潘烽平 陳一鵬 李彥 張明明

結(jié)直腸癌是全球范圍內(nèi)高發(fā)病率和高死亡率的惡性腫瘤之一[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化在結(jié)直腸癌發(fā)病機制中具有十分重要的作用，其中抑癌基因甲基化是近年來腫瘤表觀遺傳研究的熱點[3]。HOXA11是一個受表觀遺傳調(diào)控而表達丟失的基因，異常甲基化導致HOXA11基因表達下調(diào)，影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后。研究證實，在卵巢癌中HOXA11基因啟動子CpG島異常甲基化是其不良預后的一個獨立危險因素[4]。在惡性膠質(zhì)瘤中，HOXA11的異常低表達與放化療抵抗密切相關(guān)并且影響患者的生存預后[5]。然而，HOXA11在結(jié)直腸癌中是否存在異常甲基化，HOXA11的異常甲基化是否參與調(diào)控腫瘤細胞的生物學行為目前尚未見于研究報道。本研究以結(jié)直腸癌為研究對象，探討HOXA11在結(jié)直腸癌中的表達水平以及甲基化程度，以及HOXA11啟動子區(qū)異常甲基化與患者臨床病理特征間的相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 組織標本 89對結(jié)直腸癌組織及配對的正常腸黏膜組織標本取自于2016年8月至2018年10月在嘉興市第一醫(yī)院（55例）和浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院普外科（34例）接受結(jié)直腸癌根治術(shù)的患者。所有患者術(shù)前均未接受放化療，結(jié)直腸癌組織及配對的正常腸黏膜組織均經(jīng)過病理學檢查證實。此外，組織標本的使用均獲得患者本人或其家屬的同意，并簽署書面同意書。

1.2 細胞培養(yǎng) 本研究選用的6種結(jié)直腸癌細胞系（HT29、SW480、HCT116、SW620、LoVo 和 SW1116）均購予上?？茖W院細胞庫。細胞采用含有10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3 主要試劑和儀器 CpGenome Universal DNA Modification kit、5-Aza-dC均購于美國Sigma-aldrich公司（批號：S7822、A3656）；Trizol試劑購于美國 Invitrogen公司（批號：15596018）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒為日本TaKaRa公司產(chǎn)品（批號：RR047A）；SYBR Green PCR Master Mix試劑盒購于日本Toyobo公司（批號：QPK-201）。ABI 7900測序儀購于美國ABI公司。

1.4 甲基化特異性聚合酶鏈反應（methylation-specific PCR，MSP）檢測 HOXA11甲基化狀態(tài)采用酚-氯仿法抽提100mg結(jié)直腸癌和配對正常腸黏膜組織標本中的DNA，并以 CpGenome Universal DNA Modification kit試劑盒修飾DNA。甲基化引物（HOXA11-M）和非甲基化引物（HOXA11-U）分別用于擴增HOXA11基因5'CpG島甲基化和非甲基化的等位基因，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。HOXA11-U引物序列為：5′-TGTGTGTGAAGTGATTTTTAGAGAGTAT-3′（正 義鏈），5′-AACAATCTCTATACACAAACTCCTCCA-3′（反義鏈）；HOXA11-M 引物序列為：5′-TGCGCGAAGTGATTTTTAGAGAGTAC-3′（正 義 鏈），5′-CAATCTCTATACACGAACTCCTCCG-3′（反義鏈）。MSP反應條件如下：95℃預變性 5min，95℃變性 30s，63℃退火 30s，72℃延伸 45s，共 35個循環(huán)，最后 72℃延伸 5min，4℃終止反應。最后將反應產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳，電泳凝膠呈像系統(tǒng)照相并分析結(jié)果。

1.5 實時熒光定量PCR（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測 HOXA11 mRNA表達水平將6種結(jié)直腸癌細胞系細胞置于5-Aza-dC終濃度為20μmol/L的培養(yǎng)液中培養(yǎng)96h，行去甲基化處理。處理前后分別收集細胞，采用Trizol試劑抽提各組細胞和正常腸黏膜組織中的總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作流程反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，HOXA11上游引物：5'-GCAGCAGAGGAGAAAGAGGG-3′，下游引物：5'-GTGGATTTGCTGAGTAGTACTG；GAPDH 上游引物：5''-CCCATCACCATCTTCCAGGAG-3′，下游引物：5'-CTTCTCCATGGTGGTGAAGACG-3′。采用 ABI 7900測序儀進行qRT-PCR，反應條件如下：95℃預變性1min，95℃反應 10s，59℃反應 30s，共 50 個循環(huán)。每組設(shè)置3個復孔，獨立重復3次，獲得CT值。ΔCT為同一標本目的基因（HOXA11）與內(nèi)參基因（GAPDH）CT值之差，即 ΔCT=CT（HOXA11）－CT（GAPDH），ΔΔCT=ΔCT（各組結(jié)直腸癌細胞）-ΔCT（正常腸黏膜組織）的差值，HOXA11 的相對表達量以 2－ΔΔCT表示。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗；組間頻數(shù)比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HOXA11在結(jié)直腸癌中呈異常甲基化狀態(tài) 采用MSP技術(shù)檢測結(jié)直腸癌和配對正常腸黏膜組織中HOXA11基因啟動子CpG島的甲基化情況，擴增結(jié)果見圖1。89例結(jié)直腸癌患者中共67例癌組織標本存在甲基化（75.3%），而正常腸黏膜組織中僅14例存在甲基化（15.7%）。上述實驗結(jié)果表明，結(jié)直腸癌組織中HOXA11基因甲基化率顯著高于正常腸黏膜組織（P＜0.01）。

