喻娟 彭清華

流行病學資料顯示，青光眼是僅次于白內障，導致視力喪失的第二大原因，也是世界上第二個不可逆轉的失明原因[1]。目前，常用的治療方法是青光眼濾過手術（glaucoma filtering surgery，GFS），其效果主要受房水引流通暢程度的影響。術后纖維瘢痕形成往往是GFS失敗的主要原因[2]。因此，調節(jié)異常結膜傷口修復以防止濾過疤痕已成為預防青光眼的熱點之一。青光眼術后濾過隧道瘢痕形成的本質是人工過濾區(qū)傷口愈合機制的局部表現(xiàn)[3]。在此過程中，人類Tenon成纖維細胞（human Tenon's capsule fibroblasts，HTFs）的激活被認為是傷口修復和瘢痕形成的主要原因[4-5]。轉化生長因子 β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是傷口愈合的重要調節(jié)因子，在GFS后瘢痕形成中起重要作用，已被認為是HTFs轉化為肌成纖維細胞（myofibroblast，MFs）的主要誘導因子[7]。三氧化二坤與兔Tenon's囊成纖維細胞的關系密切[8]。在本研究中，TGF-β1刺激的HTFs被用作細胞模型來研究HTFs活化和增殖的機制及溶液策略。青光安顆粒劑是復方中藥，能讓青光眼患者術后視力、視野及濾過泡形態(tài)均優(yōu)于對照組，并能有效維持較低的眼壓[9]。自噬是一種細胞過程，可以回收受損的細胞器和長壽命蛋白，以維持細胞能量的穩(wěn)態(tài)[10]。自噬參與炎癥，細胞應激，發(fā)育，衰老，癌癥以及細胞成分的內源性和外源性清除。如果自噬不能從細胞中去除細胞內碎片，則細胞凋亡發(fā)生并且組織將被破壞[11]。本研究測試了青光安顆粒劑抑制TGF-β1誘導HTFs增殖和自噬的影響。

材料與方法

一、材料

1.實驗樣本：雄性C57BL/6J小鼠，10周齡，重約25 g，飼養(yǎng)于空調室內，光照周期為12 h、（20±2）℃和50% ～ 60%濕度，飲用水均經過滅菌處理。Tenon的活組織檢查樣本是在標準GFS中獲得的。青光安顆粒按9.18 g/kg劑量灌胃給予青光安顆粒，連續(xù)7 d，1 次 / d。末次灌藥后1 h，頸主動脈取血，分離血清，所取血清經56 ℃，30 min滅活處理后，用0.22 μm的微孔膜過濾除菌，置于20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.試劑：CCK細胞計數(shù)試劑盒、胎牛血清（上海碧云天公司）；Eagle培養(yǎng)基（美國Invitrogen公司）；青霉素、鏈霉素、TGF-β1（美國Sigma公司）；青光安（廈門中藥廠）；流式細胞儀（美國BD公司）；小鼠抗人Beclin-1單克隆抗體、小鼠抗人ATG-5單克隆抗體、小鼠抗人LC-3Ⅲ單克隆抗體（美國Sigma公司）。

二、方法

（一）細胞培養(yǎng)與鑒定

從接受GFS手術的個體獲得人結膜下Tenon膠囊樣品。獲得HTFs作為1 cm×1 cm×1 cm的Tenon膠囊外植體的擴增培養(yǎng)物，并在補充有15%熱滅活胎牛血清Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基中繁殖，培養(yǎng)基中含100 U/ml青霉素和100 μg/ ml鏈霉素，在37 ℃5% CO2濕潤氣氛中。HTFs維持在對數(shù)生長期。第3 ～ 6代的HTFs用于該研究。所有實驗重復至少3次，并計算平均值用于本研究中的分析。制備青光安10倍組血清，5倍組血清，2.5 倍組血清，在100 ng/ml TGF-β1刺激前1 h加入細胞培養(yǎng)基中。將DMSO（0.1%）加入載體對照孔的培養(yǎng)基中。

