張彥 萬(wàn)佳

再生障礙性貧血為血液系統(tǒng)重癥疾病之一，其因獲得性骨髓造血功能衰竭，致機(jī)體全血細(xì)胞減少，主要以紅細(xì)胞、粒細(xì)胞和血小板減少所引起的貧血、感染和出血為特征。再生障礙性貧血臨床預(yù)后較差，多數(shù)患者死于感染或者出血等并發(fā)癥，尤其是重型再生障礙性貧血患者[1]。研究發(fā)現(xiàn)，采用常規(guī)治療再生障礙性貧血的效果不佳，強(qiáng)化免疫抑制治療，雖然再生障礙性貧血的緩解率顯著上升，但仍有30%左右患者治療無(wú)效，甚至死亡[2]。近年研究發(fā)現(xiàn)，異基因造血干細(xì)胞移植術(shù)治療重型再生障礙性貧血的效果較好，可有效恢復(fù)患者造血功能，降低患者病死率，但術(shù)后發(fā)生感染的風(fēng)險(xiǎn)仍較高，嚴(yán)重影響移植的治療效果[3]。研究發(fā)現(xiàn)，再生障礙性貧血患者伴有不同程度免疫功能缺陷[4]。而重型再生障礙性貧血患者異基因造血干細(xì)胞移植發(fā)生感染后，進(jìn)一步影響機(jī)體免疫功能，有學(xué)者認(rèn)為，免疫功能紊亂與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，包括BCL-2蛋白、BAX蛋白、caspase蛋白等被激活，表達(dá)上調(diào)有關(guān)[5]。因此，探究T細(xì)胞計(jì)數(shù)、BCL-2、BAX蛋白表達(dá)在重型再生障礙性貧血患者異基因造血干細(xì)胞移植術(shù)后感染患者表達(dá)及意義，為臨床了解細(xì)胞免疫與細(xì)胞凋亡間的關(guān)系提供一定的理論依據(jù)。具體報(bào)道如下。

資料與方法

一、臨床資料

本次研究經(jīng)過(guò)西南醫(yī)院倫理委員會(huì)審批。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合《再生障礙性貧血診斷治療專家共識(shí)（2010年版）》[6]中重型再生障礙性貧血診斷標(biāo)準(zhǔn)（需至少滿足以下其中2項(xiàng)指標(biāo)：網(wǎng)織紅細(xì)胞＜ 1%，絕對(duì)計(jì)數(shù)＜ 15×109個(gè)/L；中性粒細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)＜0.5×109個(gè)/L；血小板 ＜ 20×109個(gè)/L）；（2）無(wú)其他血液系統(tǒng)及免疫疾?。唬?）入組者均簽訂知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）入組前1周服用皮質(zhì)類固醇激素、免疫抑制劑；（2）拒絕入組研究者。根據(jù)納入排除標(biāo)準(zhǔn)，選擇西南醫(yī)院2014年1月至2018年1月收治的52例重型再生障礙性貧血異基因造血干細(xì)胞移植患者作為研究對(duì)象，依據(jù)干細(xì)胞移植是否發(fā)生感染（診斷標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)后1個(gè)月內(nèi)發(fā)生的各種感染；有明確感染病灶；感染相關(guān)部位微生物培養(yǎng)陽(yáng)性；患者至少有以下一種癥狀或體征；反復(fù)發(fā)熱（體溫 ＞38.5℃或持續(xù)時(shí)間超過(guò)24 h、寒戰(zhàn)）分為未發(fā)生感染組（32例）、感染組（20例）。兩組研究中一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05，表1）。

