王萍 張增利 馬予潔 路君 趙虎 王水良 譚建明 李冰燕

卵巢癌致死率在女性疾病中處于領先地位。上皮性卵巢癌約占所有類型卵巢癌的90%[1]并且在癌細胞已經轉移到其他器官的晚期階段才被診斷出來[2]。比如，卵巢癌只占所有女性癌癥的2.5%，但是在女性癌癥死亡率中卻占了5%，其表明卵巢癌5年生存率很低[2]。然而，如果早期確診，5年生存率將會達到93%[3]。因此，早期腫瘤診斷和有效預后預測是提高卵巢癌患者生存的關鍵。為此，之前有研究已經評估了生物標記物以便及早診斷這種致命的疾病并預測生存或治療效果，或針對生物標記基因開發(fā)新的卵巢癌治療靶點[2]。有一些研究也分析粘液性和透明卵巢細胞癌之間，低級別與低惡性潛能和高級別轉移性卵巢癌之間的差異基因表達模式[2-4]。有報道發(fā)現(xiàn)基因或基因表達的改變與卵巢癌的早期診斷或風險評估的生物標志物相關聯(lián)[5-6]。然而，迄今為止，沒有可用于此目的有用（可靠）的分子及臨床標記物[7]。目前使用基因表達譜尋找差異基因的方法多是比較卵巢癌與正常組織差異，這會導致獲取數(shù)據有限。早期前驅病變和卵巢癌之間的差異基因表達譜可用于卵巢癌的早期診斷、預測預后，并為治療靶標的生物標志物提供新的見解。

本文根據Gamwell等[8]描述的方法建立并鑒定了小鼠上皮卵巢癌進展的體外細胞模型。該細胞模型是從小鼠卵巢中分離卵巢表面上皮細胞（mouse ovarian surface epithelial cells，MOSECs）并在體外連續(xù)培養(yǎng)。這些MOSECs在體外可以發(fā)生自發(fā)的惡性轉化形成上皮卵巢癌細胞。在體外細胞培養(yǎng)和傳代期間，MOSECs顯示出形態(tài)變化和基因表達改變[8-11]，這可能是模擬人卵巢癌發(fā)生的良好體外細胞模型。先前的研究表明，自發(fā)轉化的MOSECs具有HGSC腫瘤細胞所有特征。同時MOSE-I細胞具備癌前良性腫瘤所有特質，而MOSE-II細胞是惡性轉化細胞[10]。

材料與方法

一、試劑與儀器

本研究的動物方案經福州總醫(yī)院動物倫理委員會批準，并遵循美國國立衛(wèi)生研究院的監(jiān)管動物護理指南。實驗動物（上海斯萊克實驗動物有限公司），所述DMEM F12培養(yǎng)基（美國Thermo-Fisher Scientific 公司），4%熱滅活的胎牛血清（美國Gibco公司）。慶大霉素，青霉素和鏈霉素溶液（美國Invitrogen公司），EVOS XL成像系統(tǒng)（美國Thermo-Fisher Scientific 公司）。

二、方法

（一）分離與培養(yǎng)MOSECs

根據Gamwell等[8]和McCloskey等[10]描述的方案，分離MOSECs并在“MOSE培養(yǎng)基”中培養(yǎng)它們，所述培養(yǎng)基來自Thermo-Fisher Scientific Company的DMEM F12培養(yǎng)基，補充有4%熱滅活的胎牛血清，5 U/ml青霉素和5 μg/ml鏈霉素溶液，0.1 μg/ml慶大霉素，在 37 ℃，5%CO2下培養(yǎng)。根據先前的研究[9]，具有自發(fā)惡性轉化表型的MOSECs維持在MOSE培養(yǎng)基中，其會經歷2個階段，即早期階段（MOSE-Ⅰ；正常上皮細胞）和晚期階段（MOSE-Ⅱ；卵巢癌細胞的各種表型）。