（二）研究分組與干預

從接受GFS手術的個體獲得人結膜下Tenon膠囊樣品。實驗設計分為3組：對照組（HTFs未經處理，n= 10）；TGF-β1誘導組（100 ng/ml TGF-β1誘導 HTFs，構建 GFS術后細胞模型，n= 10）；TGF-β1+ 青光安治療組（TGF-β1誘導 + 青光安顆粒劑血清處理 HTFs，n= 30）。TGF-β1+ 青光安治療組按照青光安血清的劑量進一步分為3組：TGF-β1+ 青光安高劑量組（TGF-β1誘導 + 青光安顆粒劑血清5 ml處理HTFs）；TGF-β1+青光安中劑量組（TGF-β1誘導+青光安顆粒劑血清2.5 ml處理HTFs）；TGF-β1+青光安低劑量組（TGF-β1誘導+青光安顆粒劑血清處理1 ml HTFs）；每組設10個培養(yǎng)皿。

（三）觀察指標

1.CCK-8分析：通過CCK細胞計數(shù)試劑盒用CCK測定法測定檢查細胞增殖。該測定基于活細胞中線粒體脫氫酶對四唑鹽WST-8的切割。在各種處理后，收獲處于指數(shù)生長期的HTFs，并以1×105個/ ml的密度接種在5個96孔板中，每孔總體積為100 μl。并用指定濃度青光安血清和TGF-β1處理24 h，如本研究中的先前實驗。然后向每個孔中加入10 μl的2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2,4-二磺基）-2H-四唑鎓單鈉鹽WST-8。將板在37 ℃下再溫育4 h。通過使用微孔板分光光度計在490 nm處測量吸光度，并通過與陰性對照比較來歸一化結果，該實驗重復3次。

在不含抗生素的完全培養(yǎng)基中將HTFs細胞接種在密度為4×105個/ml的平板中。24 h后，用含或不含100 ng/ml TGF-β1和含或不含青光安的小鼠的血清替換培養(yǎng)基（不含清光安的小鼠血清即為未經青光安顆粒劑處理的小鼠的血清）。處理24或48 h后收獲細胞。對照HTFs未經處理或僅用Lipofectamine 2000處理。實驗分為對照組、TGF-β1誘導組和TGF-β1+青光安治療組。含藥血清的制備：青光安顆粒劑（10 g·kg-1·d-1）灌胃小鼠給藥，連續(xù)6 d，每日1次，末次給藥后1 h，腹主動脈采血，2 000×g離心 10 min，取血清，56 ℃、30 min 水浴滅活，然后經0.22 μm濾膜抽濾除菌，-80℃保存?zhèn)溆?。本研究已經在湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會報備并獲得批準，動物實驗批準文號2018-0525。

2.定量實時PCR：定量實時PCR用于確定各種處理后HTFs的自噬相關蛋白Beclin-1、自噬相關基因 5（autophagy related gene 5，ATG-5）、微管相關蛋白1-輕鏈3（microtubule associated protein 1 light chain 3，LC-3）基因mRNA水平。使用RISO試劑從HTFs分離總RNA并用DNA酶Ⅰ處理。通過使用oligo-d（T）引物從總RNA逆轉錄酶合成cDNA。使用SYBR Master混合物，用Bio-Rad IQ5實時PCR檢測系統(tǒng)進行定量實時PCR分析。在每個cDNA模板上一式3份進行PCR反應以及管家基因GAPDH的一式3份反應。通過解鏈曲線分析驗證特異性擴增。數(shù)據(jù)針對GAPDH進行標準化。使用ΔΔCT方法（IQ5軟件版本2.0）測定表達水平，并表示為倍數(shù)變化。實驗一式3份進行，每次處理3個生物樣品。（表1）

3.蛋白質印跡：用冰冷的PBS沖洗后，使用含有磷酸酶抑制劑（1 mmol/L釩酸鈉，50 mmol/ L NaF）和蛋白酶的裂解緩沖液（20 mmol/L Tris，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，1%Triton X-100）制備HTFs裂解物。抑制劑（0.1%苯甲基磺酰氟；完全蛋白酶抑制劑，上海羅氏公司）。二辛可寧酸測定用于測定蛋白質濃度。然后，在Laemmli樣品緩沖液中煮沸后，將10 μg蛋白質提取物進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。使用Bio-Rad凝膠印跡裝置將蛋白質轉移到聚偏二氟乙烯膜上。將膜在TBST[10 mmol/L Tris HCl（pH 7.5），150 mmol/ L NaCl，0.1%Tween20]中 的 10%無脂乳中封閉1 h，然后在4 ℃下與一抗（小鼠抗人Beclin-1單克隆抗體、小鼠抗人ATG-5單克隆抗體和小鼠抗人LC-3Ⅲ單克隆抗體；1:1 000）一起溫育過夜。用過氧化物酶偶聯(lián)的二抗（1:5 000）在室溫下保持45 min。在每個溫育步驟后，將膜在TBST中洗滌3 次（每次 10 min）。使用以下抗體：抗 Beclin-1，ATG-5，抗LC-3Ⅲ，抗GADPH。通過化學發(fā)光揭示過氧化物酶，并通過暴露于X射線膠片顯現(xiàn)過氧化物酶。

