趙玨 孫娟 袁武鋒 李麗潔

出生缺陷指胎兒出生前已經(jīng)存在的結(jié)構(gòu)或功能異常，其產(chǎn)生原因包括遺傳、環(huán)境及兩者共同作用。據(jù)統(tǒng)計，由遺傳因素為主所致的出生缺陷占比約為20%～30%，由環(huán)境因素（如母體疾病、營養(yǎng)不良、感染、藥物等）所致的出生缺陷占比約10%，剩余的出生缺陷多是遺傳和環(huán)境共同作用的結(jié)果，故超過80%的出生缺陷與遺傳因素直接或間接相關(guān)[1]。隨著我國經(jīng)濟的快速發(fā)展，醫(yī)療衛(wèi)生水平的不斷提高，人們對優(yōu)生優(yōu)育日益重視，感染、藥物使用不當(dāng)、營養(yǎng)不良等導(dǎo)致的胎兒發(fā)育異常比例下降，而遺傳因素引起的出生缺陷檢出率升高[2]。染色體病是導(dǎo)致出生缺陷的最常見原因之一，約0.5%新生兒患有染色體病[3]。染色體病目前尚無有效的治療方法，唯一可行的預(yù)防手段是及時進行產(chǎn)前診斷，防止嚴重的出生缺陷。故為了減輕患者、家庭及社會的經(jīng)濟和精神負擔(dān)，應(yīng)爭取對有指征的孕婦行產(chǎn)前診斷，必要時及時終止妊娠。

細胞染色體核型分析是目前公認的產(chǎn)前診斷的“金標準”，羊膜腔穿刺術(shù)是現(xiàn)今產(chǎn)前診斷最常用且最安全的取材方法。本文回顧性分析有產(chǎn)前診斷指征，即高齡、血清學(xué)篩查異常、無創(chuàng)性產(chǎn)前檢查（non-invasive prenatal testing，NIPT）高風(fēng)險、超聲檢查異常、既往生育過缺陷兒、父母一方患有先天性或遺傳性疾病或有遺傳病家族史等的448例孕婦羊膜腔穿刺羊水細胞的染色體核型結(jié)果，以及根據(jù)不同穿刺指征選用的分子生物學(xué)技術(shù)，如染色體微陣列分析（chromosomal microarray analysis，CMA）750K基因組芯片、基于微陣列的比較基因組雜交（array-based comparative genomic hybridization，aCGH）及衍生技術(shù) CGX 寡陣（CGX Oligo arrays）8×60K和細菌人工染色體微珠（bacterial artificial chromosome on beads BAC-on-Beads，BoBs）技術(shù)獲得的結(jié)果，探討羊水細胞染色體異常核型與產(chǎn)前診斷指征的關(guān)系，比較不同產(chǎn)前診斷指征的染色體異常檢出率，以及不同的遺傳學(xué)檢測技術(shù)在臨床的應(yīng)用價值，為產(chǎn)前遺傳咨詢提供客觀的實驗數(shù)據(jù)和臨床參考資料。

1 對象和方法

1.1 對象 2016年11月至2018年11月在我院產(chǎn)前診斷中心接受羊膜腔穿刺產(chǎn)前診斷的妊娠婦女共448例，年齡20～46歲，孕周17～26周。其中瘢痕子宮87例，年齡≥35歲的高齡孕婦163例。將高齡組按年齡分為3組，A組年齡≥35歲，但＜38歲，共57例；B組年齡≥38歲，但＜40歲，共45例；C組年齡≥40歲，共61例。對具有以下至少1項產(chǎn)前診斷指征的孕婦，在知情同意后行超聲引導(dǎo)下羊膜腔穿刺術(shù)，行產(chǎn)前診斷。侵入性產(chǎn)前診斷的指征為：（1）妊娠年齡≥35歲；（2）孕婦血清學(xué)篩查高風(fēng)險；（3）NIPT篩查高風(fēng)險；（4）胎兒超聲篩查異常：結(jié)構(gòu)異常、可疑畸形、2個及以上軟指標異常、頸項透明層（nuchal translucency，NT）厚度≥3mm等；（5）既往生育過缺陷嬰兒；（6）父母一方患有先天性或遺傳性疾病，或有遺傳病家族史；（7）其他高度懷疑染色體異常的情況。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 簽署相關(guān)知情同意書，完善術(shù)前檢查后，所有孕婦接受B超引導(dǎo)下經(jīng)腹羊膜腔穿刺術(shù)，抽取羊水25～30ml，其中20ml用于染色體核型分析，另5～10ml根據(jù)穿刺指征及患者的知情選擇，選擇產(chǎn)前BoBs、CGX 8×60k或CMA-750k等檢測。