（二）MOSE-I和MOSE-II細胞的培養(yǎng)和特征鑒定

為了誘導MOSECs的自發(fā)惡性轉化，本研究在MOSECs培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)和傳代原代MOSECs。小于35代的MOSECs細胞命名為MOSE-Ⅰ細胞，MOSE-Ⅰ繼續(xù)培養(yǎng)超過35代命名為MOSE-Ⅱ細胞。使用0.05%胰蛋白酶消化并傳代細胞，用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）洗滌，制備單細胞懸液，然后將100個細胞接種到35 mm細胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)14 d。然后使用結晶紫染色，拍照，計數(shù)。在軟瓊脂測定中，在60 mm細胞培養(yǎng)皿中1 : 1混合2×Ham's F-12：MOSE培養(yǎng)基與瓊脂糖制備基層瓊脂。然后將細胞懸浮液（2.5×104）與超純LMP瓊脂糖在37 ℃下混合，然后將其倒入瓊脂基層頂部，并在37 ℃下孵育14 d。使用EVOS XL成像系統(tǒng)拍攝細胞克隆，并使用Image J軟件定量。

（三）新一代測序技術檢測MOSE-Ⅰ和MOSE-Ⅱ細胞之間差異表達基因

為了分析MOSE-Ⅰ和MOSE-Ⅱ細胞之間差異表達的基因，對MOSE-Ⅰ和MOSE-Ⅱ細胞進行了新一代測序。根據測序商的方案，使用Trizol Reagent從MOSE-Ⅰ和MOSE-Ⅱ細胞中分離提取總細胞RNA。在RNA定量和逆轉錄成cDNA后，本研究使用Illumina TruSeq文庫制備每種細胞類型的cDNA文庫，然后使用Illumina HiSeq 2000 NGS平臺對MOSE-Ⅰ和MOSE-Ⅱ細胞之間的差異表達基因進行新一代測序。GEPIA是一個網絡工具（http://gepia.cancer-pku.cn/），用于分析腫瘤和非腫瘤組織之間的基因表達，并提供交互式數(shù)據分析。本研究利用這個在線工具分析卵巢癌標本和正常對照之間四種選定顯著差異表達基因（different expression genes，DEGs）（即 GMPS，PR，CD40和p21）的水平。

（四）進行生物信息學分析，構建成蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡

使用GO分析對這些DEGs進行生物信息學分析，以注釋這些DEGs的獨特生物學功能。然后再使用KEGG數(shù)據庫進一步分析了它們參與的信號通路。使用Fisher檢驗生成GO術語和信號轉導途徑，并使用P值與錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）進行統(tǒng)計學校正。在使用GO術語和KEGG數(shù)據庫對這些DEGs進行生物信息學分析后，根據先前的報告使用STRING將這些DEGs構建到PPI網絡中[12]。該網絡資源包含用于全面預測已知蛋白質與蛋白質相互作用的生物學數(shù)據庫。將DEGs上傳到STRING數(shù)據庫，然后網站為這些DEGs生成PPI。本研究使用P＜ 0.05的組合分數(shù)作為截止標準，以識別任何給定的蛋白質與另一個蛋白質相互作用，然后根據Saito等[13]之前的研究將這個PPI導入Cytoscape軟件，從而進一步構建PPI網絡，其中通過計算連接到其他蛋白質與非連接蛋白質的程度來揭示中樞節(jié)點（具有重要生物學功能的關鍵蛋白質）。

（五）TCGA數(shù)據庫和cBioPortal

TCGA數(shù)據庫用于存儲30種不同人類癌癥的差異表達基因和臨床病理學數(shù)據[14]。本研究檢索了浸潤卵巢癌數(shù)據集，其中包括606例卵巢癌與311例正常組織的DEGs數(shù)據。然后，將DEGs數(shù)據放入 cBioPortal（www.cbioportal.org），這是一個幫助探索，可視化和分析DEG數(shù)據的Web資源。根據cBioPortal的在線說明計算這些DEGs對總生存期（OS）和無病生存期（DFS）的貢獻。此外，根據之前的研究，使用Kaplan-Meier Plotter在線工具（www.kmplot.com）生成了 GMPS，PR，Cd40和p21 mRNA水平表達并分析其卵巢癌患者的Kaplan-Meier曲線[15]。該網站包括4 142例卵巢癌患者的基因表達和存活數(shù)據。使用Kaplan-Meier曲線和對數(shù)秩檢驗以及風險比的95%置信區(qū)間，分析了GMPS，PR，CD40和p21的高表達與低表達對卵巢癌患者的無復發(fā)生存期（RFS）影響。