表1 RT-PCR引物序列

4.流式細胞儀：青光安血清培養(yǎng)并用TGF-β2處理48 h后，通過流式細胞術檢查細胞周期。通過胰蛋白酶消化收集HTFs并用PBS洗滌2次，然后以1×106個/ml重懸于PBS中，并在4℃下在70%冰冷的乙醇（v/v）中固定過夜。固定的細胞用0.5 ml碘化丙錠/RNase染色緩沖液在黑暗中于4℃染色30 min。使用流式細胞儀分析G0/G1，S和G2/M級分的細胞數(shù)。根據(jù)PI =（G2/M+S）/（G0/G1+S+G2/M）計算增殖指數(shù)。

5.Cyto-ID免疫細胞化學染色：通過Cyto-ID免疫細胞化學染色測定青光安顆粒劑對HTFs細胞自噬的影響。（1）載玻片防脫片劑處理：可選擇APES或 Poly-Lysine。撈片后置烤箱58 ～ 60 ℃，30 ～60 min以使切片緊密黏附；（2）切片脫蠟，水洗；（3）必要時根據(jù)抗原情況對切片進行微波修復抗原或酶消化處理。蒸餾水洗2 min×3 次；（4）滴加正常血清封閉液，室溫10 min；（5）滴加適當稀釋的一抗（小鼠抗人Beclin-1單克隆抗體、小鼠抗人ATG-5單克隆抗體和小鼠抗人LC-3Ⅲ單克隆抗體），20 ～ 37℃1 ～ 2 h 或 4℃過夜。PBS 洗 2 min×3 次；（6）滴加的和一抗相對應的生物素化二抗，20 ～ 37℃ 30 min。PBS洗2 min×3 次；（7）滴加熒光素標記的ABC，20 ～ 37℃ 30 min。PBS 洗 5 min×4 次；（8）水溶性封片劑封片。熒光顯微鏡觀察。

三、統(tǒng)計學分析方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計分析軟件。HTFs的活力、細胞周期、自噬陽性細胞數(shù)目、自噬相關基因mRNA的表達、自噬相關蛋白的水平用表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數(shù)資料采用百分率（%）表示，組間比較采用c2分析，以P＜ 0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、青光安對TGF-β1誘導的HTFs激活和增殖的影響

CCK-8檢測結果顯示，細胞生長顯示外源TGF-β1可為HTFs提供生長優(yōu)勢，與對照組相比，TGF-β1誘導組導致HTFs細胞的增殖能力增加（P＜0.05），培養(yǎng)基中加入不同劑量的青光安含藥血清后，HTFs細胞的增殖能力降低（P＜ 0.05），TGF-β1+青光安高劑量組細胞增殖水平降低最為明顯（表2）。

表2 青光安顆粒劑抑制HTFs的活力（±s）

表2 青光安顆粒劑抑制HTFs的活力（±s）

注：與對照組比較，aP ＜ 0.05；與 TGF-β1 誘導組比較，bP ＜ 0.05

分組 細胞培養(yǎng)皿數(shù)量 增殖能力對照組 10 12.85±1.13 TGF-β1 誘導組 10 23.42±1.25a TGF-β1+青光安低劑量組 10 19.47±1.14b TGF-β1+青光安中劑量組 10 16.38±1.07b TGF-β1+青光安高劑量組 10 13.52±1.24b F值 12.347 P值 ＜ 0.01