1.2.2 胎兒染色體核型分析 將20ml羊水分裝至2支15ml離心管，1 200r/min離心后，棄去上清液，沉淀中加入廣州白云山拜迪生物醫(yī)藥有限公司的羊水細胞培養(yǎng)基（批號：20160902-20180502）4ml/瓶，接種 2 瓶，5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)6d后觀察細胞生長，有多個細胞集落生長即換液，每天觀察，視細胞生長情況擇機收獲。以胰蛋白酶消化法制片，Giemsa染色后G顯帶，按人類細胞遺傳學(xué)命名國際體系（ISCN，2005）描述異常核型。核型分析：每例取材需來自2個不同培養(yǎng)瓶，每瓶計數(shù)10～15個分裂相，采集3～5個核型圖，嵌合體計數(shù)適當(dāng)增加，計算異常細胞比例。

1.2.3 產(chǎn)前BoBs及CGX 8×60k檢測 由蘇州Perkin Elmer醫(yī)學(xué)檢驗所完成，7～12個工作日出報告。

1.2.4 CMA-750k檢測 由浙江博圣生物負責(zé)完成，15個工作日出報告。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料以例數(shù)和百分率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 羊膜腔穿刺結(jié)果分析 448份羊水細胞中，檢出異常核型38例，檢出率8.48%，以高齡為穿刺指征的163例，與其他穿刺指征比，受檢人數(shù)占比最高，達36.38%，但異常核型檢出率只有9.82%；以血清學(xué)篩查21-三體高風(fēng)險為穿刺指征的127例，受檢人數(shù)占比28.35%，異常核型檢出率3.94%；以超聲篩查異常為穿刺指征的78例，只占受檢人數(shù)的17.41%，但異常核型檢出率有11.54%，見表1。某些孕婦合并有多個羊膜腔穿刺指征，在統(tǒng)計歸類時造成了一定困擾，為避免重復(fù)計數(shù)，將合并有多個產(chǎn)前診斷指征的歸類到最常用（高齡）或風(fēng)險值相對較高的穿刺指征（如超聲篩查異常）組，高齡合并超聲篩查異常的，若超聲提示為結(jié)構(gòu)異?；蚧?，歸為超聲組，若僅為多個軟指標異常，則歸入高齡組。

表1 羊膜腔穿刺結(jié)果分析

2.2 胎兒染色體異常核型分析 448例孕婦羊膜腔穿刺均成功，無一例出現(xiàn)流產(chǎn)、羊水滲漏、感染等并發(fā)癥而導(dǎo)致不良后果。羊水細胞培養(yǎng)成功率為99.78%（447/448），共檢出異常核型38例，包括染色體數(shù)目異常24例、結(jié)構(gòu)異常12例和2例多態(tài)變異；其中21-三體8例，占異常核型比例21.05%；18-三體6例，占15.79%，21-三體和18-三體中均有1例為嵌合體。異常核型對應(yīng)的穿刺指征中高齡和超聲篩查異常占比最高。因唐氏篩查21-三體高風(fēng)險行產(chǎn)前診斷的發(fā)現(xiàn)核型異常5例，但其中核型確診為21-三體的只有2例，其余3例分別為21號和13號染色體平衡易位，47，XXX和46，XN，dup（9）（q12），唐氏篩查 18-三體高風(fēng)險也存在同樣情況，見表2。