三、統(tǒng)計學分析方法

使用SAS9.0軟件進行統(tǒng)計學分析。細胞克隆形成率均使用表示。兩樣本之間的差異性分析使用獨立樣本t檢驗。以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、 MOSE-Ⅰ和MOSE-Ⅱ細胞的表型

MOSE-Ⅰ和MOSE-Ⅱ細胞的表型不同。MOSE-Ⅰ細胞的早期細胞增長緩慢，而MOSE-Ⅱ的生長速率增加。形態(tài)學上，MOSE-Ⅰ細胞在倒置顯微鏡下開始失去上皮“鵝卵石”樣外觀（圖1a、b）。MOSE-Ⅱ失去上皮“鵝卵石”樣形態(tài)并轉變?yōu)殚g充質長梭形（圖1a、b）。在瓊脂實驗中，MOSE-Ⅱ細胞能夠在軟瓊脂中形成克隆，而MOSE-Ⅰ則不能（圖1c、b、d）。本研究還使用平板克隆形成實驗測定評估了MOSECs的增殖能力，并發(fā)現(xiàn)MOSE-Ⅱ形成的克隆比MOSE-Ⅰ細胞形成的更大（圖1f、g、h、i）。

二、對MOSE-Ⅰ和MOSE-Ⅱ細胞之間差異表達基因的分析

使用MOSE-Ⅰ和Ⅱ的細胞模型，并用Illumina HiSeq 2000 NGS平臺對DEGs進行了分析。在第5代（P5），P15和P25分別隨機選擇MOSE-Ⅰ細胞，而在P50，P70和P90分別選擇MOSE-Ⅱ細胞。其中，檢測和分析了14 218個基因。發(fā)現(xiàn)總共263個DEGs，其中包括的182個上調的和81個下調（圖2）。上調 DEGs的截點值是 log2 FC＞2和P＜ 0.05，而下調的 DEGs是 log2 FC ＜ -2，P＜ 0.05（表1）。

三、關于DEGs的GO，KEGG和PPI網絡的生物信息分析

GO分析表明這些DEGs在細胞生物學中形成了幾個重要分子功能，生物過程與細胞組分，如這些基因參與細胞增殖的正調節(jié)，RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉錄正調節(jié)和信號轉導（圖3b）。KEGG信號通路富集顯示這些DEGs形成的中樞基因富集在與卵巢癌相關的PI3K-Akt信號通路中（圖3a），上述特征都與卵巢癌發(fā)展正相關[16-18]。此外，這些DEGs形成的PPI網絡，如圖4所示。此網絡中有35個中樞節(jié)點基因其中包括27個上調基因和8個下調基因（表2）。

圖1 MOSE-I和MOSE-II細胞的特征

四、DEGs形成的核心基因的表達與卵巢癌患者的總體存活率的關聯(lián)性

本研究使用TCGA數(shù)據庫中數(shù)據將這些DEGs形成的中樞基因的表達與卵巢癌患者的OS和DFS相關聯(lián)。首先評估了來自263例浸潤性卵巢癌患者的182個組織樣本中，發(fā)現(xiàn)35個核心基因中有 4個（GMPS，PR，CD40和p21）基因在卵巢癌組織中的改變率超過10%（圖5a）。然后，繪制了Kaplan-Meier曲線，并進行了對數(shù)秩檢驗，將它們與患者的OS和DFS相關聯(lián)。本研究結果顯示GMPS，PR，CD40和p21 mRNA的異常表達與患者中較差的OS相關（圖5b），但與患者中的DFS無關（圖5c）。