二、TGF-β1和青光安治療對HTFs細胞周期的影響

通過流式細胞術評估青光安對細胞周期的影響。TGF-β1誘導組G0/G1期HTFs百分比低于對照組（P＜ 0.05），TGF-β1+ 青光安治療組高于TGF-β1 誘導組（P＜ 0.05）。 相反，TGF-β1 誘導組中S期HTFs百分比較對照組增加（P＜ 0.05），TGF-β1+ 青光安治療組低于 TGF-β1 誘導組（P＜0.05）。TGF-β1誘導組與對照組和TGF-β1+ 青光安治療組在G2/M期差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（表3）

三、青光安顆粒劑對HTFs細胞自噬的影響

通過Cyto-ID免疫細胞化學染色測定青光安顆粒劑對HTFs細胞自噬的影響。對照HTFs在細胞質中表現(xiàn)出弱的綠色點狀染色。在用TGF-β1處理后，在細胞中顯示出增強的HTFs細胞自噬（P＜0.05）。與 TGF-β1 誘導組相比，用 TGF-β1+ 青光安治療組導致熒光染色強度降低，HTFs陽性細胞數(shù)目減少（P＜0.05）。（圖1，表4）

表3 TGF-β1和青光安治療對HTFs細胞周期的影響（%，±s）

表3 TGF-β1和青光安治療對HTFs細胞周期的影響（%，±s）

注：與對照組比較，aP ＜ 0.05；與 TGF-β1 誘導組比較，bP ＜ 0.05

分組 細胞培養(yǎng)皿數(shù)量 G0/G1期 S 期 G2/M期對照組 10 94.92 ±1.63 1.61 ±0.72 3.47 ±1.11 TGF-β1 誘導組 10 88.29 ±0.35a 9.04 ±0.25a 2.67 ±0.15 TGF-β1+ 青光安治療組 30 91.18 ±1.04b 5.41 ±0.59b 3.41 ±0.53 F 值 15.374 13.857 18.263 P 值 0.012 0.007 0.432

圖1 熒光顯微鏡下觀察Cyto-ID免疫細胞化學SP染色結果（×400）

表4 青光安顆粒劑對HTFs細胞自噬的影響（±s）

表4 青光安顆粒劑對HTFs細胞自噬的影響（±s）

注：與對照組比較，aP ＜ 0.05；與 TGF-β1 誘導組比較，bP ＜ 0.05

分組 細胞培養(yǎng)皿數(shù)量 熒光強度 陽性細胞數(shù)目對照組 10 1.37±0.15 83.46±10.78 TGF-β1 誘導組 10 4.64±0.25a 180.54±20.37a TGF-β1+ 青光安治療組 30 1.84±0.14b 112.46±12.11b F值 12.375 18.472 P值 0.001 0.004

四、青光安顆粒劑增加自噬相關基因mRNA的表達水平

使用qRT-PCR分析測定HTFs中Beclin-1、ATG-5和LC-3Ⅲ的基因表達水平。結果顯示，TGF-β1處理后，自噬相關基因表達均降低。而TGF-β1+青光安治療組逆轉TGF-β1處理對自噬基因表達水平的影響，與TGF-β1組相比，自噬相關基因均升高（P＜ 0.05）。（圖2，表5）

五、青光安顆粒劑增加自噬相關蛋白的水平

使用Western印跡分析測定HTFs中Beclin-1、ATG-5和LC-3Ⅲ的蛋白質水平。結果顯示，TGF-β1處理后，自噬相關蛋白均降低。而與TGF-β1組相比，TGF-β1+ 青光安治療組 Beclin-1、ATG-5和LC-3Ⅲ的蛋白質水平分別降低48.73%、30.3%和30.93%（P＜ 0.05）。（表6，圖3）

圖2 自噬相關基因mRNA的表達水平

表5 自噬相關基因mRNA的表達水平（±s）

表5 自噬相關基因mRNA的表達水平（±s）

注：與對照組比較，aP ＜ 0.05；與 TGF-β1 誘導組比較，bP ＜ 0.05

分組 細胞培養(yǎng)皿數(shù)量 Beclin-1 ATG-5 LC-3Ⅲ對照組 10 5.43±0.97 8.24±1.03 6.43±0.85 TGF-β1 誘導組 10 2.25±0.54a 4.32±0.69a 3.54±0.96a TGF-β1+ 青光安治療組 30 4.97±0.68b 7.36±0.85b 5.83±0.25b F值 9.654 16.866 17.675 P 值 ＜ 0.01 ＜ 0.01 ＜ 0.01