2.3 核型分析與分子生物技術(shù)檢測結(jié)果分析 核型分析與分子生物技術(shù)檢測結(jié)果分析見圖1。核型或分子生物技術(shù)檢測出異常的近三分之一伴有超聲異常發(fā)現(xiàn)。15例染色體核型分析異常，但未被當(dāng)時同步進行的BOBs或CGX檢測所檢出。5例臂間倒位，其中4例發(fā)生在9號染色體，且有 3 例為 46，XN，inv（9）（p11q13）；3 例臂內(nèi)片段復(fù)制，也均出現(xiàn)在9號染色體，且有2例為46，XN，dup（9）（q12）；1 例羅氏易位；1 例平衡易位；1 例臂內(nèi)倒位；1例低比例的三倍體嵌合體；1例46，XN，1qh+，1號染色體長臂異染色質(zhì)區(qū)增加；1例47，XN，+mar；1 例 46，XN，22ps+，一條 22 號染色體隨體偏大，B超提示消化道閉鎖可能。另有1例因胎兒水腫伴頸部水囊瘤形成行羊水細胞核型+CGX檢測，核型結(jié)果為46，X，+mar，分裂相少，CGX 檢測結(jié)果為 45，X。1例因 21三體高風(fēng)險行羊水穿刺，BoBs提示17p11.2區(qū)域缺失，為Smith-Magenis綜合征，但核型提示正常。

2.4 不同遺傳學(xué)檢測方法檢出率比較 所有的羊膜腔穿刺均行羊水細胞培養(yǎng)染色體核型分析，告知患者各遺傳學(xué)檢測方法檢測范圍及局限性，若單純因高齡或血清學(xué)篩查高風(fēng)險行產(chǎn)前診斷的一般選擇同步行產(chǎn)前BoBs檢測（患者選擇CGX檢測的例外）；合并有超聲篩查異常的或合并有兩個及以上產(chǎn)前診斷指征的，2017年均選擇同步行CGX8×60k檢測，2018年選擇同步行CMA-750K檢測。不同遺傳學(xué)檢測方法染色體異常檢出率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.154，P=0.245），進一步兩兩比較，各方法間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見表3。2.5 高齡組不同年齡段染色體核型檢測結(jié)果比較 高齡組不同年齡段間染色體異常檢出率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.674，P=0.124）。進一步兩兩比較時，A 組染色體異常檢出率低于C組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=3.927，P=0.049），其余各組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見表 4。

表2 胎兒染色體異常核型分析

圖1 核型及分子生物技術(shù)檢測異常數(shù)據(jù)統(tǒng)計

表3 多種遺傳學(xué)檢測方法檢出率比較

3 討論

染色體異常是目前仍無法治療的先天性疾病，經(jīng)過羊水細胞培養(yǎng)獲得胎兒染色體核型的準確性可達99%[4]。高質(zhì)量的羊水細胞培養(yǎng)及收獲技術(shù)是進行羊水染色體分析診斷的關(guān)鍵[5]。本研究448例患者中，87例為瘢痕子宮，穿刺過程均順利，無不良后果產(chǎn)生。某些學(xué)者對于瘢痕子宮是否能進行侵入性產(chǎn)前診斷持謹慎態(tài)度，根據(jù)本研究結(jié)果，認為瘢痕子宮并非羊膜腔穿刺禁忌證。羊水細胞培養(yǎng)成功率為99.78%，發(fā)現(xiàn)38例染色體異常，檢出率為8.48%，高于相關(guān)文獻報道結(jié)果1%～6.7%[6-7]。究其原因，可能與以下幾方面相關(guān)：本研究將2例染色體多態(tài)性歸結(jié)為染色體異常；羊膜腔穿刺指征的嚴格把關(guān)；隨著2016年初“全面二孩”政策的開放，40歲以上孕婦進行羊水穿刺的比例增加。