實際上，這4個基因在卵巢癌與正常組織中均差異表達。GMPS在卵巢癌組織中高表達（圖6a），其與患者中RFS相關（圖6e）。相反，在卵巢癌組織中PR，CD40和p21 mRNA的表達降低（圖6b、c、d），這與不良的 RFS 相關（圖6f、g、h）。

討 論

本研究分析了惡變前的MOSE-Ⅰ和高度惡化的MOSE-Ⅱ細胞之間的DEGs，發(fā)現(xiàn)了182個上調的和81個下調的DEGs。生物信息學分析表明，這些DEGs能正調節(jié)細胞增殖，RNA聚合酶Ⅱ啟動子的基因轉錄和信號轉導，而KEGG通路數(shù)據顯示這些DEGs可能與癌癥中PI3K-Akt信號通路有關。此外，這些DEGs的PPI網絡分析確定了35個中樞基因（27個上調基因和8個下調基因），其中4個與卵巢癌患者的總體存活率相關。此外這4個基因在卵巢癌組織與正常組織中均差異表達。具體而言，GMPS在卵巢癌組織中高表達，其與RFS相關，而PR、CD40和p21 mRNA的在卵巢癌組織中的表達降低，這與RFS不良相關?？傊?，本研究分析并鑒定了4個DEGs，其可以預測卵巢癌患者的總體存活率和無復發(fā)存活率。然而本研究結果在臨床使用之前還需要進一步的前瞻性臨床研究驗證。

表1 MOSE-I和MOSE-II細胞之間的差異表達基因

圖2 使用火山圖表示所有差異表達基因（DEGs）

這種卵巢癌體外惡性轉化的細胞模型是用于鑒定基因改變和藥物效應測試的有用工具。在該系統(tǒng)中，體外培養(yǎng)的MOSECs可以自發(fā)地惡性轉化為卵巢癌細胞[10]。形態(tài)學上，MOSE-Ⅱ細胞失去了正常的上皮細胞“鵝卵石”特征，能夠形成軟瓊脂集落以及基因改變。當將MOSE-Ⅱ細胞注射到免疫缺陷動物的腹膜腔中時，在小鼠腹膜腔中形成腫瘤轉移和血性腹水[19-20]，這是典型的人晚期卵巢癌患者的表現(xiàn)[21]。2014年McCloskey等[10]發(fā)現(xiàn)，MOSE-Ⅱ的差異表達基因與人類高級別漿液性卵巢癌（human high-grade serous ovarian cancer，HGSC）腫瘤樣本及其卵巢癌細胞系的差異基因一致。免疫組化分析后的HGSC腫瘤組織證實MOSE-Ⅱ可作為HGSC的同源模型。MOSE-Ⅱ似乎比卵巢癌細胞系更具攻擊性，體外克隆形成效率增加，體內腫瘤發(fā)作更快[10]。因此，這種細胞模型可用于未來的卵巢癌預防和治療研究[22]。本研究使用該模型系統(tǒng)分析了MOSE-Ⅰ和MOSE-Ⅱ細胞之間的DEGs，構建PPI網絡分析確定35個中樞節(jié)點的其中9個基因參與PI3K-Akt信號通路。這證實了先前研究結論，表明PI3K-Akt為卵巢癌的潛在治療靶點[17]。PIK3CA突變或在高達30%的卵巢癌患者中擴增，而PTEN在40%的患者中表達喪失[16,23]。此外，這35個中樞基因中的6個是Rap1信號通路的一部分，之前的一項研究報道它們與漿液性卵巢癌轉移相關[24]。