表6 HTFs中自噬相關基因表達量（±s）

表6 HTFs中自噬相關基因表達量（±s）

注：與對照組比較，aP ＜ 0.05；與 TGF-β1 誘導組比較，bP ＜ 0.05

分組 細胞培養(yǎng)皿數(shù)量 Beclin-1 ATG-5 LC-3Ⅲ對照組 10 2.36±0.25 0.87±0.06 1.84±0.24 TGF-β1 誘導組 10 3.47±0.38a 1.32±0.11a 2.78±0.21a TGF-β1+ 青光安治療組 30 1.78±0.04b 0.92±0.15b 1.92±0.34b F值 17.368 14.582 13.264 P值 ＜ 0.01 ＜ 0.01 ＜ 0.01

圖3 免疫印跡分析Beclin-1、ATG-5和LC-3Ⅲ蛋白的表達量

討 論

青光眼是一種進行性視神經病變，已經假定幾種因素在青光眼中起作用，包括缺血性興奮性毒性，神經營養(yǎng)不足和眼內壓升高[3]。HTFs向肌成纖維細胞的轉分化在傷口愈合過程中起主要作用。在這個過程中，細胞被激活并表達豐富的ECM蛋白和生長因子，這些在傷口愈合中是必不可少的[12]。肌成纖維細胞的持續(xù)發(fā)生可能與術后瘢痕形成和GFS失敗有關。減少HTFs向肌成纖維細胞的轉分化可以改善GFS的長期效果。本研究獲得了HTFs作為人類Tenon外植體的擴增培養(yǎng)物，然后評估青光安對HTFs細胞增殖和自噬的影響。

GFS后的瘢痕形成與傷口修復期間結締組織的產生一致。TGF-β1是傷口愈合的重要調節(jié)因子，也是血管纖維化過程中的關鍵調節(jié)劑[14]。在GFS后瘢痕形成中起重要作用，已被認為是HTFs轉化為MFs的主要誘導因子[8-9]。本研究TGF-β1刺激HTFs被用作細胞模型來研究HTFs活化和增殖的機制和溶液策略。細胞周期分析顯示青光安治療處理導致G0/G1期的比例增加，而S期的比例降低。通過CCK-8測定也檢測到HTFs活力的降低。這些結果表明，青光安治療可誘導HTFs細胞周期停滯于G0/G1期，可能阻止其DNA合成，這可能是HTFs中青光安治療后抑制細胞增殖的機制。

近年來，青光安的抗炎，免疫調節(jié)和抗纖維化作用也有報道[16-18]。研究表明，青光安顆粒劑在視網膜色素上皮和角膜纖維化的調節(jié)中起重要作用[19-20]。在之前的研究中，證明了青光安能夠減弱TGF-β1誘導的 α-SMA，CTGF和COL I轉錄的上調，以及影響HTFs的蛋白質表達，增殖和遷移而沒有毒性；自噬在生理衰老以及HTFs的病理學中起重要作用。自噬的生理水平對于維持細胞穩(wěn)態(tài)是必需的，并且在各種應激條件期間迅速上調。自噬途徑的功能障礙，尤其是衰老，通常會促進人類疾病和一些神經退行性疾病[7,12]。矛盾的是，盡管主要具有促存活作用，但神經組織自噬在神經保護以及神經元損傷和死亡中起著重要作用，這取決于生理和病理環(huán)境[7]。自噬體是雙膜結構，其中細胞質材料在自噬期間被包圍。這些自噬體與溶酶體融合形成自溶酶體，細胞質物質被降解。Beclin-1、ATG-5和LC3-Ⅲ是自噬過程中參與自噬體形成的必需蛋白質。筆者認為，自噬強弱和Beclin-1、ATG-5和LC-3Ⅲ表達量的關系成正相關。青光安顆粒在HTFs自噬中的作用尚未闡明，需要進一步實驗證實。

本研究發(fā)現(xiàn)，青光安顆粒劑增加了Beclin-1、ATG-5、LC3-Ⅲ mRNA和蛋白質的表達，青光安顆粒劑抑制TGF-β1誘導的HTFs增殖，且可能機制為青光安誘導HTFs細胞周期停滯于G0/G1期，而且青光安可減少TGF-β1誘導的HTFs自噬。