表4 高齡組各年齡段異常核型檢出率的比較

高齡妊娠是最早被提出的羊膜腔穿刺適應(yīng)證。本研究中，高齡孕婦組胎兒異常核型的檢出率為9.82%，高于國內(nèi)外文獻報道[8-9]，與近2年進行羊膜腔穿刺的40歲以上孕婦所占比例明顯增多有關(guān)。眾所周知孕婦年齡越高，發(fā)生胎兒染色體異常的風(fēng)險越大。另外，本研究將合并多個羊膜腔穿刺指征，比如高齡合并超聲軟指標異常、高齡合并NIPT高風(fēng)險等都歸為了高齡組。近年國內(nèi)專家對于單純高齡孕婦（≥35歲）進行產(chǎn)前診斷存在異議，有專家推薦以NIPT來替代有創(chuàng)產(chǎn)前診斷[10]。但根據(jù)本研究結(jié)果，高齡孕婦的染色體異常不僅僅是非整倍體異常，常常涉及染色體結(jié)構(gòu)異常，這是目前NIPT檢測無法篩查的。有文獻佐證，高齡孕婦隨著年齡的增加，胎兒發(fā)生非篩查目標疾病的概率顯著增加[11]。且本研究以高齡為單一穿刺指征發(fā)現(xiàn)的染色體異常核型9例，占發(fā)現(xiàn)的異常核型比例23.68%，故應(yīng)重視高齡孕婦的產(chǎn)前咨詢，并建議行產(chǎn)前診斷，以減少出生缺陷兒。但隨高齡孕婦的增多，對于35歲以上的高齡孕婦，是否根據(jù)年齡分層，采用不同的產(chǎn)前診斷策略，以盡可能避免侵入性操作造成的不良結(jié)果，改善孕婦體驗也是值得探討的問題。加拿大和英國等國家將單胎妊娠直接羊膜腔穿刺的最低年齡提高至40歲[12]。國內(nèi)有報道在高齡孕婦中，年齡38歲以上異常核型陽性率顯著升高[13]。本研究將高齡孕婦根據(jù)年齡分為3組，統(tǒng)計結(jié)果發(fā)現(xiàn)，≥40歲的C組孕婦與≥35歲而＜38歲的A組異常核型檢出率存在統(tǒng)計學(xué)差異，與≥38歲而＜40歲的B組無統(tǒng)計學(xué)差異。雖樣本量少，但與國內(nèi)文獻報道結(jié)果基本一致。國內(nèi)還有文獻報道，同時采用孕中期血清學(xué)篩查可以將高齡孕婦羊膜腔穿刺率降低79.9%[14]。2007年美國婦產(chǎn)科醫(yī)師學(xué)會（American College of Obstetricians and Gynecologists，ACOG）提出不論孕婦年齡大小均進行產(chǎn)前篩查；高齡孕婦通過產(chǎn)前篩查進行胎兒異常風(fēng)險分層，可以大大減少不必要的有創(chuàng)產(chǎn)前診斷。這些研究為不同年齡的高齡妊娠采用不同的產(chǎn)前診斷策略提供了參考。

血清學(xué)篩查受到多因素影響，假陽性率較高，本研究統(tǒng)計結(jié)果21-三體高風(fēng)險組異常核型檢出率為3.94%，18-三體高風(fēng)險組異常核型檢出率為5.41%，血清學(xué)篩查高風(fēng)險總的檢出率為4.27%，均以血清學(xué)篩查高風(fēng)險作為單一穿刺指征。NIPT是否可以取代產(chǎn)前血清學(xué)篩查也是近年的熱點議題。加拿大婦產(chǎn)科協(xié)會（Society of Obstetricians and Gynaecologists of Canada，SOGC）以及ACOG專家意見指出：血清學(xué)的產(chǎn)前篩查不僅針對21、18-三體、開放性神經(jīng)管畸形，同時還可篩查其它染色體異常，高風(fēng)險孕婦的胎兒即使染色體正常，但不良妊娠結(jié)局風(fēng)險增高[15-16]。從本研究顯示，血清學(xué)篩查高風(fēng)險通過產(chǎn)前診斷確認的7例染色體異常中非整倍體異常為4例，結(jié)構(gòu)異常為3例，說明血清學(xué)篩查不僅僅局限于染色體非整倍體的篩查[17]，還可篩查其他異常，這是NIPT目前無法完全替代的。故本文認為血清學(xué)篩查高風(fēng)險仍應(yīng)作為獨立的羊膜腔穿刺產(chǎn)前診斷指征。目前國內(nèi)有些醫(yī)院在孕婦知情選擇下使用NIPT對血清學(xué)篩查高風(fēng)險孕婦先行檢測，再根據(jù)檢測結(jié)果決定下一步檢測方案。綜上，此方法存在一定風(fēng)險，需引起臨床醫(yī)師警惕。