表2 在所有差異基因中，點度中心值大于5的核心基因

此外，GO分析顯示這些DEGs參與正向調控細胞增殖，這是癌癥六個基本標志之一：生長信號的自給自足[25]。實際上，細胞增殖的正向調節(jié)是癌癥發(fā)生和發(fā)展的基礎。在當前研究中鑒定出的每一種生物學途徑都可以促進或將正常細胞轉化為癌細胞[26]。本研究確定了4個基因特征來預測卵巢癌患者的總體存活率。GMPS是鳥苷5'-單磷酸合酶，是將黃嘌呤核苷一磷酸轉化為鳥苷一磷酸的酶。因此，GMPS在正常細胞增殖和腫瘤發(fā)生中重要的核苷酸生物合成酶。Reddy的數(shù)據顯示，TRIM21與USP7會聯(lián)合GMPS形成了一種分子級聯(lián)反應，可控制DNA損傷或核苷酸缺失時p53的穩(wěn)定性。因此，GMPS是一種促進細胞生長和DNA復制的經典生物合成酶，也是p53限制細胞增殖的關鍵[27]。我們發(fā)現(xiàn)與非腫瘤組織相比，GMPS在卵巢癌組織中高表達，并且GMPS表達與患者的RFS相關尚未有相關文獻報道。GMPS是肝癌細胞中重要的p53抑制靶點[28]，這進一步表明了GMPS在腫瘤發(fā)生中的重要性。PR作為核受體，其功能是調節(jié)激素響應組織的發(fā)育和循環(huán)，例如乳腺和生殖道。之前的研究表明PR表達作為預測子宮內膜樣和高級別漿液性卵巢癌預后較好的生物標志物[29-32]，它會在卵巢癌的晚期缺失表達[33]。實際上，本研究也證實了以前的數(shù)據：孕酮和孕激素對卵巢癌的發(fā)生具有保護作用，PR的表達是卵巢癌患者無進展生存期延長有利的預后標志物[34-36]。CD40是跨膜糖蛋白和腫瘤壞死因子受體超家族的成員，其可介導多種免疫和炎癥反應[37]。CD40經常在不同的免疫細胞、內皮細胞和上皮細胞中表達。CD40與CD40配體的結合會出現(xiàn)在人體的各種生理和病理過程[37-38]。CD40配體增強了上皮卵巢癌細胞對順鉑治療的敏感性[39]。CD40在卵巢癌細胞系和腫瘤樣品中高表達，但在正常卵巢組織中不表達[40]。本研究中，與MOSE-Ⅰ細胞相比，MOSE-Ⅱ細胞中CD40表達升高；然而，卵巢癌組織中CD40表達降低，這與先前研究的結果相反[40]。因此，需要進一步研究以確定這種差異的原因。p21也稱為CDKN1A是細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A，其功能是通過抑制Cdks調節(jié)的細胞生長停滯，這是細胞周期從G1期轉變?yōu)镾期的關鍵[41]。通過與增殖細胞核抗原（PCNA）的相互作用，p21能夠抑制DNA復制[18]。p21在正常組織中高表達，但在卵巢癌組織中減少，這與患者的更好的存活率相關，與先前的研究一致[42]。實際上，之前的研究表明吡啶衍生物誘導的卵巢癌細胞衰老是通過p21激活而發(fā)生的[43]。然而，其他研究報道CDKN1A/p21表達促進乳腺癌并介導其耐藥性[44-45]。臨床研究表明。p21高表達與胃癌和食管癌預后不良有關[46-47]。因此，需要進一步研究以澄清這種差異。

圖3 DEGs形成的中樞基因的功能和通路富集分析

圖4 差異表達基因形成的蛋白質-蛋白質相互作用網絡

圖5 前四個核心基因的鑒定與卵巢癌患者的存活率的關聯(lián)性

圖6 GMPS，PR，CD40和p21在卵巢癌和正常組織之間的差異表達以及與卵巢癌患者的無復發(fā)存活率的關系

當然，本研究確實存在一些局限性。例如，只是描述了卵巢癌中差異表達的基因，并將它們與卵巢癌的預后相關聯(lián)，進行了生物信息學分析，將其中四種基因與卵巢癌進展聯(lián)系起來；在對卵巢癌發(fā)生和進展中的生物學功能和作用還沒有更多的研究。此外，在臨床應用之前，還需要對卵巢癌中的這些DEGs進行進一步的驗證。