圖1 MSP檢測結(jié)直腸癌組織及配對正常腸黏膜組織中HOXA11啟動子甲基化狀態(tài)（T：結(jié)直腸癌組織；N：正常腸黏膜組織；M：甲基化；U：非甲基化）

2.2 HOXA11基因啟動子甲基化狀態(tài)與其mRNA表達量的關(guān)系 發(fā)生甲基化的結(jié)直腸癌組織中HOXA11 mRNA的相對表達量明顯低于較未發(fā)生甲基化的結(jié)直腸癌組織（P＜0.01），見圖 2。

2.3 HOXA11基因啟動子甲基化與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系 結(jié)直腸癌組織中HOXA11基因啟動子的甲基化狀態(tài)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＜0.01）及TMN分期（P＜0.01）密切相關(guān)，而與患者的年齡、性別、組織分化、浸潤深度無關(guān)（均P＞0.05），見表1。

圖2 結(jié)直腸癌組織中HOXA11甲基化狀態(tài)與其mRNA表達水平的關(guān)系（**P＜0.01）

表1 HOXA11基因啟動子甲基化與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系

2.4 結(jié)直腸癌細胞系HOXA11基因啟動子甲基化情況MSP結(jié)果顯示，所有結(jié)直腸癌細胞系中HOXA11啟動子均呈高甲基化狀態(tài)。使用20μmol/L甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-dC處理細胞96h后，HOXA11 mRNA相對表達量均較無5-Aza-dC處理組顯著升高（P＜0.05），見圖3。

3 討論

圖3 5-Aza-dC處理結(jié)直腸癌細胞系后HOXA11 mRNA表達水平（*P＜0.05，**P＜0.01）

腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是在多種致癌因素作用下，多基因參與、多步驟發(fā)生的過程，主要涉及癌基因的激活和抑癌基因的失活。DNA甲基化異常，特別是癌基因的低甲基化和抑癌基因的高甲基化，是腫瘤發(fā)生的重要機制之一[6]，其中抑癌基因通常由于過度甲基化，導致表觀遺傳學改變，從而抑制基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達，參與惡性腫瘤的進展[7]。結(jié)直腸癌中廣泛存在抑癌基因異常甲基化，目前研究認為，部分腫瘤相關(guān)基因甲基化是結(jié)直腸癌早期診斷及靶向治療的生物標志[8]。因此，深入研究結(jié)直腸癌中的DNA甲基化對于腫瘤診斷和治療具有至關(guān)重要的意義。

同源框基因（homeobox genes，HOX）主要包括 A、B、C、D四個基因簇，是一類在進化上高度保守的基因，主要參與調(diào)控胚胎發(fā)育和細胞分化。近期研究表明，HOX基因表達異常與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[9-10]。HOXA11是HOX基因家族中的一員，位于染色體7p。最新研究結(jié)果表明，卵巢癌[4]、膠質(zhì)瘤[11]、乳腺癌[12]、腎癌[13]、肺癌[14-15]和胃癌[16-17]普遍存在HOXA11異常甲基化，抑制HOXA11基因的表達，促進腫瘤的發(fā)展。

為闡明HOXA11在結(jié)直腸癌組織中的甲基化水平及其與患者臨床病理特征間的關(guān)系，本研究采用MSP法對結(jié)直腸癌組織及配對正常腸黏膜組織中HOXA11基因甲基化狀態(tài)進行檢測。結(jié)果表明，與正常腸黏膜比較，HOXA11基因在結(jié)直腸癌組織中普遍存在異常甲基化。除此之外，結(jié)直腸癌組織中異常甲基化與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期密切相關(guān)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生甲基化的結(jié)直腸癌組織中HOXA11 mRNA表達水平顯著低于未甲基化的結(jié)直腸癌組織。基因的異常甲基化會導致基因的表達沉默，筆者推測，HOXA11基因異常甲基化可能是導致HOXA11基因低表達的重要原因之一。為進一步驗證推測，體外實驗中使用了甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-dC，降低細胞的甲基化水平，結(jié)果提示5-AzadC作用后，6種HOXA11異常甲基化的結(jié)直腸癌細胞系中HOXA11 mRNA的表達水平顯著增高，與推測一致。由此可以得出，結(jié)直腸癌組織中HOXA11基因異常甲基化抑制了HOXA11基因的轉(zhuǎn)錄和表達，促進腫瘤的發(fā)展。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組織中HOXA11基因普遍存在異常甲基化，抑制其轉(zhuǎn)錄表達。結(jié)直腸癌中HOXA11基因啟動子區(qū)異常甲基化是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期的危險性因素。通過本研究，筆者預測HOXA11基因甲基化檢測可能是結(jié)直腸癌早期篩查及精準治療的潛在生物標志物。