針對超聲提示異常胎兒，染色體核型分析可檢出9%～19%的異常[18]，胎兒有結(jié)構(gòu)畸形的染色體異常核型檢出率常常更高[19]。作為穿刺指征，本研究將超聲檢查發(fā)現(xiàn)的胎兒結(jié)構(gòu)畸形和軟指標異常（2個及以上）均歸為超聲異常。本研究78例因胎兒超聲檢查異常而進行羊膜腔穿刺的患者中，檢出染色體異常核型9例，染色體異常核型發(fā)生率達11.54%，與相關(guān)文獻報道相符。孤立的超聲軟指標是否應(yīng)作為侵入性產(chǎn)前診斷指征尚存在爭議。本院選擇根據(jù)該指標的嚴重程度結(jié)合病史、年齡、NT、早中期唐氏篩查結(jié)果、患者本人意愿等綜合評估風(fēng)險，有選擇地進行侵入性產(chǎn)前診斷，盡量減少漏診及價值不大的侵入性產(chǎn)前診斷。

分子遺傳學(xué)診斷技術(shù)與染色體G顯帶分析技術(shù)相比，各有長短，可為互補。染色體核型分析在可及的分辨率內(nèi)，可以發(fā)現(xiàn)所有染色體的數(shù)目與結(jié)構(gòu)異常，獲得的信息是全息的，但羊水細胞培養(yǎng)、染色體標本制備、核型分析等檢測費時長、人力耗費大；此外，該技術(shù)不能檢測單基因突變，也無法檢測染色體微小片段增減導(dǎo)致的微缺失微重復(fù)綜合征。熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）、BoBs等在內(nèi)的快速產(chǎn)前診斷技術(shù)，提高了診斷的分辨率、縮短了檢查時間，檢測效率高，但只能對試劑盒設(shè)定的目標疾病進行檢測，無法對染色體組的異常作全局分析。CMA技術(shù)能夠在全基因組水平進行掃描，可檢測染色體拷貝數(shù)變異（copy number variants，CNV），在檢出染色體微小片段的缺失和重復(fù)中相比核型分析具有突出優(yōu)勢，但因為數(shù)據(jù)庫的不同或完整性尚欠缺，臨床意義不明的變異比例也較高，對臨床醫(yī)師解讀報告和臨床遺傳咨詢造成了一定的困擾。在本研究中CMA技術(shù)的異常檢出率高于傳統(tǒng)G顯帶分析技術(shù)，但其檢出率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能與樣本量較小及選用CMA時的穿刺指征不同等有關(guān)。

羊膜腔穿刺術(shù)是相對安全、穩(wěn)定的，可被廣泛應(yīng)用于產(chǎn)前診斷的一門技術(shù)。應(yīng)重視產(chǎn)前診斷中心的咨詢工作，高齡孕婦及血清學(xué)篩查高風(fēng)險都有進行產(chǎn)前診斷的必要性，尤其對伴有超聲檢查異常者，建議其行產(chǎn)前診斷；高齡孕婦可根據(jù)年齡進行風(fēng)險再分層，采取不同的產(chǎn)前診斷策略，≥40歲的高齡孕婦不主張使用NIPT來替代產(chǎn)前診斷。胎兒染色體核型分析仍是金標準，但分子生物檢測技術(shù)可作為產(chǎn)前診斷有力的補充。