表1 再生障礙性貧血患者的一般資料

二、方法

1.干細(xì)胞移植方法：兩組患者入院后均完善相關(guān)檢查，明確干細(xì)胞移植適應(yīng)癥及禁忌癥；預(yù)處理：予以兔抗人胸腺細(xì)胞球蛋白+氟達(dá)拉濱（30 mg/ m2，連用5 d）+環(huán)磷酰胺[60 mg/（kg·d），連用2 d]；移植物抗宿主病預(yù)防：全相合移植患者予以環(huán)孢素A+短程甲氨蝶呤；造血干細(xì)胞動(dòng)員、采集及回輸：供者予以粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）300 μg/d，皮下注射，連用4 d，第5天采集供者骨髓并回輸，次日使用COBE血細(xì)胞單采機(jī)分離供者外周血干細(xì)胞后回輸；并發(fā)癥預(yù)防：移植前2周靜滴更昔洛韋預(yù)防巨細(xì)胞病毒感染，清開(kāi)靈、丹參及保肝藥物預(yù)防肝靜脈阻塞綜合征，口服復(fù)方新諾明預(yù)防“卡氏肺孢子病”，移植前1 d開(kāi)始預(yù)防性抗感染治療，移植后白細(xì)胞最低期口服伏立康唑片，移植后7 ～ 10 d白細(xì)胞極低期聯(lián)合給予靜脈用丙種球蛋白，移植后定期監(jiān)測(cè)巨細(xì)胞病毒復(fù)制及病原菌培養(yǎng)，積極靜脈營(yíng)養(yǎng)、抗感染和支持對(duì)癥治療。

2.T細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)：收集入組者清晨空腹靜脈血5 ml，肝素抗凝，6 h內(nèi)完成淋巴細(xì)胞表型分析；采用流式細(xì)胞儀（FACScalibur型，美國(guó)Becton Dickinson公司）對(duì)T淋巴細(xì)胞亞群進(jìn)行檢測(cè)，流式抗體標(biāo)記樣本、檢測(cè)步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，計(jì)數(shù)成熟T淋巴細(xì)胞亞群所占細(xì)胞數(shù)百分比，總淋巴細(xì)胞（CD3+）、T 輔助細(xì)胞亞群（CD4+）、T 抑制細(xì)胞亞群（CD8+），以及T輔助細(xì)胞/T抑制細(xì)胞比值（CD4+/ CD8+）。流式細(xì)胞檢測(cè)的配套試劑盒（Becton Dickinson公司）。

3.BCL-2、BAX蛋白表達(dá)檢測(cè)：采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)BCL-2、BAX蛋白表達(dá)情況；收集入組者清晨空腹靜脈血5 ml，9 000×g離心10 min后獲得血清，放入-20℃條件下保存；取血清樣本，在37 ℃條件下孵育2 h，加入BCL-2、BAX抗體，在37 ℃條件下孵育2 h，再加入底物液，在37 ℃條件下孵育30 min，測(cè)定OD值。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒由Ogema公司提供，操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)執(zhí)行。

4.隨訪：采用電話、門診對(duì)入組患者進(jìn)行隨訪，隨訪時(shí)間為12個(gè)月，記錄兩組患者生存情況。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

采用SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，性別、移植術(shù)后感染發(fā)生情況采用[n（%）]表示，用c2檢驗(yàn)比較差異；年齡、身體質(zhì)量指數(shù)、CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、BCL-2、BAX、BCL-2/BAX 采用表示，采用卡方檢驗(yàn)比較兩組患者生存率；采用Pearson 相關(guān)性檢驗(yàn)分析CD4+/CD8+值與BCL-2/BAX 值相關(guān)性。符合正態(tài)分布計(jì)量資料，比較采用t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布計(jì)量資料采用秩和檢驗(yàn)，以P＜ 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.異基因造血干細(xì)胞移植后感染與移植類型之間的關(guān)系：人組織相容性抗原配型：全相合31例，其中12例（38.71%）發(fā)生感染；不全相合21例，其中8例（38.10%）發(fā)生感染，不同人組織相容性抗原配型干細(xì)胞移植術(shù)后感染發(fā)生率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（c2= 1.3064，P= 0.3427）。供者來(lái)源：同胞間移植39例，其中14例（35.90%）發(fā)生感染；供者為父母單倍型移植11例，其中5例（48.45%）發(fā)生感染；中國(guó)骨髓庫(kù)提供非血緣全相合移植2例，其中1例（50.00%）發(fā)生感染；不同供者來(lái)源干細(xì)胞移植術(shù)后感染發(fā)生率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)（c2=2.4625，P= 0.0722）。兩組患者干細(xì)胞移植術(shù)后均為發(fā)生移植物抗宿主反應(yīng)。

2.兩組患者外周血T細(xì)胞亞群檢測(cè)情況：未感染組患者外周血CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平高于感染組，CD8+水平低于感染組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05，表2）。

