肝、結(jié)腸和皮膚等組織，在皮膚組織中主要存在于角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維等細(xì)胞中[13-14]。已有研究顯示，人外周血單核細(xì)胞在1%O2條件下處理16 h后CCL20呈現(xiàn)高表達(dá)趨勢，且CCL20的轉(zhuǎn)錄受免疫相關(guān)基因IL-6、IL-23等的調(diào)控，它與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[15]；也有報道顯示，CCL20還可以促進(jìn)具有過表達(dá)受體CCR6的HepG2細(xì)胞形成偽足，增強(qiáng)其遷移能力[16]。本研究也通過基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)表皮細(xì)胞中短時低氧促進(jìn)CCL20的表達(dá)，同時也發(fā)現(xiàn)IL-6的高表達(dá)，在芯片數(shù)據(jù)中還發(fā)現(xiàn)細(xì)胞遷移相關(guān)的基因呈現(xiàn)出較高表達(dá)趨勢。課題組前期的研究顯示，低氧條件下表皮細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)[7]。本次基因芯片分析的結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了前期研究，同時也發(fā)現(xiàn)低氧條件下表皮細(xì)胞受IL-6等調(diào)控影響CCL20表達(dá)進(jìn)而調(diào)控表皮細(xì)胞遷移，對創(chuàng)面愈合起著極其重要的作用。

創(chuàng)面表皮細(xì)胞的遷移是創(chuàng)面愈合的一個重要步驟，本研究發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞遷移相關(guān)基因呈現(xiàn)出高表達(dá)趨勢；在課題組前期的研究過程中，采用劃痕實(shí)驗(yàn)及活細(xì)胞工作站實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，在短時低氧條件下表皮細(xì)胞遷移能力明顯增強(qiáng)[7]，結(jié)合本次芯片分析結(jié)果，提示低氧導(dǎo)致的CCL20增高可能是表皮細(xì)胞遷移調(diào)控在創(chuàng)面愈合中發(fā)揮重要作用的關(guān)鍵。在基因芯片結(jié)果中，除IL-6及CCL20呈現(xiàn)出高表達(dá)以外，DNA損傷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子3（DDIT3）呈現(xiàn)出明顯的低表達(dá)，且對低氧條件下表皮細(xì)胞的調(diào)控起著關(guān)鍵的作用。DDIT3是轉(zhuǎn)錄因子C/EBP家族中的一員，在各種如藥物影響等DNA損傷處理中出現(xiàn)高表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、促進(jìn)分化及周期阻滯發(fā)揮作用[17-18]。然而，在本研究中發(fā)現(xiàn)，在短時低氧處理?xiàng)l件下，DDIT3出現(xiàn)明顯低表達(dá)，且DDIT3參與低氧條件下表皮細(xì)胞的關(guān)鍵調(diào)控中。因此推測，DDIT3的低表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞遷移等能力，并進(jìn)一步參與創(chuàng)面愈合過程。

綜上所述，本研究采用基因芯片技術(shù)對低氧微環(huán)境下表皮細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組情況進(jìn)行了分析，其結(jié)果表明，低氧微環(huán)境上調(diào)基因5 416個，下調(diào)基因?yàn)? 060個。進(jìn)一步對低氧及常氧差異表達(dá)基因分析表明，低氧微環(huán)境下除氧化應(yīng)激、炎癥等基因有調(diào)控外，細(xì)胞遷移相關(guān)基因也在低氧微環(huán)境下起重要調(diào)控作用。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，DDIT3、CCL20以及IL6基因在上述調(diào)控通路中有重要作用，提示在低氧微環(huán)境下表皮細(xì)胞調(diào)控中扮演著重要作用。這些基因分子的發(fā)現(xiàn)對于進(jìn)一步闡明皮膚創(chuàng)面愈合機(jī)理，并進(jìn)行有效地干預(yù)、促進(jìn)創(chuàng)面愈合具有重要的意義。