3.兩組患者BCL-2、BAX蛋白表達(dá)情況：未感染組患者外周血BCL-2蛋白表達(dá)水平及BCL-2/ BAX值高于感染組，BAX蛋白表達(dá)水平低于感染組，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表3）。

4.CD4+/CD8+值與BCL-2/BAX值的相關(guān)性：采用Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)分析CD4+/CD8+值與BCL-2/BAX值相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重型再生障礙性貧血患者異基因造血干細(xì)胞移植后CD4+/CD8+值與BCL-2/BAX 值呈現(xiàn)正相關(guān)（r= 0.620，P＜ 0.001，圖1）。

表2 兩組SAA患者外周血T細(xì)胞亞群檢測(cè)情況（±s，個(gè)/μl）

表2 兩組SAA患者外周血T細(xì)胞亞群檢測(cè)情況（±s，個(gè)/μl）

分組 例數(shù) CD3+ CD4+ CD8+ CD4+/CD8+未感染組 32 79.09±15.40 128.78±24.36 74.17±5.48 1.68±0.15感染組 20 57.62±10.36 86.17±11.22 76.79±4.36 1.15±0.10 t 值 5.107 3.626 3.260 8.311 P值 0.009 0.024 0.031 ＜0.001

表3 兩組SAA患者BCL-2、BAX蛋白表達(dá)情況（±s）

表3 兩組SAA患者BCL-2、BAX蛋白表達(dá)情況（±s）

分組 例數(shù) BCL-2 BAX BCL-2/BAX未感染組 32 0.48±0.10 0.33±0.04 1.07±0.06感染組 20 0.34±0.07 0.41±0.12 0.83±0.04 t 值 5.394 4.605 6.032 P值 0.008 0.013 0.005

5.隨訪結(jié)果：對(duì)入組患者隨訪6 ～ 12個(gè)月（本次研究因前期納入患者臨床資料收集不全，所納入病例數(shù)僅有23例隨訪時(shí)間超過(guò)1年，因而界定隨訪時(shí)間為1年）；非感染組患者1年生存率為90.63%（29/32），感染組患者1年生存率為50.00%（10/20），兩組患者生存率比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（c2=6.2184，P= 0.0064）。生存曲線圖見(jiàn)圖2。

圖1 重型再生障礙性貧血CD4+/CD8+值與BCL-2/BAX值的相關(guān)性

圖2 兩組患者1年隨訪生存情況

討 論

重型再生障礙性貧血是一種由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的、損傷骨髓的疾病。既往研究認(rèn)為，再生障礙性貧血是由不明原因，如氯霉素、放射線和病毒感染等，引起的造血功能衰竭[7]。隨著免疫學(xué)、分子生物學(xué)的發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)[8-10]，再生障礙性貧血的發(fā)病機(jī)制與造血干細(xì)胞功能喪失密切相關(guān)，導(dǎo)致患者骨髓的總體集落形成能力下降；由多種致病因素導(dǎo)致造血微環(huán)境功能缺陷，損傷造血干（祖）細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞受損；再生障礙性貧血患者多伴有免疫功能異常，機(jī)體免疫異常，可損傷造血干細(xì)胞，并占著主導(dǎo)作用；遺傳因素，部分再生障礙性貧血患者對(duì)于某些致病因素的敏感性較高，進(jìn)而增加再生障礙性貧血發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。

目前臨床中再生障礙性貧血的治療主要包括支持治療、病因治療，支持治療主要以預(yù)防和治療血細(xì)胞減少所引起的并發(fā)癥為目的；病因治療主要以補(bǔ)充和替代數(shù)量減少和受損的造血干細(xì)胞為目的，避免損害進(jìn)一步加重，盡可能恢復(fù)受損的造血干細(xì)胞功能，如異基因造血干細(xì)胞移植、免疫抑制治療等[11-12]。異基因造血干細(xì)胞移植是在大劑量放化療處理基礎(chǔ)上，清除患者體內(nèi)腫瘤或異常細(xì)胞后，將異基因造血干細(xì)胞移植給患者，重建患者正常造血及免疫系統(tǒng)。目前異基因造血干細(xì)胞移植是治療重型再生障礙性貧血的主要策略之一，不僅可延長(zhǎng)患者生存期，且治療反應(yīng)穩(wěn)定，克隆性疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)低，患者生活質(zhì)量顯著提高[13-14]。但是重型再生障礙性貧血患者異基因造血干細(xì)胞移植后伴有繼發(fā)感染風(fēng)險(xiǎn)，不僅影響治療效果，同時(shí)影響患者機(jī)體免疫功能，嚴(yán)重者可死亡[15]。本次研究結(jié)果顯示，入組52 例重型再生障礙性患者，異基因造血干細(xì)胞移植術(shù)后感染發(fā)生率為38.46%，術(shù)后感染發(fā)生率較高，并且影響患者生存期。另外，在干細(xì)胞移植過(guò)程中應(yīng)用抗生素，不僅可降低感染發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)利于移植后患者免疫功能恢復(fù)。干細(xì)胞移植后并發(fā)感染具有一定特殊性及復(fù)雜性，其臨床表現(xiàn)不典型，病原菌培養(yǎng)陽(yáng)性率低，感染病灶不明確，但并發(fā)感染患者病情進(jìn)展速度快、病死率高，因此，降低患者異基因造血干細(xì)胞移植術(shù)后感染發(fā)生率，具有重要意義。

T淋巴細(xì)胞包括T輔助細(xì)胞亞群（CD4+）、T抑制細(xì)胞亞群（CD8+），正常情況下，機(jī)體T淋巴細(xì)胞總數(shù)CD3+/CD4+值較為穩(wěn)定，當(dāng)T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量及比值出現(xiàn)變化時(shí)，提示機(jī)體免疫功能出現(xiàn)紊亂。通過(guò)檢測(cè)外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞，可反映機(jī)體免疫功能，進(jìn)而對(duì)機(jī)體感染進(jìn)行輔助診斷[16]。黎偉超等[17]研究發(fā)現(xiàn)，CD4+、CD4+/ CD8+值降低，與惡性腫瘤的發(fā)生、病毒感染密切相關(guān)，CD8+參與機(jī)體細(xì)菌及病毒的清除，其水平升高，提示機(jī)體存在細(xì)菌或真菌感染。本次研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未感染組患者外周血CD3+、CD4+、CD4+/ CD8+水平高于感染組，CD8+水平低于感染組，結(jié)果說(shuō)明異基因造血干細(xì)胞移植術(shù)后發(fā)生感染，進(jìn)一步損傷免疫功能，進(jìn)而影響患者術(shù)后造血功能的重建。

研究發(fā)現(xiàn)[18]，BCL-2蛋白可抑制細(xì)胞程序性死亡，參與細(xì)胞線粒體、核孔復(fù)合體信號(hào)的傳遞；并且能夠改變線粒體外模通透性，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡因子的釋放；另外，BCL-2還可影響鈉鉀泵功能，減少因輻射所引起的細(xì)胞凋亡。BAX蛋白為一種促凋亡蛋白，為BCL-2蛋白家族中成員之一，其可過(guò)度表達(dá)拮抗BCL-2的保護(hù)作用，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[19]。Vervloessem等[20]研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞的凋亡與BCL-2/ BAX值密切相關(guān)，BCL-2/BAX值升高，提示細(xì)胞凋亡受到抑制。本次研究發(fā)現(xiàn)，未感染組患者外周血BCL-2蛋白表達(dá)水平及BCL-2/BAX值高于感染組，BAX蛋白表達(dá)水平低于感染組，Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)重型再生障礙性貧血患者異基因造血干細(xì)胞移植后CD4+/CD8+值與BCL-2/BAX值呈現(xiàn)正相關(guān)；結(jié)果說(shuō)明，異基因造血干細(xì)胞移植術(shù)后感染可能參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)，加速免疫細(xì)胞凋亡。

綜上所述，重型再生障礙性貧血異基因造血干細(xì)胞移植術(shù)后發(fā)生感染，導(dǎo)致患者免疫功能異常，可能與細(xì)胞凋亡蛋白BCL-2表達(dá)上調(diào)有關(guān)，且術(shù)后發(fā)生感染顯著縮短患者生存期，因此，可通過(guò)評(píng)估SAA患者T細(xì)胞水平，BCL-2、BAX蛋白表達(dá)情況，評(píng)估患者預(yù)后。但本次研究主要回顧性分析臨床資料，關(guān)于免疫功能與BCL-2、BAX蛋白間的關(guān)系尚不明確，需后續(xù)進(jìn)一步研究證實(shí)。